Extracto
Ets-1 es una transcripción factor que regula muchos genes implicados en la progresión del cáncer y en la invasión tumoral. Es un marcador de mal pronóstico del cáncer de mama, pulmón, colorrectal y los carcinomas de ovario. Aquí, hemos identificado poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) como una nueva pareja de interacción de Ets-1. Se demuestra que Ets-1 se activa, por la interacción directa, la actividad catalítica de PARP-1 y es entonces poli (ADP-ribosyl) ATED de una manera DNA-independiente. La inhibición catalítica de PARP-1 mejoró Ets-1 actividad transcripcional y provocó su acumulación masiva en el núcleo celular. Ets-1 de expresión se correlaciona con un aumento en el daño del ADN cuando PARP-1 se inhibió, lo que lleva a la muerte celular de cáncer. Por otra parte, los inhibidores de PARP-1 causó solamente Ets-1-células que expresan la acumulación de daño del ADN. Estos resultados proporcionan una nueva visión de la regulación Ets-1 en las células cancerosas y su vínculo con las proteínas de reparación del ADN. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que los inhibidores de PARP-1 serían útiles en una nueva estrategia terapéutica que se dirige específicamente a Ets-1-expresando tumores
Visto:. Legrand AJ, Choul Li-S, Spriet C, T Idziorek, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) el nivel de Ets-1 está regulada por la proteína poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) en las células cancerosas para evitar daños en el ADN. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10.1371 /journal.pone.0055883
Editor: Rajesh Mohanraj, Universidad UAE, Emiratos Árabes Unidos
Recibido: 25 de Septiembre, 2012; Aceptó 3 de enero de 2013; Publicado: 6 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Legrand et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS) y por subvenciones de la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. El Ministère de la Recherche et de la Enseñanza Superior y la Fundación ARCO para la Investigación sobre el Cáncer proporcionó una beca de doctorado para Arnaud J. Legrand. El CNRS y el Conseil Régional du Nord-Pas-de-Calais proporcionado una beca de doctorado (BDI) para Souhaila Choul-li. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Ets-1 es el miembro fundador de la familia de factores de transcripción denominados ETS. Esta familia se caracteriza por un dominio de unión a ADN bien conservado (DBD)
5 que reconoce elementos específicos de ADN, llamados sitios de unión ETS-(EBS), que se encuentran en los promotores de los genes diana. Ets-1 se expresa principalmente en tejidos embrionarios. Está implicado en procesos fisiológicos tales como la proliferación, la diferenciación, la migración, la invasión y la apoptosis [1] - [6]. Ets-1 de expresión está estrechamente regulada en tejidos adultos y su sobreexpresión se relaciona a menudo con enfermedades invasivas, como la artritis reumatoide, glomerulonefritis y muchos tipos de cáncer [7] - [9]. La expresión patológica de Ets-1 es en parte responsable de la proliferación e invasión de células tumorales habilidades. Esta invasión se debe a genes que son controlados por Ets-1 y que las proteasas codificar, incluyendo la matriz de metaloproteasas de la colagenasa-1 y estromelisina-1, o el activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA). Por lo tanto, Ets-1 se considera actualmente como un marcador de mal pronóstico en varios tipos de cáncer [10] - [13].
Por otra parte, a pesar del hecho de que todos los miembros de la familia ETS comparten el mismo DBD, Ets-1 tiene sus propias propiedades de fijación de DNA que están estrechamente controlados para asegurar una acción biológica específica. Ets-1 inhibe su propio ADN de unión debido a la presencia de dos dominios inhibidores que flanquean su DBD [14]. Ets-1 tiene que interactuar con los socios para contrarrestar esta auto-inhibición y se unen a los promotores de sus genes diana [15]. En algunos promotores, tales como las que se encuentran en el
MMP 3 gratis (estromelisina-1) y
TP53
genes, dos moléculas de Ets-1 se unen a dos EBS capicúa separados por 4 pb [16] - [18]. En todos los casos, las interacciones proteína-proteína parecen ser la piedra angular de la regulación de Ets-1.
Además, Ets-1 está también estrechamente controlada por modificaciones posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación, ubiquitinación y Sumoylation [7], [19]. Sin embargo, Ets-1 comparte las mismas vías de señalización con muchos factores de transcripción. Por lo tanto, el reto es identificar las características de las vías de señalización que controlan la actividad de Ets-1 para utilizarlos para la orientación terapéutica.
Para identificar nuevas vías, que previamente purificada compañeros de interacción de Ets-1 utilizando el estreptavidina desplegable ensayo. Con esta estrategia, hemos demostrado la interacción funcional entre Ets-1 y la reparación del ADN complejo de ADN-PK [20].
