Extracto
La degradación de la matriz extracelular (ECM), un paso crítico en la metástasis del cáncer, se determina por el equilibrio entre MMP (metaloproteinasas de la matriz) y sus inhibidores TIMPs (inhibidores tisulares de las metaloproteinasas). En las células cancerosas, este equilibrio se desplaza hacia MMPs, la promoción de la degradación de ECM. Aquí, mostramos que EZH2 juega un papel activo en este proceso mediante la represión de la expresión de TIMP2 y TIMP3 en células de cáncer de próstata. El
TIMP
genes son desreprimidos por desmontables expresión de EZH2 en las células de cáncer de próstata humano, pero reprimidos por la sobreexpresión de EZH2 en las células epiteliales de próstata humanos benignos. EZH2 cataliza H3K27 trimethylation y posterior metilación del ADN de los
TIMP
promotores de genes. La sobreexpresión de EZH2 confiere un fenotipo invasivo en las células epiteliales benignas de la próstata; sin embargo, este fenotipo es suprimida por cooverexpression de TIMP3. EZH2 caída reduce marcadamente la actividad proteolítica de MMP-9, disminuyendo de ese modo la actividad invasiva de las células de cáncer de próstata. Estos resultados sugieren que la represión de la transcripción de la
TIMP
genes por EZH2 pueden ser un importante mecanismo para cambiar el equilibrio MMP /TIMP en favor de la actividad MMP y por lo tanto para promover la degradación de ECM y la posterior invasión de células de cáncer de próstata.
Visto: Shin YJ, Kim JH (2012) el papel de EZH2 en la regulación de la actividad de metaloproteinasas de la matriz en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (1): e30393. doi: 10.1371 /journal.pone.0030393
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de noviembre de 2011; Aceptado 20 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Enero, 2012
Derechos de Autor © 2012 Shin, Kim. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención GM087470 (J-HK) del Instituto Nacional de Ciencias médicas generales, el Instituto Nacional de Salud. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Metástasis-la propagación de las células cancerosas de un sitio primario a otras partes del cuerpo-es una característica común de los tumores malignos. El proceso de la metástasis del cáncer consiste en múltiples pasos secuenciales; las células cancerosas se escapan del tumor primario, entrar en el torrente sanguíneo, viajan a lugares distantes, y extravasate para formar sitios tumorales secundarias [1]. Durante la metástasis, las células cancerosas invaden y migran a través de las restricciones moleculares normales, tales como la matriz extracelular (ECM) [2]. El ECM, a menudo referido como el tejido conectivo, es una red organizada de materiales extracelulares que rodean y sostienen las células. El ECM se compone de una amplia variedad de polisacáridos y proteínas, tales como lamininas, colágenos, fibronectina, y proteoglicanos, y desempeña un papel integral en la determinación de la forma, el desarrollo y la función bioquímica de las células [2]. El tejido de las proteínas de la MEC constituye la membrana basal (BM) que subyace a la superficie basal de los tejidos epiteliales y forma una barrera física contra la invasión tumoral. Las células cancerosas son capaces de degradar la barrera ECM mediante el uso de enzimas, resultando en la disolución de la BM. El más destacado entre las enzimas son las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [3].
MMPs son una gran familia de endopeptidasas dependientes de cinc y responsable de la degradación de la ECM [4]. MMPs hace tiempo se sabe que se asocia con los procesos fisiológicos y patológicos tales como la remodelación de tejidos, cicatrización de heridas, la angiogénesis y la progresión del cáncer [5] - [8]. MMP latentes aparecen en las proteínas en el citosol (pro-MMP) y se someten a procesamiento proteolítico para producir las enzimas maduros, que son, a su vez, secretadas y asociadas a la superficie celular y el ECM [9], [10]. Cuando se muestra en la superficie celular, sin embargo, las MMP son inhibidas por los inhibidores tisulares endógenos de las metaloproteinasas (TIMP), que se unen directamente a los dominios catalíticos de MMPs en un 01:01 estequiometría [11]. Por lo tanto, el equilibrio entre MMP y TIMP es crítica para la remodelación de ECM eventual y la degradación. El genoma humano codifica cuatro TIMPs (TIMP1-TIMP4) que son funcionalmente redundantes e inhiben MMPs 23 humanos [12]. En muchos tumores malignos, la expresión de TIMP es el regulado, en consonancia con su papel como inhibidores de MMP [13], [14]. Supresión de la expresión de TIMP por ARN antisentido confiere oncogenicidad en las células Swiss 3T3 [15], [16]. Por el contrario, la sobreexpresión de TIMP resultados en la inhibición de la invasión y metástasis de las células del cáncer [17] - [23]. Estas observaciones indican que la represión de los
TIMP
genes puede ser un importante mecanismo de regulación de la progresión del cáncer, pero el mecanismo subyacente todavía no se entiende completamente.
