Extracto
Antecedentes
En este estudio, se investigó si la expresión de la proteína PKR se correlaciona con los niveles de mRNA y biomarcadores moleculares también evaluados que están asociados con PKR, como PKR fosforilados (p-PKR) y fosforilado eIF2α (p-eIF2α).
metodología y los resultados
determinaron los niveles de expresión de la proteína PKR y mRNA en 36 tejidos de tumor de pulmón primario frescos mediante el uso de análisis de transferencia Western y PCR en tiempo real de transcriptasa inversa (RT-PCR), respectivamente. Utilizamos microarrays de tejidos para la evaluación inmunohistoquímica de la expresión de p-PKR y proteínas p-eIF2α. Hemos demostrado que los niveles de ARNm de PKR se correlacionan significativamente con los niveles de PKR de proteína (rho de Spearman = 0,55,
p
& lt; 0,001), lo que sugiere que los niveles de proteína PKR en muestras de tumores son regulados por PKR mRNA. También hemos observado que los pacientes con alta p-PKR o expresión de p-eIF2α tuvieron una supervivencia promedio considerablemente más larga que aquellos con poca o ninguna p-PKR o expresión de p-eIF2α (
p = 0,03
y
p
= 0,032, respectivamente). Además, evaluó el efecto pronóstico de la expresión combinada de p-PKR más PKR y p-eIF2α más PKR y encontramos que ambas combinaciones fueron fuertes marcadores pronósticos independientes para la supervivencia global de pacientes en estadio I y todos los pacientes en etapa.
Conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren que la expresión de la proteína PKR puede controlado por el nivel de transcripción. Combinados niveles de expresión de PKR y p-PKR o p-eIF2α pueden ser nuevos marcadores para predecir el pronóstico de los pacientes con CPNM
Visto:. Él Y, Correa AM, Raso MG, Hofstetter WL, Fang B, Behrens C, et al. (2011) El papel de la PKR /eIF2α vía de señalización en el pronóstico de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10.1371 /journal.pone.0024855
Editor: John D. Minna, Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Marzo, 2011; Aceptado: 22 de agosto 2011; Publicado: 10 de noviembre 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación: Este trabajo está apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud a través del MD Anderson Cancer Center programa de subsidios para CA-016672 - Programa de pulmón, una especializada. programa de Investigación de Excelencia (SPORE) subvención CA-070907 (IW), y una subvención R01 CA-124 591 (BF). Más apoyo vino de Departamento de Defensa conceder W81XWH-07-1-0306 (IW), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30600611, 81071912) (YH) y "1510 del proyecto" de la Tercera Universidad Médica Militar de China (a YH), y de la flor de genes Homer Fund terapia, la terapia génica Rogers Fondo de Carlos, el Fondo de Investigación Wiess Elkins dotado Margaret, la flora y fondo de investigación de Stuart Mason cáncer de pulmón, el Fondo Torácica Terapia génica Phalan, y el George P. Sweeney Fondo de Investigación del esófago (SS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos. LY es un empleado de Ziren Research LLC. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La proteína quinasa (PKR) es una serina /treonina quinasa inducible por interferón que media la síntesis de proteínas, un proceso estrechamente regulado que es crítico en la proliferación celular y la diferenciación [1] - [3]. El aumento de expresión de PKR se ha demostrado que se correlaciona con un mejor pronóstico en el cáncer de cabeza y cuello y el colon [2], [3], y la acumulación de evidencia demuestra que PKR puede actuar como un supresor de tumor en la leucemia y otras enfermedades malignas hematopoyéticas [4], [ ,,,0],5]. La unión de ARN de doble cadena (dsRNA) o ARN de cadena simple estructurados puede mediar la fosforilación de PKR [6], [7]. Activado PKR fosforila su objetivo abajo bien documentada, la subunidad alfa del factor de iniciación de la síntesis de proteínas eIF2 (eIF2α), que conduce a la inhibición de la síntesis de proteínas y la obtención de las actividades antivirales y antitumorales [8], [9]. Además de su papel en el control de la traducción, PKR ha sido implicada en la inmunidad antiviral innata, apoptosis, proliferación celular, y el estrés de señalización [10]. Además, la expresión de PKR y la autofosforilación se incrementan en varios tipos de cáncer, incluyendo el melanoma, cáncer de colon, y cáncer de mama [11], [12]. Los resultados de varios estudios han demostrado la importancia de eIF2α fosforilada (p-eIF2α) en la terapia del cáncer [10], [13], [14]: la activación de la vía de la fosforilación de PKR-eIF2a es esencial para las funciones antiproliferativos y proapoptóticos de la gen supresor de tumores [15].
