Extracto
De los aproximadamente 565,650 personas en los EE.UU. que morirán de cáncer en 2008, casi todos se tienen metástasis. Mama, próstata, riñón, tiroides y cánceres de pulmón hacen metástasis en el hueso. Las células tumorales residen dentro del hueso mediante receptores de adhesión celular tipo integrina y provocan dolor incapacitante ósea y fracturas. En particular, los tumores de próstata humana metastásicas expresan y escinden la A6 integrina, un receptor para componentes de la matriz extracelular del hueso, es decir, la laminina 332 y laminina 511. Más del 50% de todos los pacientes de cáncer de próstata a desarrollar dolor óseo severo durante su vida restante. Un objetivo importante es prevenir o retrasar cáncer inducido dolor óseo. Se utilizó un novedoso modelo de xenoinjerto de ratón para determinar directamente si el dolor de huesos podrían prevenirse mediante el bloqueo de la escisión conocido del receptor de adhesión integrina A6. Se colocaron las células tumorales humanas que expresan o bien el tipo salvaje o mutado integrina A6 dentro de la matriz del hueso de estar y 21 días más tarde, se confirmó la expresión de la integrina por RT-PCR, se recogieron las radiografías y las mediciones de comportamiento de dolor espontáneo y evocado a cabo. Todos los animales independientes de la condición de la integrina tenían carga tumoral indistinguibles y desarrollaron la pérdida ósea 21 días después de la cirugía. Una comparación de los animales que contenían el tipo salvaje o la integrina mutado reveló que las células tumorales que expresan la integrina mutado resultaron en una disminución dramática en la pérdida ósea, fracturas unicorticales o bicorticales y una disminución en la capacidad de las células tumorales para llegar a la placa de crecimiento del hueso. Además, las células tumorales dentro del hueso que expresan la mutación integrina prevenir el cáncer inducido por retroceden espontáneo, alodinia táctil, y el movimiento evocados dolor. La prevención de la escisión de la integrina A6 en la superficie de células tumorales de próstata se redujo la migración de células tumorales dentro del hueso y la aparición y el grado de dolor de huesos y fracturas. Estos resultados sugieren que las estrategias para bloquear la escisión de los receptores de adhesión en la superficie de células tumorales puede prevenir de manera significativa el cáncer inducido por dolor en los huesos y la progresión lenta de la enfermedad dentro del hueso. Dado que la escisión de la integrina está mediada por tipo uroquinasa activador del plasminógeno (uPA), un trabajo adicional se justifica para probar la eficacia de los inhibidores de uPA para la prevención o el retraso de cáncer inducido por dolor óseo
Visto:. Rey TE, Pawar SC, Majuta L, Sroka IC, Wynn D, Demetriou MC, et al. (2008) El papel de la integrina alfa 6 Migración en el cáncer de próstata y dolor de huesos en un modelo de xenoinjerto Novel. PLoS ONE 3 (10): e3535. doi: 10.1371 /journal.pone.0003535
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: 27 Junio, 2008; Aceptado: September 26, 2008; Publicado: 28 Octubre 2008
Derechos de Autor © 2008 King et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado en parte por el NIH subvenciones CA56666, CA23074, y GM008718. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
de los aproximadamente 565,650 personas en los EE.UU. que morirán de cáncer en 2008, casi todos ellos tendrán metástasis [1]. Mama, próstata, riñón, tiroides y cánceres de pulmón hacen metástasis en el hueso. Las células tumorales dentro de la médula provocan osteolíticas y osteoblásticas reacciones y dolor de huesos y fracturas incapacitante [2], [3]. Un objetivo importante es prevenir o retrasar cáncer inducido dolor óseo. tumores de próstata humanos invasivas y metastásicas expresan integrina A6B1, un receptor para componentes de la matriz extracelular del hueso, es decir, la laminina 332 y laminina 511 [4] - [10]