Aquí, hemos identificado poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) como nuevo compañero de interacción de Ets-1. PARP-1 es una proteína nuclear abundante y ubicua que cataliza poli (ADP-ribosil) ación (PARylation) usando NAD + como sustrato para la síntesis de poli ramificada (ADP-ribosa) polímeros de proteínas diana. PARP-1 juega diversos papeles en muchos procesos moleculares y celulares, incluyendo la detección de daños y reparación del ADN y la modificación de la cromatina [21]. Aunque PARP-1 se caracterizó inicialmente como una proteína de reparación del ADN, muchos estudios recientes han puesto de manifiesto su papel en la regulación transcripcional. PARP-1 está implicada en la regulación de factores de transcripción tales como NF-kappa B, AP-2, p53 y muchos otros [22] - [24]. Además, PARP-1 inhibición se ha convertido en una nueva estrategia terapéutica para el cáncer [25]. Curiosamente, la inhibición de PARP-1 parece ser eficaz en los cánceres que a menudo muestran las proteínas sobreexpresadas ETS, incluyendo ovario, de próstata y de mama [25]. Estudios previos han demostrado un vínculo funcional entre PARP-1 y miembros de la familia ETS, como la ESE-1, Fli1, Erg y Elk-1 [26] - [28]. Del mismo modo, Ets-1 puede ser un regulador clave de la
PARP1
gen mediante el control de su promotor [29]. Muy recientemente, el interés en este vínculo funcional ha aumentado en la medida en que se considera ahora como un enfoque terapéutico nuevo en el cáncer. Los informes recientes han demostrado que las proteínas de fusión de ETS, que están implicadas en muchos cánceres, son biomarcadores de drogas sensibilidad de la inhibición de PARP-1 [26], [30], [31]. Alta expresión de TMPRSS2: ERG en los cánceres de próstata o EWS-Fli1 en el sarcoma de Ewing provoca daños al ADN que son potenciados por la inhibición de PARP-1 y son seguidos por una fuerte inhibición de la progresión del cáncer. Sin embargo, en lo que sabemos, no ha habido informes de los enlaces funcionales entre Ets-1 de expresión y su sensibilidad a los inhibidores de PARP-1 |.
En este estudio, hemos demostrado que PARP-1 controla negativamente a la nivel de Ets-1 proteínas en las células del cáncer a través de PARylation. Bajo la inhibición PARylation, Ets-1 actividad transcripcional se mejora que se correlaciona con Ets-1 proteínas acumulación en el núcleo celular y un aumento en el daño del ADN que conduce a la muerte de células cancerosas. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la inhibición de la PARylation podría ser una nueva estrategia terapéutica para limitar la progresión del cáncer en los tumores de Ets-1 que expresan
Resultados
PARP-1:. Una novela Ets-1 compañero de interacción en células de cáncer
Para encontrar nuevos socios Ets-1, se llevó a cabo un
in vitro
estrategia de purificación por afinidad en el uso de un ensayo de pull-down estreptavidina. Este enfoque garantiza la identificación a gran escala de los socios mediante el uso de Ets-1 recombinantes biotiniladas inmovilizadas sobre perlas de estreptavidina para retener sus proteínas de unión que se encuentran en los extractos nucleares [20], [32]. En este caso, hemos utilizado células MDA-MB 231-, una línea celular de cáncer de mama invasivo, para producir extractos nucleares; estas células expresan endógenamente la oncoproteína Ets-1, lo que ofrece un contexto celular apropiado. Después de la separación de las proteínas unidas por SDS-PAGE, se observó una banda de proteína altamente visible con un peso molecular de 113 kDa después de la tinción coloidal (Fig. 1A, carril 3, indicado por un asterisco (*)), pero ausente en las condiciones de control (Fig. 1A, carriles 1 y 2). Esta proteína se identificó por espectrometría de masas como la enzima PARP-1 (Fig. 1B y S1) y su presencia exclusiva en proteínas unidas-Ets-1 fue confirmada por Western blot (Fig. 1C, carril 3). Debido a la fuerte afinidad de PARP-1 para el ADN mellado, extractos nucleares se trataron con DNasa I antes de la incubación para eliminar todos los rastros de ácidos nucleicos. Este tratamiento no interrumpir la interacción entre Ets-1 y PARP-1 (Fig. 1D, carril 4). Esto se confirmó por espectrometría de masas (datos no mostrados). A continuación realizó experimentos de co-inmunoprecipitación usando un conjugado de anticuerpo-agarosa anti-Ets-1 en células 231 MDA-MD-y en una línea celular de osteosarcoma, MG63, que también expresa Ets-1. Después de la separación por SDS-PAGE e inmunotransferencia con un anticuerpo anti-PARP-1 anticuerpo, PARP-1 co-precipita con Ets-1 tanto de MDA-MB-231 y las células MG63 (Fig. 1E, carril 2). Los experimentos de control con IgG de suero normal de conejo no pudieron reclutar PARP-1 (Fig. 1E, carril 1). Recíprocos experimentos de co-inmunoprecipitación se realizaron utilizando un conjugado de anticuerpo-agarosa anti-PARP-1 en MDA-MD-231 y las células MG63. Ets-1 co-precipita a partir de ambos MDA-MB-231 y las células MG63 y estaba ausente de los experimentos de control (Fig. 1F). Además, los experimentos de inmunofluorescencia utilizando anti-Ets-1 y anti-PARP-1 anticuerpos mostraron que ambas proteínas co-localizar en MDA-MB-231 células núcleos (Fig. S2, carril 4).
