Extracto
Antecedentes
Como una proteína quinasa de serina /treonina, p70S6K juega un papel importante en las células tumorales. La evidencia ha puesto de manifiesto la sobreexpresión de p70S6K y fosforilados p70S6K (p-p70S6K) en varios tejidos tumorales, con estas proteínas identificado marcadores pronósticos independientes en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En este estudio, hemos explorado el papel del inhibidor específico p70S6K PF-4708671 en el CPNM.
Métodos
Tres líneas celulares de cáncer (A549, SK-MES-1, y NCI-H460) fueron tratados con PF-4708671 a cinco concentraciones diferentes, incluyendo 0.1μM, 0.3μM, 1μM, 3μM y 10μM, y los niveles de proteína se determinó por Western-blot. A continuación, se evaluaron los efectos del PF-4708671 ambos
in vitro gratis (proliferación celular, la apoptosis, la distribución del ciclo celular y la invasión) y
in vivo
.
Resultados
los niveles de expresión de p-p70S6K y el efector aguas abajo S6 se redujeron significativamente por PF-4708671. Diametralmente opuesto, los niveles de proteínas aguas abajo de BAD, Caspase3 y ERK habían aumentado después del tratamiento con PF-4708671. Además, PF-4708671 proliferación celular drásticamente inhibida y capacidad de invasión en el A549, SK-MES-1 y células NCI-H460
in vitro
, causando la detención del ciclo celular en la fase G0-G1. No se observaron efectos limitados de PF-4708671 sobre la apoptosis en las tres líneas celulares de cáncer evaluadas. Es importante destacar que, PF-4708671 podría inhibir la tumorigénesis en ratones desnudos
in vivo
.
Conclusión
Estos resultados demuestran que el inhibidor específico p70S6K PF-4708671 tiene efectos inhibitorios sobre la tumorigénesis NSCLC
in vitro
y
in vivo
. Por lo tanto, p70s6k debe considerarse como una nueva diana terapéutica potencial, y PF-470867 puede utilizarse como medicamento dirigido al tratamiento del cáncer
Visto:. Qiu ZX, Sun RF, Mo XM, Li WM (2016) El p70S6K El crecimiento del cáncer de pulmón inhibidor PF-4708671 impide no pequeñas específica de la célula. PLoS ONE 11 (1): e0147185. doi: 10.1371 /journal.pone.0147185
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 17 Noviembre 2015; Aceptado 30 de diciembre de 2015; Publicado: 15 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.372.504), el Programa de Apoyo a la Ciencia y Tecnología del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Sichuan provincia (2014SZ-0148), y el Programa de Cooperación Internacional del Departamento de la provincia de Sichuan Ciencia y Tecnología (2014AA022202-2)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
el cáncer de pulmón, una de las neoplasias más comunes, es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con las tasas más altas de morbilidad y mortalidad en china. Más del 80% de los pacientes con cáncer de pulmón son diagnosticados como cáncer de pulmón de células no pequeñas [1]. A pesar de la terapia de combinación con la resección quirúrgica, la quimioterapia, la radioterapia y terapia biológica objetivo, la tasa de supervivencia global a 5 años de cáncer de pulmón es sólo el 16%, variando de 52,2% a 4% en pacientes en etapa locales y distantes, respectivamente [2]. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas y elucidación de los cambios a nivel molecular podría ser beneficioso para el tratamiento del cáncer de pulmón.
como una proteína quinasa de serina /treonina quinasa de la familia AGC, p70S6K es fosforilada por diferentes factores de crecimiento e insulina -Al igual que los factores a través de la vía PI3K /mTOR, e interactúa con S6, eIF4B, eEF2K, PDCD4 y muchos otros sustratos; esto es importante para la proliferación inducida por mitógeno celular, la supervivencia, la motilidad y la resistencia a los medicamentos de quimioterapia en células de cáncer [3]. Estudios recientes demostraron que la sobreexpresión de p70S6K y p-p70S6K en varios tejidos tumorales es importante en la predicción de un mal pronóstico, y contribuye a la resistencia a la quimioterapia [4-14].