cáncer de próstata humana es una enfermedad indolente caracterizado por. cambios progresivos de adhesión durante la transición de las glándulas normales a prostática neoplasia intraepitelial (PIN) para el cáncer invasivo [5], [16] - [19]. Trabajos recientes han demostrado alteraciones en la organización y las moléculas de adhesión de tejidos de próstata humanos normales durante la progresión del tumor de próstata [5], [15]. Escape de la glándula de la próstata y la invasión a través de la cápsula se asocia con un mal pronóstico, mientras que la enfermedad es tratable confinado. Las alteraciones en las moléculas de adhesión y las consecuencias de señalización corriente abajo puede dar cuenta de la invasión estimulada de las células tumorales de su sitio de origen. Las integrinas son receptores de adhesión celular heterodímero transmembrana [15]. integrina expresión dentro de la glándula próstata normal refleja la diversidad de los componentes de la matriz extracelular. Los patrones normales de expresión de la integrina se mantienen en lesiones en las que las células basales normales retenidos y la invasión no ha ocurrido (es decir, lesiones PIN) [5], [16] - [19]. Sin embargo, dentro de los carcinomas invasivos, la mayoría de las subunidades de integrina se no se observa en las superficies de células tumorales. Una excepción notable a la pérdida generalizada de la expresión de la integrina es la expresión persistente de los receptores de laminina, A3 (10% de los casos) y A6 (69% de los casos) integrinas, observado en el carcinoma de próstata humano invasivo obtuvieron después de la prostatectomía radical [5], [17]. Los estudios indican que los receptores de laminina A6B1 y a3b1 se mantienen en la mayoría de los carcinomas de próstata. Durante el PIN humana de transición carcinoma de próstata, A6B4 expresión de la integrina se pierde y la integrina A6B1 predomina en cáncer de próstata humano invasivo y en lesiones metastásicas [4], [6]. Numerosos estudios han implicado a las integrinas A6 en la progresión del cáncer [20]. Los ligandos extracelulares de A6B1 se laminina 332 y 511, los componentes destacados de la médula ósea humana y de ratón [7], [21].
Una inspección de la A6B1 expresión de la integrina en las células tumorales de próstata revela una variante estructural de la novela la superficie celular llamado A6pB1 [11], [14], [22]. La subunidad integrina A6 se escinde en un medio en la superficie de células tumorales en los residuos de aminoácidos específicos que resultan en la pérdida del dominio beta barril y dejando el resto del receptor intacto [12]. células de tumor de próstata que expresan un receptor mutado que no puede ser escindido, resultaron en una inhibición de la migración de células tumorales en la laminina 332 en condiciones de cultivo de tejido [13].
En este estudio, se determinó si la integrina escisión afectaría de células tumorales la migración dentro de un sitio de metástasis clínicamente relevantes, tales como el hueso. Se utilizó un nuevo modelo de xenoinjerto de ratón de dolor de huesos para determinar directamente los efectos de las células tumorales humanas colocados dentro de la matriz de hueso vivo sobre el cáncer inducido por dolor de huesos. La médula ósea es rica en laminina 332 (laminina 5) y laminina 511 (laminina 10) [8], [9], los ligandos para la integrina A6B1 [7]. Además, la prueba de la influencia sobre el cáncer inducido por dolor en los huesos ya que el trabajo anterior implicado fuertemente integrinas en el mantenimiento del dolor neuropático [23].
Resultados
De acuerdo con ello, se utilizó el PC3N-A6-WT y células de cáncer de próstata PC3N-A6-RR que expresan niveles equivalentes de la subunidad A6 de tipo salvaje (escindible a A6p a través del tratamiento de uPA) y la subunidad no escindible, respectivamente (Fig. 1a). Los niveles de expresión superficial de los receptores fueron equivalentes como se determina por citometría (FACS) el análisis de flujo (Fig. 1b). La capacidad de escindir el receptor de tipo uroquinasa activador del plasminógeno (uPA) y la generación de la variante estructural A6p se muestra esquemáticamente (Fig. 1c). Estamos próximos a prueba las propiedades funcionales de A6 integrina usando una matriz que contiene laminina 111, matrigel, modificado para contener laminina 332. Matrigel es una rica matriz extracelular laminina que los modelos condiciones fisiológicamente relevantes [24]. Las células PC3N-A6-WT migraron dentro de matrigel de una manera que se integrina dependiente (Fig. 1d). Las células que contienen el receptor uncleavable, PC3N-A6-RR, no fueron capaces de migrar en matrigel, en consonancia con los resultados anteriores utilizando condiciones de cultivo de tejidos de rutina (Fig. 1d) [13].