(A) gel teñido de azul coloidal de proteínas asociadas a Ets-1 de MDA-MB-231 extractos nucleares. Biotinilado Ets-1 proteínas usadas para el ensayo de pull-down se cargaron solo como control para identificar las proteínas biotiniladas (puntas de flecha) y sus productos de degradación potenciales (carril 1). proteínas desplegables detectados a partir de extractos nucleares (NE) se incubaron con cuentas sin carga se consideraron productos no específicos (carril 2). La PARP-1 específica de proteínas tirado hacia abajo teñida de azul coloidal por biotinilado Ets-1 se indica con un asterisco (carril 3). (B) Identificación de PARP-1 por MALDI-TOF espectrometría de masas. (C) Análisis de transferencia Western confirma la proteína asociada a Ets-1 como PARP-1. Las proteínas tirado-abajo de MDA-MB-231 extractos nucleares se analizaron por transferencia Western con anticuerpos de conejo dirigidos contra PARP-1 (H-250). gel teñido de azul (D) coloidal para proteínas asociadas a Ets-1 de MDA-MB-231 extractos nucleares, ya sea sin tratar (carriles 1 y 2) o tratados con DNasa I durante 40 minutos (carriles 3 y 4) y luego o bien se incubaron con perlas de estreptavidina biotinilado cargados de proteínas Ets-1 (puntas de flecha) (calles 2 y 4) o con los granos sin carga (carriles 1 y 3). Los asteriscos indican la proteína PARP-1 detectado en (A). (E) y (F) Co-inmunoprecipitación realizó con un anticuerpo de conejo anti-Ets-1 (C-20) o un anti-PARP 1-(H-250) conjugado anticuerpo de conejo-agarosa (carril 2) o IgG de conejo normal como un control (carril 1) y los extractos nucleares a partir de MDA-MB-231 células o células MG-63. De entrada (carril 3) contiene 3% de extractos nucleares que se sometieron a co-inmunoprecipitación. PARP-1 y Ets-1 se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos respectivamente H-250 y C-4.
Ets-1 interactúa directamente con PARP-1 y es entonces PARylated en un ADN-independiente de manera
Un estudio previo demostró que el ETS DBD interactúa con PARP-1 [30]; sin embargo, las interacciones con el Ets-1 DBD están restringidos por Ets-1 auto-inhibición. Por lo tanto, para estudiar la interacción entre Ets-1 y PARP-1, se utilizaron dos isoformas con biotina y auto-inhibido de Ets-1: la forma de longitud completa, simplemente llamado Ets-1 y una isoforma dominante negativo resultante de splicing alternativo , Ets-1 p27. Ets-1 p27 fue descubierto recientemente por nuestro grupo y carece del residuo de treonina-38 (Thr38) así como la punta (PNT) y dominios de transactivación (TAD) (Fig. 2A), todos los cuales son requeridos para la transactivación de Ets genes diana -1. Sin embargo, Ets-1 p27 todavía tiene las mismas propiedades de unión al ADN como Ets-1 [33]. Después de la incubación de biotinilados Ets-1 isoformas inmovilizados sobre perlas de estreptavidina con una enzima de PARP-1 recombinante, PARP-1 específica y directamente interactuado con Ets-1 isoformas (Fig. 2B, carriles 2 y 3). Por lo tanto, la auto-inhibición de Ets-1 no altera la interacción directa entre el DBD y PARP-1. Para investigar si Ets-1 es después de la traducción modificada por PARylation mediada por PARP-1, se llevó a cabo una-
in vitro