Recientemente, hemos encontrado que la baja expresión de ARN de doble cadena dependiente de PKR se asoció significativamente con una menor supervivencia en pacientes con CPNM, lo que sugiere que las funciones biológicas de PKR o sus moléculas de abajo podrían ser valiosos factores pronósticos en NSCLC [1]. En este nuevo estudio, nuestro objetivo fue determinar si la expresión de la proteína PKR se asocia con sus niveles de mRNA y si sus objetivos de abajo, como PKR fosforilada (p-PKR) y p-eIF2a, son también factores de pronóstico en NSCLC. Primero se determinó el nivel de expresión de proteína y ARNm en el tejido PKR CPNM recién congelado y encontramos una correlación positiva entre la expresión de la proteína PKR y los niveles de ARNm. A continuación, utilizando tinción inmunohistoquímica, se determinó la expresión de p-PKR y su bien caracterizada molécula de aguas abajo p-eIF2α en muestras de microarrays de tejidos archivados. Nuestros resultados muestran que p-PKR y p-eIF2α son biomarcadores predictivos de los resultados de NSCLC y que cuando la expresión de PKR se combinó con la expresión de p-PKR o p-eIF2α, el efecto sobre la predicción de la supervivencia del paciente se mejoró.
Resultados
expresión de la proteína PKR se correlaciona con los niveles de mRNA
Para investigar si la expresión de la proteína PKR está asociado con los niveles de ARNm, se determinó la expresión de la proteína PKR y p-PKR y PKR mRNA niveles en 36 fresca tejidos de tumores de pulmón primarios utilizando análisis de transferencia de Western y el tiempo real de RT-PCR, respectivamente. Expresión de la proteína de β-actina y sus niveles de mRNA también se determinaron y se utilizó como controles. Los resultados de los análisis de transferencia Western mostraron que las muestras tumorales expresan diferentes niveles de PKR en proteínas y los niveles de mRNA (Figura 1A y 1B). El análisis estadístico reveló una correlación significativa entre la expresión de la proteína PKR y sus niveles de mRNA. (Rho de Spearman = 0,55,
p Hotel & lt; 0,001; Figura 1C). Estos resultados sugieren que la expresión del gen de PKR puede causar de los diferentes niveles de expresión de la proteína PKR en tumores.
A. análisis de transferencia Western de PKR y de la proteína p-PKR en muestras de tumores. Un análisis densitométrico de la relación de PKR o PKR a ß-actina es representa los niveles de proteína normalizados. Cada carril representa una muestra de tumor de un paciente individual. B. niveles de mRNA de muestras correspondientes se determinaron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Los niveles de la proteína β-actina y su ARNm de la misma muestra se utilizaron como controles. C. Diagrama de dispersión de la expresión de la proteína PKR correlaciona con la expresión de ARNm (rho de Spearman = 0,55,
p Hotel & lt; 0,001).
Correlación entre p-PKR y p-eIF2α expresión de proteínas en los tumores de NSCLC con características clínico
Debido a que la función biológica de PKR está estrechamente relacionada con su fosforilación, y eIF2α fosforilación es un sello distintivo de la activación de PKR, el próximo evaluó la expresión de p-PKR y proteínas p-eIF2α en TMA muestras utilizando tinción inmunohistoquímica. La Tabla 1 resume las relaciones entre p-PKR o expresión de p-eIF2α y otras características clínico-patológicas. Alta expresión de p-PKR se relaciona con el subtipo adenocarcinomas (
p Hotel & lt; 0,001). No se observó correlación entre la expresión de p-PKR y el sexo de género, el estadio TNM o tabaquismo. También se encontró ninguna correlación entre la expresión de p-eIF2α y características clínico-patológicas. Imágenes representativas de los resultados de tinción inmunohistoquímica para p-PKR y p-eIF2α se muestran en la Figura 2. El p-PKR y proteínas p-eIF2α se expresaron en el citoplasma de las células tumorales
.
casos que expresan alta (A y C). casos que expresan bajos (B y D). No se detectó expresión de p-PKR y p-eIF2α en el citoplasma.
