Extracto
Antecedentes
métodos disponibles en la actualidad para el diagnóstico y estadificación del cáncer de próstata carecen de la sensibilidad para distinguir entre pacientes con cáncer de próstata indolente y aquellos que requieren tratamiento radical. Las alteraciones en la adherentes clave (AJ) y las uniones estrechas (TJ) componentes han sido aclamados como biomarcadores potenciales para la progresión del cáncer de próstata, pero la mayoría de las investigaciones han sido llevadas a cabo en las moléculas individuales.
Objetivo
para dilucidar un panel de biomarcadores que pueden ayudar a distinguir el cáncer de próstata latente de la enfermedad metastásica agresiva.
Métodos
Se analizó la expresión de 7 componentes bien conocidos AJ y TJ en líneas celulares derivadas de próstata normal tejido epitelial (PNT2), no invasivo del cáncer de próstata invasivo (CAHPV-10) y (LNCaP, DU145, PC-3), utilizando la expresión génica, técnicas de transferencia e inmunofluorescencia occidentales.
resultados
claudin 7, catenina α y expresión de la proteína β-catenina no fueron significativamente diferentes entre CAHPV-10 células y las células PNT2. Sin embargo, en las células PC-3, los niveles de proteína para claudin 7, α-catenina fueron significativamente regulan a la baja (-1,5 veces, p = & lt; 0,001) o indetectable, respectivamente. Inmunofluorescencia mostraron localización de β-catenina en las células PC-3 que se citoplásmica en oposición a membranosas
Conclusión
Estos resultados sugieren aberrante Claudín 7, α -. Y β-catenina expresión y /o localización los patrones pueden ser marcadores putativos para distinguir el cáncer de próstata localizado de la enfermedad metastásica agresiva cuando se usa en conjunto
Visto:. Morgan C, Jenkins SA, Kynaston HG, Doak SH (2013) el papel de las moléculas de adhesión como biomarcadores para el agresivo El fenotipo del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (12): e81666. doi: 10.1371 /journal.pone.0081666
Editor: Frédéric André, Universidad de Aix-Marsella, Francia |
Recibido: 28 Junio, 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: 16 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Morgan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de Acción de próstata (número de referencia subvención G2009 /27) y la Fundación médica del St David, Facultad de Medicina, Universidad de Swansea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común en los hombres en el Reino Unido. Cada año cerca de 35.000 casos de CaP son diagnosticados y es responsable de aproximadamente el 12% de todas las muertes de hombres por cáncer en el Reino Unido [1]. El diagnóstico precoz del CaP limitado al órgano es esencial, ya que la prostatectomía radical o radioterapia ofrece la única posibilidad de curación y tratamiento de la enfermedad avanzada completa es paliativa y en efectivo (a largo plazo). Además, a principios de CaP limitado al órgano no siempre es peligrosa para la vida y puede seguir y curso indolente que no requiere tratamiento. En general se acepta que los métodos disponibles actualmente utilizados para el diagnóstico y estadificación del CaP (niveles de antígeno específico de la próstata, la puntuación de Gleason y el grado clínico y patológico) carecen de la sensibilidad para distinguir entre pacientes con, CaP limitado al órgano indolente, que requieren un tratamiento radical y los en riesgo de recaída después del tratamiento radical. Es evidente que hay una necesidad de identificar marcadores moleculares de la progresión del CaP, invasión y metástasis de predecir el diagnóstico y guiar la terapia.
Para un cáncer de metástasis, las células deben romper primero se separan del tumor primario. En el tejido epitelial, las células se conectan entre sí por estructuras de membrana denominadas uniones estrechas (TJ), uniones adherentes (AJ) y desmosomas [2]. Juntos mantener la arquitectura del epitelio. AJ proteínas comprenden las familias cadherina y catenina. E-cadherina está presente principalmente en los epitelios y representa el miembro prototípico de la familia de las cadherinas. El dominio citoplásmico de E-cadherina se une a las proteínas citosólicas denominadas cateninas (α, β y p120) [3]. β-catenina se une directamente a la E-cadherina, mientras que α-catenina se une indirectamente a través de su interacción con β-catenina [4]. Junto con los desmosomas que son los principales responsables de la adhesión entre células adyacentes [5] y la formación de contactos célula-célula estables. El TJ separar las regiones apical y basolateral de la membrana plasmática y a regular el paso de iones, agua y macromoléculas a través del epitelio [6]. TJs se componen de proteínas unidas a la membrana (claudins, ocludina, tricellulin) y sus proteínas adaptadoras y andamios (molécula de adhesión de la unión, ZO-1, ZO-2, ZO-3 Cingulin, MUPP1) [7].