ensayo en PARylation. Para catalizar PARylation, PARP-1 requiere generalmente la presencia de ADN mellado, como se muestra en los controles con la adición de ADN de doble hebra se sometió a ultrasonidos (Fig. 2C carriles 1 y 2). Una vez activado, PARP-1 cataliza su auto-PARylation, que puede visualizarse utilizando un anticuerpo anti-PAR (Fig. 2C, carril 2). En presencia de Ets-1, auto-PARylation era más fuerte y Ets-1 se PARylated en un peso molecular de aproximadamente 51 kDa correspondiente a mono (ADP-ribosil) ación y PARylation con diferentes tamaños de polímero (Fig. 2C, carriles 4, flecha negro). Además, en ausencia de ADN, no sólo era PARP-1 todavía activado, pero Ets-1 fue incluso más fuertemente PARylated (Fig. 2C, carril 5, flecha negro). Con la p27 isoforma Ets-1, los resultados mostraron que en presencia de ADN mellado, Ets-1 p27 no fue PARylated (Fig. 2C, carril 7). Sin embargo, sin ADN, Ets-1 p27 activa PARP-1 y es entonces PARylated, visto como una banda con un peso molecular de aproximadamente 27 kDa y con polímeros de diferentes tamaños en los pesos moleculares entre 40 y 60 kDa (Fig. 2C, carriles 8). Por lo tanto, el extremo C-terminal de Ets-1 puede activar auto-PARylation de PARP-1 en una forma de ADN independiente por interacción directa proteína-proteína y se PARylated a cambio. Para demostrar PARylation en células cancerosas humanas, hemos generado una línea de células HeLa, obtenido por infección retroviral, que expresa de forma estable Ets-1 etiquetado con un péptido de unión a estreptavidina (PAS). Después de la purificación de Ets-1 en perlas de estreptavidina, se analizaron PARylation por Western blot utilizando un anticuerpo anti-PAR. Los resultados mostraron que una fracción de proteína de Ets-1 fue ligeramente PARylated en las células (Fig. 2D, carril 2). PARylation es una modificación post-traduccional de muy corta duración que es difícil de visualizar en las células, en particular debido a la acción de la poli (ADP-ribosa) glicohidrolasa (PARG), que cataliza la degradación de los polímeros PAR [21].
(A) representación esquemática de la proteína de longitud completa de Ets-1 y su isoforma dominante negativo Ets-1 p27. Cajas corresponden a regiones traducidas y líneas de puntos a las regiones no traducidas. Se indican treonina-38 (Thr38), dominio en punta (PNT), dominio de transactivación (TAD), dominio inhibidor (I), región traducida correspondiente al exón VII y el dominio de unión al ADN (DBD). ensayo (B) Estreptovidina desplegable con las proteínas Ets-1 y PARP-1 recombinantes. proteínas biotinilado Ets-1 (5 mg) o ETS-1 p27 (2,5 g) se cargaron en perlas de estreptavidina y después se incubaron con la proteína PARP-1 recombinante puro (1 g) durante 1 h (carriles 2 y 3). perlas de estreptavidina sola incubadas con PARP-1 se utilizaron como control (carril 1). PARP-1 se analizó por transferencia Western. (C) PARylation ensayo con Ets-1 y Ets-1 p27. Ets-1 (1 mg) o Ets-1 p27 (500 ng), las proteínas se incubaron con proteína recombinante PARP-1 (500 ng) en tampón de reacción PARylation (ver Materiales y Métodos) en presencia (carriles 4 y 7) o en ausencia (carriles 5 y 8) de ADN mellado durante 20 min. Como control, Ets-1 isoformas se incubaron solo en tampón de reacción y muescas de ADN (carriles 3 y 6) y auto-activación de PARP-1 solo se comprobó con o sin ADN (control, carriles 1 y 2) PARylation (D) de Ets-1 en células HeLa transfectadas de forma estable, que se obtiene por la infección retroviral. Ets-1 etiquetada con la unión de estreptavidina péptido (SBP) se purificó en perlas stretavidin a partir de extractos nucleares de células HeLa (carril 2). células HeLa que expresan de forma estable sólo el PAS se utilizaron como control (carril 1). En (C) y (D), el estado PARylation se determinó utilizando un anticuerpo anti-PAR.