(A) La expresión de la longitud completa 6 integrina (6) y la producción de uPA dependiente de la variante 6p (6p) se determinó por análisis de transferencia Western. estado de la integrina en los lisados de células totales a partir de la doxiciclina (Dox) o uroquinasa (uPA) sin tratar (-) y tratados (+) se determinó líneas celulares PC3N-A6-RR PC3N-A6-WT y. (B) expresión en superficie de tipo salvaje y mutado integrina 6 en doxiciclina inducida PC3N-A6-WT y células PC3N-A6-RR se determinó por citometría de flujo. células PC3N-A6-WT y PC3NA6- RR se incubaron con anticuerpo J1B5 A6 anti-integrina rata primaria seguida por Alexa 488 anticuerpo anti-rata y se visualizaron utilizando la BD FACScan. El pico gris indica señal de fluorescencia de único anticuerpo secundario. (C) Esquema para ilustrar la escisión de la forma de longitud completa de la integrina 6 para producir la variante de 6p. Se muestra la definición de la células PC3N-A6-RR PC3N-A6-WT y con respecto al estado de la integrina. mediada por la migración (D) de las células integrina PC3N-A6-WT (paneles superiores) y células PC3NA6- RR (paneles inferiores) en matrigel. Las células se colocaron en matrigel en presencia de un cubreobjetos para crear una zona libre de células en la superficie matrigel. Después de la adhesión celular fue completa, los cubreobjetos se retiraron de la superficie de Matrigel para permitir la migración hacia la zona libre de células indicado por blanco o negro línea curva. Las células migración ocurrió en condiciones óptimas de crecimiento a 37ºC durante aproximadamente 18 horas. Las células se dejaron ya sea para migrar en ausencia (paneles de la izquierda) o presencia (paneles de la derecha) de la integrina bloqueo AIIB2 anticuerpo. Las imágenes se recogieron usando un microscopio Zeiss Axiovert equipado con un objetivo 2.5X.
Con el fin de determinar el efecto de las células de cáncer de próstata humanos dentro del hueso, se adaptó el modelo murino Clohisy-Mantyh en el que el cáncer células se inyectaron directamente y sellados en el fémur de un ratón [25]. ratones SCID machos fueron anestesiados con ketamina /xilazina y una artrotomía se realizó la exposición de los cóndilos del fémur distal tal como se describe anteriormente [26]. Se perforó un orificio en el fémur para la aguja de inyección para asegurar la colocación precisa de las células tumorales dentro del hueso. La colocación exacta de la aguja en el espacio intramedular del fémur fue confirmado por formación de imágenes (Fig. 2a, panel izquierdo). Las células tumorales de próstata humano se inyectaron en la pierna derecha del ratón y el lugar de la inyección sellado con la amalgama dental (Fig. 2a, panel derecho).
Se tomaron (A) imágenes radiográficas para verificar la colocación de la aguja en el interior del intramedular el espacio del fémur hasta el tercio distal del hueso (panel izquierdo). Las células tumorales fueron sellados en el hueso (panel derecho). (B) las imágenes radiográficas tomadas a los 21 días después de las inyecciones que indican la pérdida de hueso, ya sea a partir de ratones no tratados (control) o ratones inyectados con células tumorales que expresan la integrina de tipo salvaje (PC3N-A6-WT) o la integrina mutado (PC3N-A6-RR). (C) Cuantificación de la pérdida ósea en animales, ya sea simulada inyectados (Control) o inyectados con células tumorales que expresan la integrina de tipo salvaje (PC3N-A6-WT) o la integrina mutado (PC3N-A6-RR). La pérdida de hueso se evaluó según la siguiente escala de 5 puntos: 0 = normal, 1 = pérdida ósea observada en menos de la mitad de la tercera distal del hueso, 2 = pérdida ósea observada en más de la mitad de la tercera distal del hueso, ninguna fractura, 3 = espesor total pérdida de masa ósea que indica unicortical fractura ósea unicortical, 4 = pérdida de masa ósea bicortical de espesor total que indica fractura ósea bicortical. (D) El porcentaje de ratones con fractura de 21 días después de la cirugía. El número de ratones en cada grupo tenía doce años.