EZH2 (Polycomb proteínas grupo potenciador de zeste homólogo 2 ) es la subunidad catalítica de la polycomb represivo complejo 2 (PRC2) [24], [25] y se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos [26]. Los primeros estudios mostraron que los altos niveles de expresión EZH2 están asociados con la invasión y la metástasis de tumores malignos tales como cánceres de mama y de próstata [27] - [31], y que EZH2 sobreexpresión transforma las células de la próstata benignas RWPE-1 [32] y BPH1 [33 ] y las células epiteliales de mama inmortalizadas [28]. Recientemente, EZH2 también se ha encontrado para regular las vías asociadas con el metabolismo celular tales como la Ras GTPasa de la activación DAB2IP proteína [34], [35] y el receptor adrenérgico beta-2-ADRB2 [36] de señalización, la promoción de la progresión del cáncer. EZH2 parece mediar el silenciamiento transcripcional por cualquiera de lisina metilación 27 en la histona H3 (3meH3K27) [23], [24] o el reclutamiento de metiltransferasas de ADN (DNMTs) a sus genes diana que catalizan de novo metilación del ADN [37]. Sin embargo, informes recientes también han demostrado que H3K27 trimethylation por EZH2 no siempre está asociado con la metilación del promotor de ADN para el silenciamiento de ciertos genes EZH2-diana [38] - [41]. El papel funcional de EZH2 en la progresión del cáncer de próstata ha sido identificada por la expresión de genes de perfiles de ARN de las células epiteliales de la próstata humana que sobreexpresan nontumorigenic EZH2 [27]. Sin embargo, se encontró que los resultados no alterar significativamente los niveles de expresión de muchos genes asociados a metástasis que fueron identificados por los perfiles genéticos de las células de cáncer de próstata humano [42]. La naturaleza de esta discrepancia no está clara, pero podría surgir de las diferencias en los niveles de expresión de EZH2 en las células de cáncer de próstata probados.
En este estudio, se investigó el papel de EZH2 en la activación de las MMP para promover la invasión y la metástasis de las células de cáncer de próstata. Para identificar los genes asociados a metástasis regulados por EZH2 en el cáncer de próstata, la expresión de ARNm en células de cáncer de próstata altamente invasivos en los que la expresión EZH2 fue derribado fue perfilada utilizando metástasis humana matrices de PCR. Hemos encontrado que altos niveles de expresión EZH2 durante la progresión del cáncer inducen la represión de
TIMP
genes (
TIMP2
y
TIMP3
), lo que lleva a una mayor actividad de MMP-9 y por lo tanto a un aumento de la actividad invasiva de las células de cáncer de próstata. Estos resultados proporcionan la primera evidencia de que el tiempo EZH2 juega un papel activo en la modificación del equilibrio MMP /TIMP hacia MMP y de ese modo promover la metástasis de las células de cáncer de próstata.