PARP-1 modula la transcripción mediada por Ets-1 del promotor de estromelisina-1 |
Para determinar si la interacción con PARP-1 modula la actividad transcripcional de Ets-1, se llevaron a cabo ensayos de transactivación de la luciferasa. Para ello, se utilizó el promotor de la matriz metaloproteasa estromelisina-1, que es un bien estudiado Ets-1 gen diana implicada en la migración celular y la invasión del cáncer [34]. Este promotor, activada por unión cooperativa de dos Ets-1 moléculas a través de un EBS palindrómico, se fusionó con el gen de la luciferasa (Fig. 3A). Las células 3T3 de ratón, ya sea con el tipo de PARP-1 salvaje (WT) o knock-out (KO), se utilizaron para evaluar Ets-1 actividad transcripcional en ausencia total de la proteína PARP-1. En las células WT, el promotor de la estromelisina-1 se activa completamente por Ets-1 transfección (Fig. 3B, carril 3). Por el contrario, PARP-1 KO reduce la capacidad de Ets-1 para transactivar el promotor (Fig. 3B, carril 4). experimentos de rescate llevaron a cabo utilizando un PARP-1 vector de expresión humano permitió Ets-1 para recuperar en parte su actividad transcripcional (Fig. 3B, carril 5). Por lo tanto, PARP-1 es necesaria para la completa transactivación del promotor de estromelisina-1 por Ets-1. A continuación, examinó las consecuencias de PARylation mediada por PARP-1 en Ets-1 actividad transcripcional. Para ello, hemos realizado los mismos ensayos de transactivación de luciferasa con células 3T3 utilizando PJ-34, un inhibidor de PARP-1 catalítica. Sorprendentemente, la inhibición PARylation, en contra de PARP-1 KO, el aumento de Ets-1 la actividad transcripcional del promotor de estromelisina-1 como se muestra en las células WT transfectadas (Fig. 3C, carriles 3 y 4). En las células KO, PJ-34 no tuvo ningún efecto y no aumentó la transactivación del promotor (Fig. 3C, carriles 7 y 8). Por lo tanto, el aumento de Ets-1 actividad transcripcional actúan a través de la inhibición específica de la PARP-1. El análisis por transferencia Western reveló que la inhibición de PARylation por PJ-34 provocó un aumento de Ets-1 nivel de proteínas en las células WT (Fig. 3C, carriles 3 y 4). Para confirmar que la inhibición PARylation también provoca un aumento de Ets-1 actividad transcripcional en células de cáncer humano, llevamos a cabo ensayos de transactivación de la luciferasa en las células HeLa con dosis crecientes de PJ-34. Los resultados mostraron que el aumento dependiente de la dosis PJ-34 en la transactivación del promotor de estromelisina-1 se correlaciona con un aumento en los niveles de proteína Ets-1 (Fig. 3D, carriles 5-8). Este aumento se observó en Ets-1 los niveles de proteína en las células HeLa no sólo con PJ-34, sino también con dos otros bien estudiados inhibidores de PARP-1:. 5-AIQ y ABT-888 (veliparib) (Fig 3E, carriles 6- 8). Por lo tanto, este aumento se debe específicamente a la inhibición de PARP-1. Estos resultados sugieren que los niveles de proteína Ets-1 están regulados negativamente por PARylation mediada por PARP-1.
(A) Representación esquemática del gen de la luciferasa bajo el control de la estromelisina-1 promotor humano. Ets sitios de unión palindrómicas (EBS) se muestran sujeto con dos moléculas de Ets-1. (B) Efecto de la PARP-1 knock out (KO) en mediada por Ets-1 promotor de la actividad estromelisina-1. pGL3 construcciones de reportero de luciferasa (100 ng) se transfectaron en células 3T3 de ratón de tipo salvaje (WT) (carriles 1 y 3) o KO para el gen PARP-1 (carriles 2, 4 y 5) en 50 a 80% de confluencia en ausencia (carriles 1 y 2) o en presencia (carriles 3, 4 y 5) del vector de Ets-1 expresión (25 ng) y en los experimentos de rescate con PARP-1 vector de expresión (100 ng; carril 5). (C) Efecto de la PARP-1 inhibición catalítico sobre la actividad del promotor de estromelisina-1 mediada por Ets-1 en presencia o ausencia de PARP-1. pGL3 construcciones de reportero de luciferasa (100 ng) se transfectaron en células 3T3 de ratón WT (carriles 1 a 4) o KO para el gen de PARP-1 (carril 5-8) a una confluencia de 50-80% en ausencia (carriles 1, 2 , 5 y 6) o en presencia (carriles 3, 4, 7 y 8) de Ets-1 vector de expresión (25 ng) y en ausencia (carriles 1, 3, 5 y 7) o en presencia (carriles 2 , 4, 6 y 8) de PJ-34, un inhibidor catalítico de la PARP-1 (10 mM). (D) Efecto de la PARP-1 inhibición catalítico sobre Ets-1 