In vitro
sobreexpresión de p70S6K promueve la proliferación celular, la angiogénesis, y la supresión de la apoptosis [15, 16]. Mientras tanto, S6K1 knockdown inhibe la expresión p70S6K y reduce significativamente la proliferación celular, la disminución de la formación de tumores en ratones desnudos [17]. Por otra parte, los niveles de p70S6K y p-p70S6K son significativamente más altos en los tumores que en los tejidos normales de los pacientes con CPNM [18, 19]. Nuestro estudio anterior mostró que el p-p70S6K está estrechamente relacionado con la supervivencia a largo plazo en NSCLC [20]. Por lo tanto, p70S6K juega un papel importante en el CPNM, y la evaluación de los inhibidores de la alta especificidad p70s6k podrían ayudar a definir esta nueva diana terapéutica para la aplicación clínica.
Los estudios actuales de terapias diana para el cáncer se centran principalmente en los inhibidores de mTOR [20] , mientras que las obras del análisis específico de los inhibidores de p70s6k en el tratamiento del cáncer de pulmón se limitan [21-25]. Este estudio se centró en los p70S6K inhibidor específico PF-4708671 para evaluar los efectos de la inhibición p70S6K en NSCLC [22].
Métodos
1. PF-4708671 (C
19H
21F
3 N
6)
PF-4708671 (# 559273 Calbiochem, Merck, EE.UU.) es un inhibidor de S6K1 (Ki = 20 nM ; IC50 = 160 nm). 10 mg de PF-4708671 se disolvieron totalmente en 1 ml de DMSO y se almacenaron a -80 ° C durante
in vitro
experimentos. Para
in vivo
ensayos, PF-4798671 se disolvió en 10% de DMSO diluido primero y más en 30% PEG400, 0,5% de Tween 80 y 5% de propilenglicol, para conseguir una concentración final de DMSO del 1%.
2. Cultivo de células
Tres líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas se obtuvieron a partir Type Culture Collection de la Academia China de Ciencias, y se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Entre ellos, NCI-H460 (carcinoma de células grandes), y SK-MES-1 (carcinoma de células escamosas), las células A549 (adenocarcinoma). Todas las células se mantuvieron en un entorno humidificado que contiene 5% de CO2 a 37 ° C.
3. Western blot
Las proteínas se extrajeron de las células utilizando el kit de extracción de proteína fosforilada (keygen, Nanjing, China), y las concentraciones se midieron usando BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.). Cantidades iguales de proteína a partir de diversas muestras se separaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y electro-transferido sobre fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billeraica, EE.UU.). A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anti-p70S6K R365, anti-p-p70S6K T389, la proteína anti-ribosoma S6 A229 (# BS1568,#BS4440,#BS3610, 1; 1000, Tecnología Bioworld, Nanjing, China ), anti-BAD, anti-Caspase3, anti-ERK (# 9239P,#96625,#3552S, 1: 1000, Cell Signaling Technology), y anti-β-actina (# 4970, 1: 5000, Cell Signaling Technology) anticuerpos, respectivamente. Las proteínas diana se detectaron utilizando el sistema de ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Philadelphia, EE.UU.) después de la exposición a quimioluminiscente HRP sustrato (Millipore, Billerica, EE.UU.). Los datos fueron analizados con el software de análisis Un 1-D Cantidad (Bio-Rad).
4. La proliferación celular ensayo
La proliferación celular de líneas celulares de NSCLC se midió utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células tumorales se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
3 por pocillo. Después de la incubación en presencia de PF-4708671 (0.1μM, 0.3μM, 1μM, 3μM y 10μM) para 24, 48 y 72 horas, respectivamente, se evaluó la proliferación celular. DMSO tratada o se utilizaron células no tratadas como controles negativos. Además, el marcador de proliferación celular Ki-67 fue examinado por inmunohistoquímica en tejidos tumorales desnudos.
5. Análisis del ciclo celular
Para cada línea celular, aproximadamente 1 × 10
se cosecharon 6 células después del tratamiento con 10μM PF-4708671 durante 24 h; la distribución del ciclo celular se evaluó mediante el kit de detección de Ciclo Celular (keygen, Nanjing, China); contenido de ADN se determinaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU.). Los datos fueron analizados utilizando el software CellQuest y Modfit.
6. la invasión de células
invasión celular se evaluó utilizando el kit de Millipore la invasión de células de ensayo (# ECM550, Millipore, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, después del tratamiento con PF-4708671 a 10μM durante 24 h. Suspensiones de células que contienen 1 × 10
6 Se sembraron las células /ml en la cámara superior con medio suplementado con 1% de suero. Se añadieron los medios que contienen 20% de FBS a las cámaras inferiores.