Se determinó siguiente, los efectos nocivos de las células tumorales que residen dentro del hueso utilizando imágenes radiográficas estándar en animales vivos 21 días después de la cirugía. Todos los animales inyectados con PC3N-A6-WT y células PC3N-A6-RR desarrollaron pérdida ósea 21 días después de la cirugía (Fig. 2b). Imágenes mostraron consistentemente actividad osteolítica, en particular del hueso metafisario en el extremo distal (rodilla) del fémur. Los ratones inyectados con las células PC3N-A6-WT que muestra dramáticamente más la pérdida ósea en comparación con los inyectados con las células PC3N-A6-RR. No se observó pérdida de hueso en los animales inyectados con medio solo (Fig 2b). Los animales inyectados con las células PC3N-A6-WT mostraron una mayor pérdida de masa ósea en comparación con los inyectados con células PC3N-A6-RR (Fig. 2B). Las radiografías fueron clasificados de acuerdo a una escala de 4 puntos en la que 0 indica que el hueso normal y 3 indica espesor total pérdida de masa ósea bicortical (Fig. 2c). Los animales inyectados con células PC3N-A6-WT mostraron un aumento dramático en fracturas (unicorticales o bicorticales) 21 días después de la cirugía en comparación con los ratones-A6-RR PC3N tratados (Fig. 2d). Estos datos indican que la colocación de las células tumorales dentro del hueso que contiene un no escindibles resultados integrina A6 en un retraso significativo en el desarrollo de la pérdida de hueso.
Aunque los resultados de las imágenes proporcionan información acerca de la destrucción ósea severa, lo hizo no dar una información directa acerca de la distribución de las células tumorales. La pérdida de hueso es consecuencia, en parte, de las células tumorales residentes dentro del hueso; un evento que afecta dramáticamente el equilibrio crítico de osteolítica y la actividad osteoblástica [3]. Nuestros determinó la distribución de las células tumorales en el hueso utilizando el análisis histológico por hematoxilina y eosina de especímenes descalcificadas. Los huesos de ratón se orientan cuidadosamente para seccionamiento longitudinal para incluir la observación de la placa epifisaria, así como la región distal del hueso en la misma sección (Fig. 3A, panel superior). El análisis de los huesos de los animales inyectados tumorales demostró presencia de tumor en todo el espacio intramedular del hueso en los inyectados con células PC3N-A6-WT junto con invasión en el hueso cortical (Fig. 3A, panel central). Las células tumorales que contienen la integrina escindible habían llegado a la placa de crecimiento; la médula ósea fue reemplazado por completo. Este resultado es consistente con el conocimiento de que una vez que el cáncer de próstata se ha establecido en la médula ósea con el tiempo reemplazar la médula, la interrupción de la homeostasis ósea [3]. Por el contrario, PC3N-A6-RR animales inyectados contenían células tumorales en la diáfisis de la región del hueso y el tumor no pudo llegar a la placa de crecimiento. Normales de la médula ósea estaba presente en las zonas que no contenían células tumorales (Fig. 3A, panel inferior). Las células tumorales dentro de la región del eje medio o los que habían llegado a la placa de crecimiento eran viables y morfológicamente indistinguibles. (Fig. 3A, el centro y el panel inferior, inserciones). El patrón de distribución tumor se encontró que era consistente en el análisis histológico de todos los animales de prueba ensayadas.
(A) tinción con hematoxilina-eosina del hueso normal (control) o el hueso inyectado con células PC3N-A6-WT (WT, panel central y el recuadro) y las células PC3N-A6-RR (RR, y la parte inferior del panel de inserción). La placa de crecimiento del hueso (placa de crecimiento) se orienta en la parte superior izquierda de cada panel, a efectos comparativos. análisis (B) RT-PCR para detectar la expresión de la integrina 6 mutado en la médula ósea. Veintiún días después de la inyección, se recogió la médula ósea, se extrajo el ARN y se analizaron. ARN de las células PC3N-A6-WT y células PC3N-A6-RR que crecen en cultivo de tejido se comparó con la médula ósea aisladas de ratones inyectados con células PC3N-A6-WT (células de médula ósea-WT) o células PC3NA6- RR (hueso Las células de médula-RR). amplificación GAPDH se llevó a cabo como control y los marcadores KB se como se muestra.