mediada por la estromelisina-1 promotor de la actividad en un modelo de células de cáncer. pGL3 construcciones de reportero de luciferasa (100 ng) se transfectaron en células HeLa a una confluencia de 50-80% en ausencia (carriles 1-4) o en presencia (carriles 5-8) de Ets-1 vector de expresión (100 ng) y con dosis crecientes de PJ-34 (0-20 micras; carriles 1-4 y 5-8). En (B), (C) y (D), la actividad luciferasa, medido 48 h después de la transfección y 20 h después de la incubación con PJ-34, se expresa como un porcentaje con la actividad inducida por Ets-1 en un PARP-1 WT contexto indicado como 100%. Los resultados son la media de tres experimentos realizados por triplicado. (E) Efecto de la PARP-1 inhibición catalítico sobre el nivel de proteína Ets-1. células HeLa fueron cultivadas en placas de 6 pocillos hasta 70% de confluencia, transfectadas con pcDNA3 (1 g; panel de la izquierda) o pcDNA3-Ets1 (1 g; panel derecho) vectores para 24 h y se trató con PJ-34 (1 M) ( carriles 2 y 6), 5-AIQ (1 M) (carriles 3 y 7) o ABT-888 (1 M) (carriles 4 y 8) para 20 h. En todos los experimentos, los lisados celulares (30 mg de proteínas totales) se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos diferentes (véase Materiales y Métodos).
Inhibición de PARylation provoca la acumulación de Ets-1 en células de cáncer
Para determinar la cinética de acumulación de Ets-1, hemos realizado experimentos de imagen de lapso de tiempo. Las células HeLa se transfectaron de forma transitoria por un vector que expresa una proteína de fusión EGFP (proteína fluorescente verde) -ets-1. Bajo condiciones de control, eGFP-Ets-1 los niveles de proteína fueron estables durante 12 h lapso de tiempo (Fig. 4A, fila 1). Tras la adición de PJ-34, se observó un fuerte aumento de la señal de eGFP-Ets-1 correspondiente a los núcleos de las células HeLa (Fig. 4A, la fila 2). Sin embargo, PJ-34 no tuvo efecto sobre eGFP solo (Fig. 4A, fila 4) y, más interesante, no tuvo efecto sobre eGFP-Ets-1 p27 (Fig. 4A, fila 3). Teniendo en cuenta que de larga duración Ets-1 es ubiquitinated y luego degradada por el proteasoma, mientras que Ets-1 p27 no tiene ningún sitios de ubiquitinación [19], [33], el próximo examinó si la cinética de Ets-1 acumulación podrían compararse a las de la inhibición proteasomal. El uso de MG-132, un conocido inhibidor del proteasoma, dio lugar a la misma cinética de acumulación de Ets-1 como los observados durante la inhibición PARylation (Fig. 4A, fila 5). Por el contrario, MG-132 no tuvo efecto sobre los niveles de proteína Ets-1 p27, fortaleciendo así el vínculo entre PARylation y la degradación del proteasoma de Ets-1 (Fig. 4A, fila 6). El análisis estadístico de la variación en la intensidad de fluorescencia en estos experimentos de lapso de tiempo mostró que la variación significativa en Ets-1 los niveles de proteína (aproximadamente 50% de aumento) observados tras la adición de PJ-34 o MG-132 era comparable (Fig. 4A, parte inferior el panel, carriles 2 y 5). Para confirmar que la acumulación de Ets-1 mediada por la inhibición de PARP-1 también se pudo observar en un contexto endógeno, se trataron células MDA-MB-231 con PJ-34 y se analizaron Ets-1 los niveles de proteína mediante inmunofluorescencia. Ets-1 se localizó principalmente en el núcleo de las células MDA-MB-231, pero su presencia también se observó en el citoplasma perinuclear (Fig. 4B, carril 1, flechas blancas) [33]. Con un-Ets-1 anticuerpo anti, hemos observado una fuerte acumulación de endógena Ets-1 en los núcleos y citoplasma (Fig. 4B, carril 2) células. A continuación, examinó si este mecanismo era específico de Ets-1. Para ello, hemos probado varias proteínas que se sabe están PARylated tales como p53, c-Jun, ERK-2 y PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Los resultados mostraron que, a excepción de Ets-1, ninguna de estas proteínas acumuladas en las células bajo la inhibición PARylation por PJ-34 (Fig. 4C). También observamos que Ets-1 acumuló eficazmente en células MDA-MB-231 tras el tratamiento con otros inhibidores de PARP-1, 5-AIQ y ABT-888, mientras que los niveles de proteína p53 permanecieron sin cambios (Fig. S3). Por lo tanto, PARylation mediada por PARP-1 está implicado en una regulación específica de Ets-1 los niveles de proteína en las células cancerosas y suponemos que este mecanismo está vinculado a su degradación proteasomal.