Correlación entre p-PKR y expresión de la proteína p-eIF2α en los tumores de NSCLC con enfermedad resultados
a fin de evaluar si la expresión de la proteína p-PKR o p-eIF2α se correlaciona con los resultados clínicos de los pacientes con CPNM, el análisis de Kaplan-Meier reveló que en la fase I y todas las etapas, los pacientes con un número relativamente elevado de p-PKR tenían una supervivencia significativamente más larga que los que tienen poco o ninguna expresión de p-PKR (Figura 3A y 3C). Para todos los pacientes de la etapa, el tiempo medio de supervivencia fue de 105 meses para los pacientes con alta expresión de p-PKR y 51 meses para aquellos con poca o ninguna expresión de p-PKR. Una asociación significativa se observó también entre la expresión de alto p-eIF2α proteínas y una mayor supervivencia en estadio I y todas las etapas (Figura 3D y 3F). No hay asociación significativa se observó entre la alta p-PKR o alto p-eIF2α expresión de proteínas y una mayor supervivencia en estadios II-IV (Figura 3B y 3E).
A-F. Kaplan-Meier de supervivencia en función de las diferencias en (A, B, C) p-PKR y (D, E, F) la expresión de P-eIF2-α en pacientes con estadio I (A, D), los estadios II-IV ( B, e) y todas las etapas (C, F) NSCLC. Las tasas de supervivencia fueron significativamente peores en los pacientes con baja p-PKR o expresión de p-eIF2α que en aquellos con alta p-PKR o expresión de p-eIF2α (Etapa I:
p = 0,01
y
p
= 0,02; Todas las etapas:.
p
= 0,03 y p
= 0,03, respectivamente)
en un análisis univariado, un riesgo proporcional de Cox modelo indicado que p-PKR y p-eIF2α tuvieron significado pronóstico (Tabla 2). En un análisis multivariado, se encontró que los p-PKR y la expresión de P-eIF2α fueron estadísticamente significativa asociada con la supervivencia (Tabla 2). Estos resultados indican que el p-PKR y la expresión de P-eIF2α son biomarcadores independientes de la supervivencia de los pacientes.
También examinaron las asociaciones entre los niveles de expresión de PKR, p-PKR, y p-eIF2α. Nuestros resultados indican que la expresión de p-PKR correlacionó significativamente con p-eIF2a expresión (rho de Spearman = 0,48,
p Hotel & lt; 0,001). expresión de PKR también se correlacionó significativamente con la expresión de p-PKR (rho de Spearman = 0,31,
p = 0,004
) y p-eIF2α (rho de Spearman = 0,45,
p Hotel & lt; 0,001). Se evaluó adicionalmente el efecto de pronóstico de la expresión combinada de p-PKR más PKR y p-eIF2α más PKR y se encontró que ambas combinaciones eran fuertes marcadores de pronóstico independiente para la supervivencia global de pacientes en la etapa I (Figura 4A y 4B) y todos los pacientes de la etapa (Figura 4C y 4D). Para todos los pacientes de la etapa, los pacientes con alta PKR y de alta p-PKR expresión tenían una mediana de supervivencia de 132 meses, que era significativamente más largo que el de pacientes con alto PKR y la expresión de p-PKR bajo (mediana de supervivencia, 80 meses; figura 4C ). Los pacientes con poca o ninguna expresión de PKR y p-PKR tuvieron una supervivencia significativamente más corta mediana (43 meses; Figura 4C). Hay una diferencia en el resultado de PKR (H) /p-PKR (H) vs PKR (L) /p-PKR (H) de los pacientes en la Figura 4A. Nuestro rango de puntuación de IHC es 0-300 para PKR y p-PKR. En el estudio actual, estamos utilizando la mediana de corte (150 para PKR y 70 para p-PKR). En la figura 4A, los pacientes 106 en estadio I divididos en cuatro grupos, 43 pacientes con alta PKR y alta p-PKR, 21 pacientes con alta PKR y baja expresión de p-PKR, 32 pacientes con baja PKR y la expresión de p-PKR y 10 pacientes con bajo PKR y alta expresión de p-PKR. Estos 10 pacientes tienen p-PKR rango de puntuación de 80-120, están muy cerca de punto de corte mediano (70), y también pueden pertenecer a baja PKR grupo p-PKR baja. Para todos los pacientes de la etapa, los pacientes con alta PKR y de alta p-eIF2α expresión tenían un tiempo de supervivencia media de 132 meses, que era significativamente más largo que el de pacientes con alto PKR más expresión de P-eIF2α bajo (mediana de supervivencia, 80 meses) y las con baja PKR más alta expresión de p-eIF2α (supervivencia media, 47 meses; Figura 4D). Por último, los pacientes con poca o ninguna expresión de ambos PKR y p-eIF2α tuvieron una supervivencia significativamente corto (supervivencia media, 35 meses; Figura 4D) mediano.