Con el fin de confirmar que las células tumorales inyectadas estaban expresando la integrina mutado, 21 días después de la inyección de PC3N-A6-WT o células PC3N-A6-RR, la médula se expresó desde el espacio intramedular de los fémures de ratón. Análisis de muestras de médula ósea resultó en ARNm específico para las células PC3N-A6-RR en la médula de los ratones inyectados con PC3N-A6-RR, pero no PC3N-A6-WT ratones. Estos datos indicaron que las células transfectadas con PC3N la integrina A6 uncleavable mantienen la expresión de la integrina mutante dentro del espacio intramedular del fémur y estaban presentes 21 días después de la inyección de las células en el fémur (Fig. 3B).
análisis del comportamiento de dolor espontáneo y evocado se determinaron 21 días después de la inyección de las células PC3N-A6-RR PC3N-A6-WT o en el fémur para evaluar el papel de la escisión de A6 integrina en el desarrollo de espontáneo y evocados comportamientos de dolor de cáncer. El dolor espontáneo se midió mediante la evaluación de que retroceden del cáncer tratado extremidad posterior como se describe anteriormente [26]. Los ratones inyectados con células PC3N-A6-WT mostraron aumento de comportamiento de elevación espontánea en comparación con los ratones tratados PC3N-A6-RR que demostraron niveles bajos de retroceden que fueron comparables a los animales de control (Fig. 4a). dolor evocado, como se indica por la alodinia táctil, se determinó por retirada de la pata de sondeo de la pata trasera ipsilateral al fémur tratada cáncer con filamentos de von Frey calibrados como se describe anteriormente [26]. Los ratones inyectados con las células PC3NA6-WT mostraron alodinia táctil como se indica por disminuir el umbral de retirada de la pata de filamentos de von Frey (Fig. 4b). Por el contrario, PC3N-A6-RR ratones inyectados no mostraron alodinia táctil, con umbrales de retiro de la pata similares con los animales control (Fig. 4b). movimiento dolor evocado fue determinada por la calificación de la utilización de las extremidades durante el movimiento ambulatorio normal, como se describe anteriormente [26]. Los ratones inyectados con células PC3N-A6-WT movimiento desarrollado el dolor provocado mientras que los ratones inyectados con células PC3N-A6-RR no mostraron movimiento dolor evocado, con el uso del miembro clasificaciones de la misma forma que los animales de control (Fig. 4C).
(a) el dolor espontáneo, medido por pestañear de la extremidad posterior ipsilateral se determinó en sham inyectado animales (control) o los inyectados con células tumorales que expresan la integrina de tipo salvaje (PC3N-A6-WT) o los inyectados con células tumorales que expresan la mutado integrina (PC3N-A6-RR). La elevación en pestañear comportamiento es indicativo de un aumento de la respuesta de dolor. (B) la alodinia táctil medida por retirada de la pata a partir de filamentos de von Frey en sham inyectado animales (control) o los inyectados con células tumorales que expresan la integrina de tipo salvaje (PC3N-A6-WT) o los inyectados con células tumorales que expresan la integrina mutado (PC3N-A6-RR). Una disminución en el umbral de retirada es indicativo de un aumento de la respuesta de dolor. (C) Movimiento evocados se observó dolor en sham inyectado animales (control) o los inyectados con células tumorales que expresan la integrina de tipo salvaje (PC3N-A6-WT) o los inyectados con células tumorales que expresan la integrina mutado (PC3N-A6-RR) .
Estos datos indican que la escisión de la integrina A6 influyó en el desarrollo de la tendencia espontánea cancerinduced y evocó el dolor asociado con la pérdida ósea y fracturas. La prevención de la escisión de la integrina A6 reduce drásticamente la pérdida ósea y el desarrollo del dolor cancerinduced. En cambio, la expresión de la integrina escindible A6 aumentó cancerinduced pérdida de masa ósea y la fractura con un aumento simultáneo de la conducta del dolor.