(A) Cinética de Ets-1 la acumulación observada por las imágenes de lapso de tiempo. Las células HeLa se cultivaron en placas de MatTek y fueron transfectadas con pEGFP-C1-Ets-1 (500 ng; las filas 1, 2 y 5) o pEGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng; filas 3 y 6) o vacíos pEGFP-C1 (500 ng; fila 4). 24 h después de la transfección, las células HeLa se trataron con PJ-34 (10 micras; filas 2-4) o MG-132 (5 micras; filas 5 y 6) y se observaron durante 12 h bajo un microscopio de fluorescencia a 20 × ampliación con uno foto tomada cada hora. Panel inferior: El análisis estadístico de la variación de la intensidad de fluorescencia. Condiciones 1 a 6 que se indican en el eje x son los mismos que los descritos anteriormente. La media de intensidad de fluorescencia a partir de lapso de tiempo del experimento imágenes se calcularon utilizando el software ImageJ y se estableció la relación de variación entre el T = 12 horas y T = 0 fotos. Los resultados son la media de tres experimentos. (B) Visualización de los niveles de proteína Ets-1 en las células MDA-MB-231 tratadas con PJ-34 por inmunofluorescencia. células MDA-MB-231 fueron tratados con PJ-34 (10 M) durante 20 h. Ets-1 se visualiza en rojo (Alexa Fluor ® 594). Las células se examinan bajo un microscopio de fluorescencia a 40 × magnificación. Barra de escala = 20 micras. Las flechas blancas indican la localización citoplasmática de Ets-1 en las células no tratadas (carril 1). Panel inferior: representaciones gráfica de superficie. Superficie parcelas se obtuvieron mediante el análisis de inmunofluorescencia imágenes utilizando el software ImageJ; las direcciones x e y ejes indican las posiciones de píxel y el eje z, la intensidad de la fluorescencia. (C) Efecto de la PARP-1 inhibición catalítico sobre el nivel de proteínas PARylated. células MDA-MB-231 fueron tratados con PJ-34 (10 M) durante 20 h. Los lisados celulares (30 mg de proteínas totales) se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos diferentes (véase Materiales y Métodos) en contra de PARP-1, p53, c-Jun y ERK-2 que se sabe que someterse PARylation.
Ets-1 de expresión conduce a la muerte de las células cancerosas bajo PARylation inhibición
para determinar las consecuencias de la acumulación de Ets-1 en las células cancerosas, se examinó si exógeno Ets-1 de expresión afecta a la supervivencia de las células HeLa tratadas con PJ -34. células HeLa fueron transfectadas con un vector que expresa Ets-1 o un vector vacío y después se incubaron durante 20 h con PJ-34. los experimentos de imagen de lapso de tiempo mostró que el PJ-34 no tuvo ningún efecto drástico sobre la supervivencia de las células HeLa transfectadas con el vector vacío ( 'Mock') como se demuestra por la ausencia de la morfología necrótica y yoduro de propidio (PI) la incorporación (Fig. 5A, panel izquierdo y 5B). Sin embargo, Ets-1 de expresión sensibiliza las células cancerosas a la toxicidad PJ-34 en gran medida (Fig. 5A, panel derecho). los experimentos de imagen de lapso de tiempo y análisis estadístico mostró que casi la totalidad de los Ets-1-que expresan las células HeLa PI incorporado y se sometieron a la necrosis (Fig. 5A, panel derecho y 5B). De manera similar, una célula activada por fluorescencia análisis (FACS) demostró que Ets-1 que expresan las células HeLa eran más propensos a la necrosis después de PJ-34 del tratamiento (Fig. 5C, panel derecho). Como se sabe PJ-34 para causar un paro mitótico de una manera PARP-1-independiente [36], también se realizaron estos experimentos con ABT-888 (Fig. S4). Se obtuvieron los mismos resultados, demostrando que la necrosis de Ets-1 que expresan las células HeLa opera a través de la inhibición específica de PARP-1 (Fig. S4). Con las células MDA-MB-231, se observó que 44% de las células se someten a la necrosis después del tratamiento PJ-34 (Fig. 5D y 5E). El análisis FACS confirmó esta menor sensibilidad a la toxicidad PJ-34 (Fig. 5F). células de cáncer de pecho son más resistentes a fármacos contra el cáncer, tales como doxorrubicina o paclitaxel, debido a la alta expresión de MDR1 y Ets-1 [37]. Por lo tanto, hemos probado si PJ-34 podría ser utilizado en complemento a un tratamiento de doxorrubicina. Estos experimentos también nos permitió investigar si [o no] la acumulación Ets-1 mediada por la inhibición de PARP-1 provoca un mayor grado de resistencia a la doxorubicina en células MDA-MB-231. Los resultados muestran que Ets-1 todavía acumuladas en el marco inhibición PARylation cuando las células MDA-MB-231 fueron tratadas con 500 nM de la doxorrubicina (Fig. S5A). Sin embargo, hemos observado que MDA-MB-231 células eran más propensos a la necrosis cuando PJ-34 y la doxorrubicina se combinaron que cuando las células fueron tratadas con sólo uno de estos dos fármacos (Figs. S5B y S5C). Por lo tanto, a pesar de que los efectos PJ-34 son moderados en MDA-MB-231 células, los inhibidores de PARP-1 se podrían combinar de manera eficiente con otros fármacos contra el cáncer para mejorar la eficacia del tratamiento.