Resultados
EZH2 caída reduce significativamente el actividades invasivas y migratorias de las células del cáncer de próstata
Para investigar si los altos niveles de expresión EZH2 se correlaciona con el fenotipo invasivo de las células de cáncer de próstata, se determinan en primer lugar los niveles de proteína de EZH2 en líneas celulares de próstata humano (LNCaP, PC3, y DU145). Nuestro análisis de transferencia de Western mostró que los niveles de EZH2 son significativamente elevados en las líneas celulares de cáncer que en la próstata humana línea celular epitelial benigna RWPE-1 (Figura 1A). A continuación, examinó la actividad invasiva de las células de cáncer de próstata que expresan diferentes niveles de la proteína EZH2 utilizando ensayo de cámara de Boyden Transwell. Con este fin, la expresión EZH2 fue derribado el uso de dos diferentes-EZH2 específicos shRNAs, SH1 o SH2 (Figura 1C, la parte superior). células PC3 y DU145 fueron altamente invasivo, en comparación con las células RWPE-1 benignos (Figura 1B). Sin embargo, EZH2 desmontables disminuyó significativamente la invasividad de las células de cáncer de próstata (Figura 1C, medio); solamente 18~20% de las células de cáncer de próstata infectadas con lentivirus que expresan EZH2 orientación shRNA penetrado la membrana de BME en la cámara (SH1 y SH2), en comparación con las células infectadas con el control (NT, nontargeting shRNA) lentivirus (Figura 1C, la parte inferior ). Por el contrario, la sobreexpresión de EZH2 confiere un fenotipo invasivo en las células RWPE-1 (Figura 1D, WT); Sin embargo, RWPE-1 en las células que sobreexpresan una proteína EZH2 mutante (EZH2-H689A) con la actividad HMT reducido significativamente [44] no mostraron actividad invasiva (Figura 1D, H689A). Debido a la EZH2 juega un papel activo en la invasión del cáncer de próstata (Figuras 1C y 1D), se analizó adicionalmente la actividad migratoria de las células DU145 utilizando el ensayo de migración de cicatrización de heridas (Figura 1E, arriba). Se encontró que las células DU145 llenan ~ 80% y ~ 50% de las áreas heridas antes (NT) y después (SH1) desmontables expresión de EZH2, respectivamente, a las 24 h después de rascarse (Figura 1E, abajo). Estos resultados sugieren fuertemente que los altos niveles de expresión EZH2 promover la invasión y migración de células de cáncer de próstata.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión EZH2 en la línea celular de próstata benigna RWPE-1 y las líneas celulares de cáncer de próstata maligno LNCaP, DU145 y PC3 (arriba). Actina se utilizó como control interno. Las bandas de proteína se cuantificaron utilizando un software Cantidad (Bio-Rad) (parte inferior). (B) ensayo de invasión de las células RWPE-1, PC3 y DU145. invasividad celular se evaluó por la invasión de las células a través de insertos recubiertos de BME en la cámara de Boyden Transwell (parte superior). La tasa de invasión se determinó contando las células que migraron a través de los insertos y se expresó como porcentaje respecto al control (RWPE-1, ajustado a 100%) (parte inferior). Cada barra representa la media ± s.e de cinco campos contados. (C) Análisis de transferencia Western de la expresión EZH2 en las células PC3 y DU145 después de una infección con lentivirus shRNA-EZH2 específica (SH1 o SH2; dos shRNA-EZH2 específicas diferentes) o con la no tratada shRNA (NT, control) lentivirus (arriba) . ensayo de invasión de las células PC3 o DU145 después de una infección con-EZH2 específica shRNA de control (NT) lentivirus (medio) (SH1 o SH2) o. se muestran campos representativos de células invadidas y manchados (en el centro). Cada barra representa la media ± s.e de cinco campos contados (abajo). (D) Western blot de la sobreexpresión de tipo salvaje (WT) y mutante (H689A, enzimáticamente inactivo) EZH2 proteínas en las células RWPE-1 infectadas con EZH2-GFP (WT)-GFP, EZH2 (H689A), o el control (GFP vector) lentivirus. proteínas EZH2 se expresaron a partir del promotor CMV (izquierda). ensayo de invasión de las células RWPE-1 infectadas con GFP EZH2 (WT)-GFP, EZH2 (H689A) o control (GFP vector) lentivirus (derecha). (E) Herida ensayo de células DU145 infectadas con el shRNA-EZH2 específica (SH1) o el control shRNA (NT) lentivirus curación. Las imágenes fueron tomadas antes (0 h) y después de la herida (24 h) (superior). Los resultados se expresaron como el porcentaje de la superficie restante determinado por la normalización del área de la herida después de 24 h a la zona inicial de la herida a las 0 h (ajustado a 100%). Cada barra representa la media ± SE de cinco campos medidos (abajo)
* P & lt;.