Discusión
En este estudio hemos explotado un modelo de hueso de inyección directa para colocar específicamente humana células de tumor de próstata directamente en el medio ambiente de hueso fisiológicamente y clínicamente relevante, rica en laminina 332 y 511. Esto nos permitieron determinar si el bloqueo de la producción de un receptor de laminina (A6pB1) alteraría la capacidad de las células tumorales para migrar o modificar el entorno dentro de el hueso y si este celebrada importancia funcional en términos de dolor de huesos.
los resultados mostraron que la modificación de la producción del receptor A6pB1 laminina en la superficie de células tumorales puede dificultar notablemente la migración dentro del hueso. El modelo de inyección directa permite la colocación precisa de un número conocido de células tumorales dentro del hueso. Dado que las células tumorales crecen igualmente bien independiente del estado de la integrina [13], [27] (tanto en cultivo de tejidos y como tumores humanos en ratones), los datos sugieren que la distribución de las células tumorales dentro del hueso puede ser un elemento clave que influye cáncer inducido dolor de huesos. La incapacidad de las células tumorales para llegar a la región de las epífisis de los huesos debido a la integrina estado coincidió con una disminución notable de tres mediciones de dolor de comportamiento distintos. Si bien se desconoce actualmente si la localización de las células tumorales dentro de los huesos y dolor en los huesos estaban vinculados funcionalmente, otros informes han indicado que dentro del hueso, microambientes son lo suficientemente distintas como para justificar esta posibilidad [28].
Es posible que el dolor de huesos disminuida se debe a la incapacidad de la integrina a escindir, independiente de la localización de las células tumorales dentro de la médula. Las integrinas y cadherinas se escinden o arrojan sobre superficies de células tumorales [29] - [32]. Los fragmentos liberados de los receptores sometidos a escisión ectodominio son biológicamente activos y pueden contribuir al cáncer inducido por dolor óseo [33]. Otros experimentos serán distinguir entre estas posibilidades.
A pesar de las metástasis óseas son consideradas tradicionalmente como ser osteolítica o osteoblástica, análisis morfológicos han puesto de manifiesto que, en la mayoría de los pacientes, las metástasis óseas tienen tanto osteolíticas y osteoblásticas elementos [38]. En pacientes con cáncer de próstata, las metástasis óseas mostrar con frecuencia fenotipo más osteoblástica, aunque algunos pacientes tienen lesiones osteolíticas similares a los observados en pacientes con cáncer de mama metastásico [38]. Esta investigación se centró en una línea celular de cáncer de próstata humano que produce la remodelación ósea osteolítica principalmente en la médula del ratón. La incapacidad de la integrina que se escinde como resultado la pérdida ósea reducida y la fractura. Como la mayor parte la pérdida ósea y la fractura se observan en el extremo distal del hueso, la incapacidad de las células tumorales para llegar a la región de las epífisis del hueso puede haber reducido la pérdida de masa ósea y la fractura en esa zona. se necesitan más estudios sobre el papel de las integrinas en la remodelación ósea osteoblástica para determinar si la alteración de la función integrina también alterará reacciones osteoblásticas en los huesos.
Finalmente observamos que la destrucción ósea inducida por el cáncer está asociado con severa reducción de la calidad de la vida derivada de complicaciones tales como la hipercalcemia, fractura de huesos y dolor incapacitante. Los avances en la detección y tratamiento del cáncer están extendiendo la esperanza de vida de pacientes con cáncer y está aumentando un enfoque en la mejora de la calidad de vida del paciente. Tanto el uso del nuevo modelo de ratón con xenoinjerto para el estudio de la prevención del cáncer inducido por dolor en los huesos y la orientación receptores de adhesión en la superficie de las células tumorales para el hueso debería afectar significativamente la calidad de vida de los pacientes con enfermedad metastásica.
Materiales Métodos y
líneas celulares de cáncer de próstata humano
las células PC3N fueron transfectadas con plásmidos que contienen ya sea de tipo salvaje o la integrina A6 mutado como se describe anteriormente [13]. Los clones estables (PC3N-A6-WT que expresan de tipo salvaje A6 integrina y PC3N-A6-RR expresar la A6 integrina no escindible) se aislaron y se mantuvo a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2. células PC3N-A6-WT y PC3N-A6-RR se cultivaron en Modificado medio de Iscove de Dulbecco (IMDM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) más suero bovino fetal al 10% (FBS) en presencia de 6 g /ml Blasticidin ( Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 1 g /ml de zeocina (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.)