A y C. tasa de supervivencia fue significativamente más bajos pacientes con baja PKR o baja expresión de p-PKR que en aquellos con alta PKR o alta expresión de p-PKR en la etapa I (a) y todas las etapas (C) (
p = 0,001
y
p =
0,001, respectivamente). B y D. tasa de supervivencia también fue significativamente menor en los pacientes con baja PKR o baja expresión de p-eIF2α que en aquellos con alta PKR o la expresión de alto p-eIF2α en estadio I (B) y todas las etapas (D) (
p
= 0,001 y
p = 0,001
, respectivamente).
Discusión
Los resultados de este estudio muestran que los niveles de ARNm de PKR están asociados con la proteína PKR expresión en tumores de NSCLC primarios. Nuestros hallazgos sugieren que la expresión de la proteína PKR puede controlar los niveles de transcripción. Además, nuestros datos sugieren que el tiempo real de RT-PCR, un método sensible para el análisis cuantitativo de los niveles de ARNm, se puede utilizar para determinar los niveles de ARNm en muestras de biopsia y por lo tanto podría ser útil para la predicción de la supervivencia del paciente. También se encontró que los pacientes con alta expresión de p-PKR tuvieron una supervivencia promedio considerablemente más larga que aquellos con expresión de la proteína poca o ninguna p-PKR. Los resultados de diversos estudios de tumores malignos humanos han sugerido que la expresión de alto PKR indica un pronóstico favorable para los pacientes con carcinoma de células escamosas de la cabeza o el hígado [2], [16], lo que sugiere que PKR puede desempeñar un papel importante en la supresión de la progresión del tumor y afectando apoptosis [17]. También hemos estudiado las vías de PKR y hemos encontrado que son claramente necesarios para inducir la apoptosis en algunas células de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, después de ciertos tratamientos como el melanoma gen 7 diferenciación asociada (
mda7
), E2F-1 y TNF [18], [19]. Más recientemente, nosotros y otros demostraron que algunos compuestos pequeños pueden inducir apoptosis PKR dependiente tanto en las células cancerosas y los fibroblastos murinos embrionarios [20], [21], lo que indica que la modulación de la actividad de PKR podría ser un enfoque interesante para la terapia del cáncer. Nuestro hallazgo de que las células tumorales de NSCLC que expresan un alto nivel de p-PKR se correlacionan con un pronóstico favorable es consistente con observaciones anteriores de que la activación de PKR está asociado con la inducción de apoptosis.
Nuestros resultados también demostraron que los pacientes con alta expresión de tanto PKR y p-PKR tenían una supervivencia significativamente mayor que aquellos con otras combinaciones de los niveles de expresión, incluyendo los positivos para PKR y negativo para p-PKR y los negativos para ambos PKR y p-PKR. Nuestra observación de que 53% de las muestras tumorales de NSCLC altamente expresado PKR y que 61% de ellos altamente expresado p-PKR [datos no mostrados] Estos resultados nos llevó a especular que la expresión de PKR (es decir, PKR) y la activación de PKR (es decir, p -PKR) se ven afectados por las diferencias de expresión del activador de PKR o un inhibidor de PKR. Otros investigadores han informado de que la función de la PKR puede ser regulada por las proteínas celulares, ya sea positiva (por ejemplo, MDA-7 /interleucina-24 y PKR-activación de la proteína [PACT]) o negativamente (por ejemplo, p58IPK, nucleophosmin y proteínas de choque térmico 90 y 70) [18], [19]. En estudios futuros, vamos a tratar de determinar qué activadores e inhibidores de PKR afectan a la vía de señalización de PKR en muestras de tumores de NSCLC.