0,05,
** p & lt; 0,005 *** p & lt; 0,001 gratis (en comparación con los valores de control) .
la identificación de los genes diana aguas abajo de la EZH2 asociados a la metástasis del cáncer de próstata
Para identificar los genes asociados a metástasis cuyas expresiones son regulados por la EZH2, se determinó cambios de expresión génica en invasiva Las células de cáncer de próstata después de la EZH2 desmontables. La expresión de diferentes ARNm en células de cáncer de próstata se evaluó mediante el uso de la metástasis tumoral humano MR
2
Profiler
™ PCR Array (HAP-028D) diseñado para representar 84 genes que se sabe están involucrados en la metástasis (Figuras 2A y 2B). Los resultados mostraron que la expresión de los 12 y los 32 genes se altera & gt; 2 veces en DU145 (Tabla S1) PC3 (Figuras S1A y S1B y la Tabla S2) las células, respectivamente, por desmontables de expresión EZH2. Entre estos genes, se encontró TIMP3 ser el gen que está más altamente upregulated tanto en las células PC3 (Figuras 2B y S1B) DU145 y, dando lugar a la hipótesis de que TIMP3 puede ser un objetivo principal de la represión por EZH2. Para probar esta hipótesis, se examinaron los niveles de proteína de TIMP3 y EZH2 por inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-TIMP3 (Figura 2C) anti-EZH2 y. Como se muestra en las imágenes de inmunotinción, los niveles de proteína TIMP3 eran altos en los tejidos normales de la próstata (Figuras 2C-E y 2C-F), pero apenas detectable en tejidos de cáncer de próstata (Figuras 2C-G y 2C-H). Resultados similares se obtuvieron por análisis de RT-PCR que muestra que los niveles de ARNm se TIMP3 disminuyeron notablemente en células PC3 y DU145, en comparación con las células RWPE-1 (Figura S1c). En contraste, los niveles de proteína EZH2 eran muy altas en los tejidos de cáncer de próstata (Figuras 2C-C y 2C-D) en comparación con los tejidos normales de la próstata (Figuras 2C-A y 2C-B). Estas observaciones sugieren que la expresión de TIMP3 y EZH2 se correlaciona inversamente, probablemente debido a la regulación por disminución de la expresión TIMP3 por EZH2.
(A) RT
2 perfilador array PCR para genes metástasis tumoral humano en células DU145 después de una la infección con el shRNA-EZH2 específica o control lentivirus (NT). El gráfico de dispersión de la prueba
vs
muestras de control indica la validez del experimento. (B) 12 genes cuyas expresiones están altamente afectada por EZH2 desmontables se muestran (ver también las Tablas S1 y S2). ARN total fue aislado de las células DU145 después de una infección con EZH2 específica shRNA o control lentivirus (NT) y se procesa para array PCR (C) Inmunofluorescencia imágenes de la próstata normal (normal 1 y normales 2) y las secciones de tejido de tumor de próstata (PCA1 y PCA2 ), usando el anticuerpo anti-EZH2 (verde) y el anticuerpo anti-TIMP3 (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul).
regulación a la baja de la expresión TIMP3 por EZH2 en líneas celulares de cáncer de próstata
A fin de investigar la represión transcripcional de la expresión TIMP3 por EZH2, se determinó cuantitativamente mRNA TIMP3 y niveles de proteína en líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP tres, PC3, DU145 y) con y sin desmontables de expresión EZH2. los niveles de mRNA TIMP3 se encontró que eran ~10-13 veces mayor en las células cancerosas tratadas con shRNA-EZH2 específico (SH1) que las células de control no tratadas con el shRNA (Figura 3A), y como resultado, los niveles de proteína TIMP3 se incrementaron significativamente por desmontables de expresión EZH2 (Figura 3B). Por el contrario, se demostró la sobreexpresión de la EZH2 funcional (WT), pero no de la proteína EZH2 mutante (H689A), para disminuir TIMP3 mRNA y niveles de proteína en RWPE-1 en las células (Figura 3C). Baja regulación de la expresión TIMP3 por EZH2 también fue confirmada por inmunotinción de TIMP3 en las células DU145 infectadas con lentivirus-EZH2 específica shRNA (SH1) o control (nontargeting shRNA) lentivirus (NT) (Figura 3D). los niveles de proteína TIMP3 eran bajos en las células DU145 (Figura 3D-c), pero significativamente elevados por desmontables expresión de EZH2 (Figura 3D-h). Por lo tanto, TIMP3 puede ser un objetivo de EZH2 para la represión en células de cáncer de próstata.
(A) QRT-PCR análisis de la expresión de TIMP3 en las células de cáncer de próstata (LNCaP, DU145 y PC3) después de una infección con -EZH2 específica shRNA (SH1) o el control shRNA lentivirus (NT).