7. apoptosis de las células
Aproximadamente 5 x 10
se cosecharon 5 células después del tratamiento con PF-4708671 a 10μM durante 24 h, y se tiñeron con Anexina V-Kit APC /7-AAD Apoptosis Detección (KeyGen, Nanjing, China ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se midió la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCalibur. células anexina V-positivos y negativos 7AAD considerado como apoptosis. Además, se utilizó el método TUNEL para determinar la apoptosis en los tejidos tumorales de xenoinjerto.
8.
In vivo
efectos del PF-4708671 en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos establecida con células H460
H460 células, lo que mostró la mayor tasa de crecimiento, fueron seleccionados para
in vivo
experimentos. ratones desnudos hembra (4 semanas, de 18 a 20 g) fueron adquiridos de Beijing WeiTongLiHua animal de experimentación técnica co., LTD. (China), y ubicado en el Centro de Animales de China occidental Universidad de Sichuan, con un 12 h /12 h oscuridad ciclo de luz. Todos los experimentos se llevaron a cabo en condiciones SPF (libres de patógenos especiales). Los ratones se dividieron en tres grupos al azar, y cada grupo contenían tres ratones (n = 3 /grupo). Los puntos finales de la observación fueron como sigue: 1) el diámetro de los tumores & gt; 3 cm; 2) tumores trasplantados tenían necrosis y /o descomposición; 3) la muerte natural. El método de sacrificio al final de la investigación in vivo fue decapitado después de la anestesia bajo la premisa de sin otros ratones podían ver. En el Grupo 1 (grupo H460), 1 × 10
7 H460 células se inyectaron por vía subcutánea en ratones. Grupo 2 (control negativo, grupo NC) animales se inyectaron las células como en el Grupo 1; tres días después, se les administraron por vía intraperitoneal 200μl de la mezcla de disolvente (1% de DMSO, 30% PEG400, 0,5% Tween 80 y 5% de propilenglicol) al día durante 1 semana. En el Grupo 3 (grupo H460 + PF4708671), los ratones fueron tratados como se describe para el Grupo 2, con 200μl PF4708671 (50 mg /kg) en lugar de la mezcla de disolvente. Tumores tamaños se midieron diariamente durante más de una semana (diámetro largo = a; corto diámetro = b), y los volúmenes se derivaron como sigue: V = ab2 /2. tasa de inhibición del tumor = [/control de peso del tumor (peso-experimental peso del tumor de tumores de control)] x 100%. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital de China Occidental.
9. El análisis estadístico
Los datos fueron procesados por Microsoft Excel 2010. Usando el software SPSS 19.0, t-test y una forma-ANOVA se aplicaron para el análisis de datos. Los datos son la media ± SD, y de dos caras
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
1. PF-4708671 inhibe la fosforilación p70S6K y S6
Nuestros resultados revelaron que los p70S6K inhibidor específico PF-4708671 redujo significativamente la fosforilación de p70S6K y su S6 aguas abajo en 0.1μM (
P Hotel & lt; 0,05) ; p-S6 niveles de expresión disminuyó con el aumento de las concentraciones de fármaco (
P Hotel & lt; 0,05). Por el contrario, los niveles de proteína de malas aguas abajo, Caspase3 y ERK se incrementaron después del tratamiento con PF-4708671 con la concentración de 1μM. Sin embargo, los niveles de proteína total p70s6k y S6 no presentaron diferencias significativas entre los grupos de control y tratamiento negativas (figura 1, S1 Archivo).
1. los niveles de expresión de la proteína de p70S6K, p-p70S6K, S6, y p-S6 después del tratamiento con diversas concentraciones de fármaco. β-actina se utilizó como control de carga. 2. proteína expresiones niveles de p-p70S6K y p-S6 bajo diferentes concentraciones de fármaco.
P Hotel & lt; 0,05: grupo de tratamiento de drogas vs grupo control negativo. N, control negativo; A, H460; B, A549; C, SK-MES-1.