Hemos observado que los tumores con elevada expresión de p-eIF2α tuvieron una supervivencia promedio considerablemente más larga. En adicional, hemos demostrado que los pacientes con altas expresiones de ambos PKR y p-eIF2α también tuvieron una supervivencia significativamente mayor que aquellos con otras combinaciones de los niveles de expresión. Nuestra conclusión de que el 47% de las muestras tumorales tenía la expresión de PKR baja y el 27% tenían una expresión de alto p-eIF2α [datos no mostrados]. Estos resultados sugieren que la fosforilación eIF2α en algunos tumores de NSCLC se produce independientemente de la vía de PKR. Además de PKR, tres quinasas eIF2α diferentes que pueden phosphorylate eIF2α en respuesta a diversas condiciones de estrés han sido identificados: inhibidor de hemo-regulado, el homólogo de
proteína de Saccharomyces cerevisiae
quinasa control general no derepressible-2 y ARN retículo endoplásmico dependiente de la proteína-quinasa (ER) quinasa (PERK, también conocida como páncreas eIF2α quinasa) [13]
En conclusión, nuestros datos sugieren que los /eIF2α fosforilados PKR /fosforilados PKR vía de señalización. desempeña un papel importante en el pronóstico para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). las actividades de la vía PKR pueden ser útiles para predecir los resultados de NSCLC, y la modulación de las actividades de la vía PKR podría ser una opción de tratamiento potencial NSCLC.
> Pacientes y tejidos
pacientes con CPNM que eran sometidos a resección radical de su cáncer primario en la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center entre 2007 y 2008 se utilizaron para este estudio basado en la disponibilidad. Los pacientes fueron excluidos del estudio si habían sido sometidos previamente a radioterapia o quimioterapia para el cáncer. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de sus tejidos, y el estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional (Universidad de Texas, MD Anderson Cancer Center). Después de ser resecado quirúrgicamente, cada tumor fresco se dividió inmediatamente en dos porciones; uno fue inmediatamente congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido para proteínas y ARN extracción, y la otra se fijó con formalina y embebidos en parafina para la evaluación histopatológica de rutina y diagnóstico. Los tejidos con un contenido de célula tumoral estimado de 70% o más se utilizaron para los análisis moleculares. Además de los tejidos de nuestros pacientes, se obtuvieron 193 NSCLC microarrays de tejidos (TMA) muestras (114 adenocarcinomas y 74 carcinomas de células escamosas) entre 1997 y 2001 del Programa Especializado de cáncer de pulmón de Investigación de Excelencia Banco de Tejidos en el MD Anderson Cancer Center (Houston , TX). Todos los especímenes se examinaron histológicamente y se clasificaron utilizando el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud de 2004 [22]. En la mayoría de los casos, la información clínica y patológica detallada, incluyendo datos demográficos de los pacientes, antecedentes de tabaquismo, y la supervivencia general más la estadificación TNM enfermedad y tiempo hasta la recurrencia, que estaba disponible (Tabla 1).
Análisis de transferencia Western
Los tejidos tumorales congeladas se preparared inicialmente por ser lavados dos veces en PBS frío. Aproximadamente se homogeneizó 20 mg de tejido de cada muestra fresca en 0,5 ml de tampón enfriado con hielo de lisis (1% de NP40, HEPES 50 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, MgCl 1,5 mM
2, mM NaF 100, 1 mM EGTA, mM Na 1
3Vo
4, 10% de glicerol, y 10 mM Na pirofosfato de [Roche Applied Science]), que contiene inhibidor de la proteasa y fosfato recién añadido. Los lisados se centrifugaron a 14.000 g en una microcentrífuga a 4 ° C durante 10 min, y los sobrenadantes resultantes se usan como extractos de tejido. Los extractos, equivalente a 60 mg de la proteína total, se separaron mediante el uso de un 10% de gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con TBS que contenía 5% de leche sin grasa seca y después se sondearon en PBS que contenía suero bovino 5%. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: conejo anti-PKR (K-17; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-p-PKR (pT446) (Epitomics), de conejo anti-p-eIF2a (Epitomics), y el ratón anti-β-actina (Sigma). Las bandas inmunorreactivas se detectaron y cuantificaron usando un sistema de imágenes por infrarrojos Li-Cor Odyssey.