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** p & lt; 0,005 gratis (en comparación con el control (NT)). (B) Análisis de transferencia Western de los niveles endógenos de la proteína EZH2 y TIMP3 en células de cáncer de próstata (LNCaP, DU145 y PC3) infectados con el shRNA-EZH2 específica (SH1) o de control del virus shRNA (NT). Actina se utilizó como control interno. (C) de transferencia de Western (parte superior) y QRT-PCR (abajo) el análisis de expresión de EZH2 y TIMP3 en la próstata benigna células RWPE-1 después de una infección con EZH2-GFP (WT), EZH2 (H689A)-GFP, o el control (GFP vector) lentivirus. Actina se utilizó como control interno.
* P & lt; 0,05
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** p & lt; 0,005 gratis (en comparación con el control (vector)). La flecha sólida indica EZH2-GFP expresada a partir del promotor de CMV, la flecha punteada indica endógena EZH2. (D) La inmunotinción de EZH2 y TIMP3 expresa en las células DU145 infectadas con shRNA-EZH2 específico (SH1) o control lentivirus (NT), usando el anticuerpo anti-EZH2 (verde) y el anticuerpo anti-TIMP3 (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes fusionadas también se muestran (EZH2 /TIMP3 y DAPI /TIMP3).
epigenética silenciamiento de la expresión TIMP3 por EZH2
EZH2 es un componente de PRC2 que cataliza trimethylation de H3K27 ( 3meH3K27) [24], [25]. Para explorar el mecanismo subyacente de la represión epigenética de TIPM3 por EZH2, investigamos los efectos de la histona inhibidor de la metilación 3-Deaza-naplanocin A (DZNep) sobre la expresión de TIMP3. tratamiento DZNep dio como resultado niveles disminuidos de proteína TIMP3 (Figura 4A), probablemente por causa desrepresión de expresión TIMP3 (Figura 4B). Por otra parte, el potencial invasivo de células PC3 era ~ 5 veces disminuido por tratamiento DZNep (Figura 4C).
(A) análisis de transferencia de Western de los niveles endógenos de EZH2, TIMP3 y 3meH3K37 en las células de cáncer de próstata (PC3 célula) después del tratamiento con DZNep (5 mM) o DMSO (control) durante 2 días. Actina se utilizó como control interno. (B) análisis de QRT-PCR de la expresión de TIMP3 en células PC3 tratadas con DZNep (5 mM) o DMSO (control). (C) ensayo de invasión de las células PC3 tratadas con DZNep (5 mM) o DMSO (control).
Para los ensayos de chip estudiar más a fondo el mecanismo molecular de la represión transcripcional de la expresión TIMP3 por EZH2, se realizó en las células DU145 y PC3 utilizando anticuerpos anti-EZH2 y anti-3meH3K27. Como las proteínas PcG son reclutados al ADN a través de la YY1 proteína de unión a ADN de [45], el ADN inmunoprecipitado se analizó por PCR con los conjuntos de cebadores diseñados para amplificar las regiones que contienen los sitios de unión de YY1-en el
TIMP3
promotor ( Figura 5A). Los resultados indican que: 1) EZH2 se une a la
TIMP3
promotor y cataliza trimethylation de H3K27 (3meH3K27) (Figuras 5B y 5C), pero no se une a la
GAPDH
promotor, sirven como un control negativo (Figura 5C); 2) ARN polimerasa II (RNAP II) se une fuertemente a la
GAPDH
promotor pero no tiene ninguna unión apreciable a la
TIMP3
promotor (Figura 5C). Estos resultados sugieren que trimethylation mediada por EZH2 de H3K27 impide RNAP II de la unión a la representación esquemática
TIMP3
promotor y de este modo da como resultado el silenciamiento transcripcional del gen.
(A) de la región promotora de la
TIMP3
gen. La flecha doblada representa los sitios de inicio de la transcripción (+1). Las líneas debajo de la
TIMP3
locus representan las regiones amplificadas por PCR. (B-C) ADN inmunoprecipitado se analizó mediante PCR con los conjuntos de cebadores específicos (véase también el cuadro S3). Cromatina obtenido de PC3 (B) y las células DU145 (C) se inmunoprecipitaron usando anticuerpos para EZH2, H3K27 trimetil-histona (3meH3K27), la ARN polimerasa II (Pol II), y IgG. El ADN inmunoprecipitado se analizó por PCR con el cebador establece para amplificar la región 4 en la Figura 5A. La
GAPDH
promotor se utilizó como control negativo. Cada chip experimento se repitió al menos tres veces y se muestra un experimento representativo. (D) La regulación epigenética de la expresión en células PC3 TIMP3. chip de ensayo se llevó a cabo utilizando los anticuerpos a EZH2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (Pol II), y el control de IgG después del tratamiento con DZNep (1 M), 5-Aza (10 mM), DMSO (control), o EZH2- shRNA específica (shRNA1). El ADN inmunoprecipitado se analizó por PCR con el cebador establece para amplificar la región 4 en la Figura 5A. análisis (E) QRT-PCR de la expresión de TIMP3 en células PC3 después del tratamiento con DZNep (1 M), 5-Aza (10 mM), o DMSO (control) durante 2 días. Los experimentos se repitieron al menos dos veces y los resultados se expresaron como una proporción de TIMP2 o ARNm TIMP3 al control GAPDH ARNm.