2. PF-4708671 inhibe la proliferación de células NSCLC
CCK-8 datos del ensayo demostraron que las capacidades de proliferación de las tres líneas celulares de cáncer fueron significativamente inhibida por PF-4708671. Después de 24 horas de tratamiento, PF-4708671 inhibe la proliferación de células H460 a 10μM, y cantidades-1 SK-MES de células A549 y se redujeron significativamente en 3μM y 0.1μM, respectivamente (
P
& lt; 0,05). Además, H460, A549 y SK-MES-1 tasas de crecimiento celular se inhibió significativamente por el PF-4708671 en 0.3μM, 0.1μM, y 0.1μM, respectivamente, tratamiento post 48 hora (
P Hotel & lt; 0,05). Todas las líneas celulares mostraron una reducción significativa la proliferación a las 72 hora después del tratamiento con 0.1μM PF-4708671 (
P Hotel & lt; 0,05). tiempo- significativa y la inhibición dependiente de la concentración de la proliferación celular se observó en todas las líneas celulares (
P
& lt; 0,05). (Fig 2)
proliferación tasa de inhibición = [1 - (grupo experimental - los valores de valor en blanco) /(valor negativo grupo de control -. valor en blanco)] x 100%
3. PF-4708671 afecta ciclo celular NSCLC
Después de la tinción del ADN por PI, citometría de flujo análisis mostró la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 para todas las tres líneas celulares de NSCLC (
P
& lt; 0,05). Mientras tanto, las proporciones de células en S y G2 /M fases se redujo significativamente en las células A549 (
P
& lt; 0,05). Además, también se detectaron cantidades reducidas de la fase S (H460) y G2 /M fase (SK-MES) células (
P
& lt; 0,05). (Fig 3)
(* p. & lt; 0,05, grupo de tratamiento de drogas vs grupo control negativo) guía empresas
4. PF-4708671 inhibe significativamente la invasión de células
PF-4708671 capacidad de invasión inhibido en las tres líneas celulares de cáncer evaluó. De hecho, los números medios de células que pasan a través del gel de la matriz extracelular fueron significativamente inferiores en los grupos de tratamiento que en los controles negativos (
P
& lt; 0,05), con tasas de inhibición de la invasión de 75,90%, 46,23% y 82,73%, para H460, A549 y SK-MES-1 células, respectivamente (figura 4).
5. PF-4708671 aumenta la apoptosis de células NSCLC
PF-4708671 mostró un efecto limitado sobre la apoptosis en las tres líneas celulares de cáncer, aunque se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,05). En comparación con los grupos de control negativo, las tasas de apoptosis para H460, A549 y SK-MES-1 líneas de células se incrementaron en un 1,537%, 2,483% y 3,475%, respectivamente (
P
& lt; 0,05) (Fig 5).
6. PF-4708671 inhibe la tumorigénesis
in vivo
Todos los tumores trasplantados fueron cultivadas con éxito en cada ratón, y todos los ratones no tener signos de miscomfort y /o sufrimiento hasta que los mató. Las tendencias de los volúmenes de los tumores en ratones desnudos de cada grupo se resumen en la Tabla A en S1 y S2 Archivo Fig. Los animales tratados con el inhibidor específico p70S6K PF470867 mostraron crecimiento tumoral abiertamente inhibido en comparación con el grupo 1 (H460) y el Grupo 2 (NC) (todo el
P Hotel & lt; 0,05). Como se muestra en la Tabla B en S1 y S3 Archivo figura, pesos y volúmenes de los tumores extirpados fueron más bajos después del tratamiento con PF470867 en comparación con los valores de control (
P Hotel & lt; 0,05). Además, la proliferación celular, tal como se expresa por Ki-67, se redujo significativamente en el grupo H460 + PF4708671 en comparación con los valores obtenidos para los dos grupos de control. Finalmente, la tinción de TUNEL demostró significativamente mayor tasa de apoptosis de las células tumorales en el Grupo 3 en comparación con el control (Grupos 1 y 2) los valores (Fig 6). Células
Las flechas muestran teñidas positivamente. Aumento original, × 400.
Discusión
p70s6k participa en la tumorigenicidad y la progresión del cáncer, pero el mecanismo que subyace a su efecto no se conoce completamente. Los estudios que evalúan p70S6K en relación con CPNM son escasos; nos encontramos previamente que la sobreexpresión p70S6K promueve la proliferación de células NSCLC, inhibe la apoptosis de las células y aumenta la capacidad de invasión. Para comprender mejor el papel de los inhibidores de p70s6k en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el presente estudio se evaluó tres líneas celulares de cáncer (A549, SK-MES-1, y NCI-H460) tratados con PF-4708671, y evaluó los cambios malignos fenotipos tales como la proliferación, la invasión y la evasión de la apoptosis.