(A) los experimentos de imagen de lapso de tiempo de células HeLa tratadas con PJ-34. células HeLa fueron cultivadas en platos de Hi-Q4 hasta 70% de confluencia y se transfectaron con pcDNA3 vacío (250 mg; panel de la izquierda) o pcDNA3-Ets1 (250 mg; panel de la derecha) Vectores 24 h antes de ser tratada con PJ-34 (5 M) o no se tratan. Las células se tiñeron con Hoechst 33242 (azul) y PI (rojo) para imágenes de células vivas y monitoreados durante 20 h. Barra de escala = 20 mM. (B) Representación gráfica de la proporción de células HeLa necróticas (%) en tres puntos de tiempo (ver Materiales y Métodos). (C) La citometría de flujo de detección de muerte celular de las células HeLa tratadas con PJ-34. células HeLa fueron cultivadas en placas de 6 pocillos hasta 70% de confluencia y se transfectaron con pcDNA3 (1 g; panel de la izquierda) o pcDNA3-Ets1 (1 g; panel derecho) vectores para 24 h y (líneas de trazos) deja sin tratar o tratados con PJ -34 (líneas continuas) para un 20 h adicionales de incubación. la muerte celular necrótica, se determinó por citometría de flujo después de tinción PI. Las cifras debajo de la barra horizontal dan los porcentajes de muerte celular necrótica inducida por el PJ-34 específico en cada condición. La citometría de flujo perfiles mostrados son representativos de tres experimentos repetidos. (D) los experimentos de imagen de lapso de tiempo de células MDA-MB-231 tratadas con PJ-34. MDA-MB-231 células se cultivaron en placas de Hi-Q4 hasta 80% de confluencia y se trataron con PJ-34 (10 M) o no se tratan. Las células se tiñeron con Hoechst 33242 (azul) y PI (rojo) para imágenes de células vivas y monitoreados durante 20 h. Barra de escala = 20 mM. (E) Representación gráfica de la proporción de células MDA-MB-231 necróticas (%) en tres puntos de tiempo (ver Materiales y Métodos). F) La citometría de flujo de detección de muerte celular de células MDA-MB-231 tratadas con PJ-34. MDA-MB-231 células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos hasta 80% de confluencia y se dejaron sin tratar (líneas discontinuas) o tratadas con PJ-34 (líneas continuas) para un 20 h de incubación. la muerte celular necrótica, se determinó por citometría de flujo después de tinción PI. Las cifras debajo de la barra horizontal representan los porcentajes de muerte celular necrótica inducida por el PJ-34 específico en cada condición. Citometría de flujo perfiles mostrados son representativos de tres experimentos repetidos.
La acumulación de Ets-1 mediada por la inhibición PARylation aumenta el daño del ADN
A continuación, se investigó la posibilidad de que la necrosis celular mediada por la inhibición de PARP-1 concomitante con Ets-1 acumulación se debió a un aumento en el daño del ADN como se observó con las proteínas de fusión Ets en el cáncer de próstata y sarcoma de Ewing [26], [30]. Para ello, se evaluó el nivel de una marca de histona de ADN doble hebra se rompe, H2AX fosforilada focos (γH2AX). Barra de escala = 20 micras.