* P & lt; 0,05
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** p & lt; 0,005 gratis (en comparación con el control (DMSO)) guía empresas
A continuación se determinó si H3K27 trimethylation se acopla con. promotor de la metilación del ADN para la represión de TIMP3, hemos tratado con células PC3 DZNep o el inhibidor de la metilación del ADN 5-Aza seguido de chip análisis. EZH2 desmontables o tratamiento DZNep marcadamente inhibida tanto H3K27 trimethylation y la metilación del ADN (proteína de unión MeCP2, metil CpG 2) del
TIMP3
promotor; en contraste, el tratamiento 5-Aza inhibido solamente la metilación del ADN pero no tuvo efecto significativo sobre H3K27 trimethylation del promotor (Figura 5D). Además, el tratamiento de células PC3 con DZNep o 5-Aza resultó en la desrepresión de expresión TIMP3 a casi el mismo grado (Figura 5E). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la represión transcripcional de la
TIMP3
gen se produce a través de la trimethylation H3K27 EZH2 mediada y posterior metilación del ADN.
epigenética silenciamiento de la expresión TIMP2 por EZH2
A continuación se investigó si, al igual TIMP3, otros tres TIMPs (TIMP1, TIMP2 y TIMP4) son transcripcionalmente reprimidos por EZH2. Nuestro análisis de RT-PCR mostró que TIMP1 no estaba regulado por la EZH2, mientras que TIMP4 fue reprimida cuando la expresión EZH2 es derribado (Figura 6). En cambio, la expresión TIMP2 se incrementó significativamente por la EZH2 caída, pero no se incrementó cuando se expresa la proteína EZH2 mutante (EZH2-H689A). Nuestros estudios muestran que ChIP TIMP2, como TIMP3, también está sujeto a EZH2 mediada por metilación de las histonas y posterior metilación del promotor de ADN (Figura 7). El descenso de regulación de la
TIMP2
gen en células de cáncer de próstata ha demostrado ser asociado con la metilación del promotor [13], lo que sugiere que los factores epigenéticos de regulación, tales como la HDAC y DNMT, pueden estar implicados en la regulación de TIMP2. Nuestros resultados muestran que el modificador de la epigenética EZH2 puede ser el factor que media la inactivación epigenética de TIMP2
(A-C) análisis de QRT-PCR de la expresión de
TIMP
genes (A, TIMP1.; B, TIMP2; C, TIMP4) en las células de cáncer de próstata (LNCaP, DU145 y PC3) después de una infección con shRNA-EZH2 específico (SH1) o control shRNA lentivirus (NT).
* P & lt; 0,05
,
** p & lt; 0,005 gratis (en comparación con el control (NT)). (D-F) QRT-PCR análisis de la expresión de
TIMP
genes (D, TIMP1; E, TIMP2; F, TIMP4) en la línea celular de próstata benigna RWPE-1 después de una infección con EZH2 lentivirus (sobreexpresión WT virus o H689A) o control durante 4 días. Los resultados se expresaron como una relación de
TIMP
ARNm a
GAPDH
control de ARNm.
* P & lt; 0,05
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** p & lt; 0,005 gratis (en comparación con el control (GFP)) guía empresas
(A) Representación esquemática de las regiones promotoras de.