como se muestra anteriormente, el inhibidor de la p70S6K PF-4708671 inhibieron significativamente la activación de la p70S6K y su efector aguas abajo clave S6, de una manera dependiente de la concentración. Por otra parte, los niveles de proteína de BAD aguas abajo; Caspase3 y ERK, que afectan a la capacidad de las células de la apoptosis, se aumentaron después del tratamiento con PF-4708671. Esto demostró que PF-4708671 podría afectar a la supervivencia de las líneas celulares de cáncer 'mediante el control de los factores pertinentes de la apoptosis. Además, la proliferación de células NSCLC era tiempo y concentración dependiente inhibida por PF-4.708.671, lo que corrobora informes anteriores [15-17]. Por lo tanto, hemos propuesto que la regulación p70S6K se asocia con la apoptosis celular. Las diferencias en las concentraciones de fármacos efectivos mínimos para las líneas celulares de cáncer evaluados puede ser debido a sus niveles p70s6k distintas y tasas de crecimiento: hemos hallado tasa de inhibición del crecimiento del 30 al 40%
La hipótesis de que mediante la regulación del ciclo celular. , PF-4708671 pueden inhibir la proliferación celular. Estudios recientes demostraron que S6K1 y p70S6K son críticos para la detención de G1 [26-28]. Consistentemente, se encontró que PF-4708671 afectados distribución del ciclo celular en las tres líneas celulares de NSCLC evaluados, lo que retrasa significativamente la progresión del ciclo celular en la fase G0 /G1. Otro factor importante que afecta a la proliferación celular es la apoptosis; un ensayo de fase I de LY2584702 evaluación de los pacientes con tumores sólidos avanzados no mostró un efecto antitumoral abierta por esta droga [25]. Como puede observarse, PF-4708671 tuvo un efecto limitado sobre la apoptosis celular en células de NSCLC, con una tasa de apoptosis cercano al 3% in vitro. Por lo tanto, se asumió que las vías p70s6k no pueden estar implicados en la apoptosis celular. Sin embargo, este estudio también demostró que el PF-4708671 inhibe la tumorigénesis NSCLC
in vivo
.
p70S6K sobreexpresión ha demostrado estar asociada con la enfermedad agresiva y mal pronóstico en el cáncer de mama [29]. Nuestro estudio anterior mostró p70S6K sobreexpresión promueve la invasión de células
in vitro
. Curiosamente, PF-4708671 podría inhibir la capacidad de invasión de todas las líneas celulares de NSCLC evaluados en este estudio. Por el contrario, los estudios en pacientes con CPNM demostraron que la expresión de p-p70S6K no está asociado con metástasis en los ganglios linfáticos y la etapa del cáncer [18-29]. Se necesitan más estudios para confirmar el papel de p70S6K en CPNM invasión y metástasis
in vivo
.
Sin embargo, todavía tenía algunas limitaciones en nuestra investigación. En primer lugar, aunque todas las células eran líneas de células de NSCLC, las fuentes eran diferentes. Por lo que nuestros resultados no pudieron ser completamente coherente porque puede haber diferentes mecanismos entre los diferentes fondos genéticos. Por otra parte, la cantidad no era lo suficientemente grande para los experimentos de ratones desnudos in vivo. Por lo tanto, los resultados necesitan más investigación en profundidad para confirmar.
En conclusión, nuestro estudio demostró que el inhibidor p70S6K PF-4708671 podría afectar la distribución del ciclo celular, la inhibición de la proliferación celular, la apoptosis y la invasión de células de NSCLC. La inhibición del eje de p70S6K-S6 resultó en la actividad anti-tumor potente. Por lo tanto, la terapia de combinación con un inhibidor de p70S6K y la quimioterapia representa una nueva estrategia prometedora para el tratamiento del NSCLC.
Apoyo a la Información
S1 Fig. los niveles de expresión de proteínas de BAD, Caspase3 y ERK después del tratamiento con PF-4708671
doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. tendencia de crecimiento del volumen del tumor en cada grupo de ratones desnudos (mm
3)
doi: 10.1371. /journal.pone.0147185.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. Comparación de los tamaños de los tumores entre los grupos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s003 gratis (TIF)
S1 Archivo. Tabla A. Tumor crecimiento de volumen de cada grupo en ratones desnudos (, n = 3 /mm
3). Tabla B. Tumor xenoinjertos peso de cada grupo ()
doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Gracias a la profesora Mo XM nos proporcionó un buen ambiente de laboratorio y equipos.