Los anticuerpos y sustancias químicas
Los anticuerpos fueron los siguientes:. J1B5, rata monoclonal anti-integrina A6 (Dr. Caroline Damsky, Universidad de California, San Francisco, EE.UU.) [34]; AA6A policlonal de conejo anti-A6 anticuerpo de integrina [13] y AIIB2, monoclonal de rata anti-anticuerpo B1 integrina [35] (American Type Culture Collection). EGF humano recombinante se adquirió de Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU.. La uroquinasa se adquirió de Chemicon (Temecula, CA, EE.UU.).
Immunoblotting
Las células se cultivaron hasta la confluencia y después se lavaron tres veces con tampón HEPES y se lisaron en RIPA frío tampón más inhibidores de la proteasa (PMSF , 2 mM; leupeptina y aprotinina, 1 g /ml). Los lisados se sometieron a ultrasonidos brevemente en hielo antes de ser suspendido en 2 x tampón de muestra no reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos, y después de un enfriamiento rápido en hielo, que se cargaron en un 7,5% de SDS-PAGE. Las proteínas se resolvieron en el gel se electrotransfirieron a Millipore membrana Immobilon-P de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), se incubaron con anticuerpos Western Blot más anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y se visualizaron por quimioluminiscencia sistema de detección (ECL Western Blotting , Amersham, Arlington Heights, IL, EE.UU.).
Ensayo de Migración Matrigel
placas de seis pocillos se recubrieron con 1 ml de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) y se complementó con la laminina 332 que contiene condicionada medio de las células HaCaT en relación 2:01 y se dejó solidificar. Un cubreobjetos circular estéril se coloca en el centro. Las células fueron sembradas en las placas y se permite que se adhieran durante 2 horas a 37 grados C. Se eliminaron el uso de células no adherentes y luego se retiraron los cubreobjetos dejando una zona despejada en el centro de la placa. La periferia de esta zona fue marcado. Se añadió medio libre de suero o medio libre de suero con bloqueo de anticuerpos a las células y se dejó incubar a 37 grados C durante 18 horas. 1 ng /ml de EGF se añadió a los medios para inducir la migración. Se observaron las células usando un microscopio Zeiss Axiovert (2,5 aumentos) y las imágenes fueron obtenidos mediante una cámara CCD.
Cirugía
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Universidad de Arizona cuidado animal institucional y el empleo comisión, IACUC protocolo#06-081. Los animales fueron anestesiados con ketamina /xylacine y una artrotomía se realizó la exposición de los cóndilos del fémur distal. Se perforó un orificio en el fémur, y se insertó la aguja en el agujero. imágenes Faxitron se tomaron en 2 planos para verificar la colocación de la aguja dentro del espacio intramedular del fémur. células PC3N-A6-WT, o PC3N-A6-RR, 10
6 en 5 ul de medio de filtrado mínimo esencial (MEM) que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA), o 5 ul de MEM filtrada que contiene 1% de BSA solo (control) fue inyectado en el espacio intramedular del fémur de ratón de la pierna derecha y el lugar de la inyección se selló con amalgama dental. Para los siguientes experimentos animales recibieron 12 PC3N-A6-WT, 12 recibieron células PC3N-A6-RR, y 12 animales recibieron suero libre de células (control).
medidas de comportamiento Dolor [26]
Movimiento dolor evocado
. El ratón se coloca en una cubeta vacía y ratón observó mientras camina por la sartén con un movimiento continuo. Cojeando y /o vigilancia de la conducta de la derecha (el cáncer inyectada) de las extremidades posteriores se calificó en la siguiente escala: 0 = completa falta de uso, 1 = no utilización parcial, 2 = cojera y guardando, 3 = cojera, 4 = caminar normal.