transcripción inversa y en tiempo real cuantitativa absoluta de la cadena de transcripción inversa-reacción de polimerasa (Real-Time AqRT-PCR)
el ARN total (1 g) de cada muestra clínica congelado se extrajo utilizando un kit de extracción de Trizol (Invitrogen) y transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l mediante el uso de reactivos Taqman con transcripción inversa (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADNc se diluyeron y se cuantificaron para la expresión de PKR utilizando en tiempo real de RT-PCR (SYBR Green I) (realizado por Ziren Research LLC, Irvine, CA). Un único estándar fue incorporado para determinar la proporción absoluta de expresión de cada gen diana y de referencia, como se describe anteriormente [23]. El primer secuencias de PKR fueron los siguientes: adelante, 5'-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 ', e inverso, 5'-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3'
tinción inmunohistoquímica y Evaluación
Los anticuerpos utilizados. para el análisis de transferencia Western también se usaron para la tinción inmunohistoquímica. Fijado en formol e histología secciones de tejidos embebidos en parafina (5-m de espesor) se deparaffinized, hidratado y se calienta en un vapor durante 10 minutos con 10 mmol /l de citrato de sodio (pH 6,0) para la recuperación de antígenos. La peroxidasa se bloqueó con 3% de H
2O
2 en metanol a temperatura ambiente durante 15 min, seguido de incubación en 10% de albúmina de suero bovino en TBS-T durante 30 min. Los portaobjetos se incubaron junto con el anticuerpo primario en diluciones 1:100 por 65 min a temperatura ambiente. Después de ser lavado con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario marcado con biotina durante 30 min. Finalmente, las muestras se incubaron con estreptavidina-peroxidasa a una dilución de 1:40 durante 30 min. Las muestras fueron teñidas con 0,05% 3 ', tetrahidrocloruro de 3-diaminobencidina preparado en 0.05 mol /L de tampón Tris (pH 7,6) que contiene 0,02% H
2O
2 y, posteriormente, por contraste con hematoxilina. Como control positivo, se utilizaron fijado con formalina y los tejidos del pulmón incluidos en parafina con epitelios bronquiales normales. Como control negativo, se utilizaron muestras de tejido no incubadas con el anticuerpo primario. La tinción inmunohistoquímica se cuantificó por dos patólogos independientes (Dres. Raso y Pataer) con una puntuación de intensidad de cuatro valor descrito anteriormente [1].
Análisis estadístico
La mediana se utilizó como punto de corte para p-PKR y p-eIF2a. Los biomarcadores se dicotomizadas en grupos de bajo y de alto nivel de la siguiente manera: p-PKR: bajo (score≤70), alta (score & gt; 70); y p-eIF2a: bajo (score≤150), alta (score & gt; 150). En el análisis univariante, muestra independiente
t
y
X
2
pruebas se utilizaron para analizar las variables continuas y categóricas, respectivamente. la probabilidad de supervivencia en función del tiempo se calcula utilizando el estimador de Kaplan-Meier. Se utilizó la prueba de log-rank para las comparaciones entre los grupos de tiempo de supervivencia de los pacientes. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para calcular la influencia de p-PKR y la expresión de P-eIF2a en el tiempo de supervivencia, con los ajustes realizados para los parámetros clínicos e histopatológicos (edad, sexo, estado de fumar y subgrupo histológico del tumor. La prueba bilateral era utilizado para probar la misma proporción entre los grupos en las tablas de contingencia bidireccionales El enfoque de estimación de ecuaciones generalizadas se utilizó para estimar las diferencias en las medias para los datos de significación estadística se estableció en p & lt;... 0,05
Reconocimientos
agradecemos Markeda Wade para su revisión editorial. agradecemos a Denise M. Woods y Lakshimi Kakarala por su asistencia técnica.