TIMP2
gen. La flecha doblada representa los sitios de inicio de la transcripción (+1). Las líneas debajo de la
TIMP2
locus representan las regiones amplificadas por PCR utilizando conjuntos de cebadores (serie 1, el conjunto 2, el conjunto 3 en (B); en conjunto 2 (C) y (D)), diseñado para amplificar las regiones que contienen los sitios de unión de YY1-(ver Tabla S3). (B-C) de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) experimentos se realizaron con la cromatina aislada de PC3 (B) y las células DC145 (C) utilizando anticuerpos frente a EZH2, 3meH3K27, y IgG. Los resultados de nuestro chip tanto en las células PC3 y DU145 son muy similares entre sí. Se muestran los resultados de chip en las células DU145. (D) La regulación epigenética de la expresión TIMP2 en células PC3. chip de ensayo se llevó a cabo utilizando los anticuerpos a EZH2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (Pol II), y el control de IgG después del tratamiento con DZNep (1 M), 5-Aza (10 mM), DMSO (control), o EZH2- shRNA específica (shRNA1). análisis (E) QRT-PCR de la expresión de TIMP2 en células PC3 después del tratamiento con DZNep (1 M), 5-Aza (10 mM), o DMSO (control) durante 2 días. Los experimentos se repitieron al menos dos veces y los resultados se expresaron como una proporción de
TIMP2
mRNA a
GAPDH
control de mRNA.
* P & lt; 0,05
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** p & lt;. 0,005 gratis (en comparación con el control (DMSO)) guía empresas
represión transcripcional de TIMP3 por EZH2 promueve la invasión de las células del cáncer de próstata
Para evaluar la relación funcional entre la regulación a la baja de TIMP3 por EZH2 (Figura 3) y la disminución del fenotipo invasivo de las células de cáncer de próstata en un EZH2 desmontables (Figuras 1C y 1D), overexpressed EZH2 y TIMP3 separado o juntos en RWPE-1 células (Figura 8A) y examinó la actividad invasiva de las células por medio de ensayo de cámara de Boyden Transwell (Figura 8B). El fenotipo invasivo de las células RWPE-1 fue inducida por EZH2 sobreexpresión como se observó anteriormente (Figura 1D), pero se suprimió significativamente por cooverexpression de TIMP3 (Figura 8B), proporcionando evidencia directa de que la represión de TIMP3 por resultados EZH2 en aumento de la actividad invasiva de las células de cáncer de próstata.
(a) análisis de Western blot de EZH2 y expresión en células TIMP3 RWPE-1 después de una infección con las combinaciones indicadas de lentivirus que expresan EZH2, TIMP3 y el virus de control. (B) ensayo de invasión de las células RWPE-1 después de una infección con las combinaciones indicadas de lentivirus que expresan EZH2, TIMP3 y el virus de control. Arriba: una, EZH2 (-) /TIMP3 (-); b, EZH2 (-) /TIMP3 (+); c, EZH2 (+) /TIMP3 (-); d, EZH2 (+) /TIMP3 (+). ensayo zimográfico (C) de gelatina para MMP-2 y la actividad de MMP-9 en células PC3 y DU145 infectadas con shRNA-EZH2 específico (SH1) o de control del virus shRNA (NT). Las bandas superior e inferior indican activa MMP-9 (92 kDa) y activa MMP-2 (62 kDa), respectivamente. intensidades de banda zymographic se cuantificaron por densitometría usando software Quantity One (Bio-Rad). Cada barra representa la media ± s.e de tres campos contados.
* P & lt; 0,05
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** p & lt; 0,005
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*** p & lt; 0,001 gratis (en comparación con el control (NT))
MMP-2 y MMP-9 son conocidos por ser los MMPs prominentes responsables de la degradación de ECM, y por lo tanto hemos probado si la actividad enzimática de estas dos MMPs está regulada por EZH2 usando el ensayo de zimografía de gelatina. la actividad de MMP-2 se encontró a no ser cambiado de manera significativa por la EZH2 caída. Sin embargo, la actividad de MMP-9 se redujo en ~28% en células PC3 y ~ 50% en las células DU145, respectivamente, se trató con shRNA-EZH2 específica, en comparación con células de control (NT) (Figura 8C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que EZH2 mediada por la represión transcripcional de TIMP3 lleva directamente a la activación de MMP-9.