El dolor espontáneo
. Para evaluar pestañear y guardando el comportamiento, los animales se colocaron en cámaras de plexiglás planteadas con un piso de malla de alambre para la observación de pestañear y protegiendo de la extremidad posterior derecha. Los ratones se les permitió aclimatarse a la cámara durante 20 minutos. Que guardan y que retroceden los comportamientos de cada ratón se midieron durante 2 minutos. Se contó el número de estremecimientos, y el tiempo dedicado a la vigilancia del pie (pie se levanta del suelo) se midió.
hipersensibilidad táctil (alodinia)
. los umbrales de retirada de la pata a partir de filamentos de von Frey se determinaron de la manera descrita por Chaplan et al. se determinó umbral [36] retirada de la pata en respuesta a sondeo con filamentos de von Frey calibrados. Los ratones se mantuvieron en jaulas suspendidas con suelos de malla de alambre y se aplicó el filamento de von Frey perpendicularmente a la superficie plantar de la pata del ratón hasta que se dobló ligeramente, y se mantuvo durante 3-6 seg. Una respuesta positiva se indica por una fuerte retirada de la pata. El umbral de retirada de la pata 50% se determinó por el método no paramétrico de Dixon [37]. Una sonda inicial equivalente a 2 g se aplicó y si la respuesta es negativa, el estímulo se incrementó gradualmente hasta que se obtuvo una respuesta positiva, después disminuyó hasta que se obtuvo un resultado negativo. Este método arriba-abajo se repitió hasta que se determinaron 3 cambios en el comportamiento, y se tabuló el patrón de respuestas positivas y negativas. El umbral de retirada de la pata 50% se determinó como (10
[Xf + k *]) /10.000, donde Xf = valor del último filamento de von Frey empleado, k value = Dixon para el patrón positivo /negativo, y * = la media (log) de diferencia entre los estímulos. Todas las pruebas de dolor se realizaron en cada animal en el siguiente orden, dolor evocado por el movimiento, dolor espontáneo (después del periodo de aclimatación de 20 minutos), y la hipersensibilidad táctil.
Determinación de la destrucción ósea
Las radiografías se tomaron antes de la inyección de las células cancerosas (línea de base, BL) y 21 días después de la inducción de cáncer de hueso usando una máquina Faxitron MX-20 en 7 resolución nominal uM con una corriente de rayos X de 300 uA y una tensión de 26 kV (Faxiton X-ray Corp., Wheeling, IL). Las radiografías digitales fueron tomadas después de las pruebas de comportamiento en 12 animales por condición de tratamiento. Las imágenes fueron capturadas con una cámara digital y se transfieren al ordenador y se guardan en formato de escala de grises digital (TIFF). La pérdida ósea se evaluó según la siguiente escala de 4 puntos:. 0 = normal, 1 = pérdida de masa ósea, sin fractura, 2 = espesor total pérdida de masa ósea unicortical indicando fractura ósea unicortical, 3 = espesor total pérdida de masa ósea bicortical indicando fractura ósea bicortical
Los análisis estadísticos
Las comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento se realizaron utilizando ANOVA. Las comparaciones por pares entre grupos se realizaron con la prueba t de Student, múltiples comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. Para los ensayos de calificación, el uso de las extremidades y pérdida de masa ósea, las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis no paramétrico con la prueba de Mann-Whitney. Para todos los análisis, la significación se fijó en p. & Lt; 0,05
El análisis histológico del tumor dentro del hueso
En el día 21 después de la cirugía, los ratones fueron profundamente anestesiados con ketamina y una perfusión intracardiaca con 25 ml de 0,1 M PBS seguido por 25 ml de 10% de formalina tamponada neutral. fémures ipsilateral fueron retirados de 6 animales por condición y se fijaron posteriormente durante la noche en 10% de formalina tamponada neutral. Fémures se enjuagaron en agua para eliminar formalina antes de ser colocados en una solución de la etiqueta (RDO-Apex, Aurora, IL), durante una hora para lograr la descalcificación. Las muestras se deshidrataron en una solución de etanol clasificado cuidadosamente antes de clavarse en parafina. Ellos fueron orientados de modo que toda la longitud del fémur podría ser seccionado longitudinalmente. Las secciones 3 um de espesor fueron teñidos con hematoxilina y eosina para visualizar los elementos medulares normales y células cancerosas bajo microscopía de campo claro. Se observaron las muestras usando un microscopio Nikon (aumento de 10x) y las imágenes fueron obtenidos mediante una cámara CCD.
RT-PCR análisis de las células PC3N-A6-RR en el espacio intramedular del fémur
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