Discusión
El equilibrio entre MMP y TIMP es un parámetro crítico para la degradación de ECM y por lo tanto un paso crucial para la invasión y la metástasis del cáncer. En este estudio, mostramos que la regulación positiva de la expresión aberrante de EZH2 en las células de cáncer de próstata desplazar este equilibrio hacia MMP y de ese modo promover la degradación de la MEC. EZH2 hace esto al reducir la expresión de
TIMP
genes (
TIMP2
y
TIMP3
). TIMP2 y TIMP3, en comparación con TIMP1 y TIMP4, inhiben un amplio espectro de MMPs y varios de desintegrina metaloproteinasas, Adams y ADAMTSs [12]. Además, TIMP3 es el único miembro de la familia TIMP que se une fuertemente a ECM y de este modo está implicada en la patogénesis de la enfermedad [9], [10]. TIMP3 también tiene un efecto inhibidor sobre la angiogénesis por el bloqueo de la unión de VEGF a los receptores de VEGF-2 [46] y una capacidad de promover la apoptosis [47] - [49]. Por lo tanto, la represión transcripcional de TIMP2 y TIMP3 por EZH2 probable que mejora la degradación de ECM y la angiogénesis, pero reduce la actividad de apoptosis, lo que favorece la invasión de células del cáncer y la metástasis.
La presencia o elevada expresión de algunas de las MMP se asocia positivamente con la progresión del cáncer [3], [50]. Nuestro análisis de la metástasis matriz PCR muestra que algunos
MMP
genes, como
MMP7
y
MMP13
, en PC3 células fueron notablemente regulados a la baja por caída de expresión EZH2 (Figura S1) . Por lo tanto, EZH2 parece actuar como un activador, en lugar de un represor, de la expresión de esos genes. Sin embargo, estos resultados no se observaron claramente en las células DU145, tal vez debido a diferentes bases genéticas entre las dos líneas celulares [51]. Mientras que la regulación de la transcripción de MMP genes por EZH2, que estaba fuera del alcance de este estudio, es actualmente objeto de investigación, nuestros resultados apoyan la posibilidad de que la sobreexpresión de EZH2 en las células del cáncer de próstata metastásico puede elevar la actividad de MMP en general, tanto por la disminución de los niveles de TIMP (TIMP2 y TIMP3) y mediante el aumento de los niveles de algunas MMP, tales como MMP-9.
metilación del ADN promotor es la modificación epigenética más común asociado con el silenciamiento de genes en el cáncer. EZH2 parece reclutar DNMTs a sus genes diana, lo que resulta en la metilación de las islas CpG adyacentes y el gen posterior silenciamiento [37]. En este modelo, la metilación mediada por la EZH2 H3K27 puede ser un requisito previo para la metilación del ADN del promotor. Nuestros resultados apoyan esta idea, como hemos observado que
TIMP2
y
TIMP3
, al igual que otros genes diana EZH2 como
MSMB
[31],
RUNX3
[52], y
SLIT2
[39], son silenciados a través de histonas (H3K27) metilación seguido de la metilación del ADN (Figuras 5 y 7). Sin embargo, no siempre se requiere la metilación del ADN del promotor para la represión de los genes diana EZH2. Por ejemplo, el silenciamiento EZH2 mediada del gen de la E-cadherina se produce a través de la metilación H3K27 pero no requiere la metilación del promotor de ADN [38]. Además, H3K27 trimethylation no está asociado con la metilación del promotor de ADN para silenciamiento de un número sustancial de EZH2 genes diana en el cáncer de próstata [41]. Por lo tanto, se necesitan más estudios para distinguir estos mecanismos.
Para que las células cancerosas a la metástasis, deben liberarse de las barreras físicas normales, a la migración y la invasión, como la adhesión célula-célula y ECM. Por otra parte, la degradación de la MEC comunicados de moléculas asociadas con la ECM, tales como factores de crecimiento y citoquinas de señalización, que influyen significativamente en la metástasis [53]. Por lo tanto, la degradación de ECM por MMPs es de importancia fundamental para no sólo la eliminación de las barreras, sino también hacer las moléculas de señalización accesibles a las células cancerosas. Como se ha demostrado en este estudio, EZH2, que actúa como un oncogén potencial en diversos tumores malignos, desempeña un papel activo en la regulación al alza de la actividad MMP y promover la degradación de ECM y la posterior invasión de células de cáncer de próstata, proporcionando un nuevo penetración en el papel de EZH2 en la metástasis del cáncer de próstata
Materiales y Métodos
cultivo de células
Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).. PC3, las células DU145 y LNCaP fueron cultivadas en RPMI 1640 con 10% de FBS y penicilina /estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Las células RWPE-1 se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos (K-SFM) que contiene 50 mg ml de extracto de pituitaria bovina /y el factor de crecimiento epidérmico 5 ng /ml como se describe anteriormente [43].