Hasta hace poco, TJs sólo se han percibido como sellos celulares [8]. Ahora, sin embargo, las pérdidas de proteínas TJ están siendo reconocidos por su asociación con una variedad de cánceres. La desregulación de las proteínas TJ se asocia con la pérdida de la polaridad celular epitelial y la desdiferenciación que es un hecho conocido en la carcinogénesis de etapa temprana [7]. En mama pobremente diferenciado [9], [10], la tiroides [11], de endometrio [12] y gastrointestinales [13] cánceres de la expresión de las proteínas de unión estrecha han demostrado ser reducido, mientras que en la pérdida de TJ funcional de cáncer de mama pacientes ' proteínas también se ha asociado con un peor pronóstico [14], [15]. Dado que las proteínas TJ se definen como el punto en el que las membranas de las dos células se unen desempeñan una función vital mediante la celebración de las células entre sí y son una barrera fundamental que las células cancerosas tienen que superar con el fin de difundir [16].
Mientras evidencia continúa creciendo en cuanto a la expresión de los componentes TJ y AJ en el cáncer de la mayoría de los estudios están dirigidos a la investigación de moléculas individuales. Los cánceres son heterogéneas por naturaleza y, por tanto, es imposible para diagnosticar el cáncer o predecir la progresión de la enfermedad utilizando un único biomarcador.
Hemos utilizado cinco líneas celulares de próstata disponibles comercialmente derivados de epitelio normal de la próstata, cáncer de próstata no invasivo y metastásico cáncer para analizar la expresión de 7 bien conocidos componentes AJ y TJ, identificado como aberrantemente expresado en muestras de tejido de cáncer de próstata [17], [18], [19], [20], [21], en la primera etapa de potencialmente elucidar un panel de biomarcadores que pueden distinguir el cáncer indolente de la enfermedad metastásica agresiva cuando se usa en conjunto.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Las células prostáticas epiteliales (PNT2) y las células de cáncer de próstata derivada de cáncer metastásico a los ganglios linfáticos (LNCaP) y hueso (PC-3) se obtuvieron de la Colección Europea de cultivos celulares. células de cáncer de próstata derivadas de cáncer no invasivo próstata (CAHPV-10) y metastásico del cáncer de cerebro (DU145) se adquirieron de la American Type Culture Collection. PNT2, LNCaP, DU145 y PC-3 fueron rutinariamente cultivadas en RPMI 1640, 2 mM L-Glutamina La glutamina y 10% (v /v) de suero de ternera fetal (Invitrogen, Paisley UK). CAHPV-10 células se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos con 5 ng /factor de crecimiento epidérmico recombinante humano ml y 50 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Paisley UK).
Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada del 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se subcultivaron usando 0,25% de tripsina /EDTA (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido).
Los anticuerpos
Los anticuerpos primarios para ZO-1 de ratón y conejo ocludina, claudina-1 y Claudín -7 se adquirieron de Invitrogen (Paisley, UK). Conejo, α-catenina, β-catenina, E-cadherina y β-actina de conejo se adquirieron de New England Biolabs (Hertfordshire, Reino Unido). Rábano picante peroxidasa anticuerpos secundarios conjugados /anti-conejo anti-ratón también se adquirieron de New England Biolabs (Hertfordshire, UK).
Por inmunofluorescencia, anticuerpos primarios adicionales para α-catenina, β-catenina se obtuvieron de Abcam ( Cambridge, Reino Unido). Anti-ratón (Qdot655) y anti-conejo (Qdot525) anticuerpos secundarios fueron obtenidos de Invitrogen (Paisley Reino Unido).
Análisis
La expresión génica
El ARN celular total fue extraído utilizando el kit de extracción RNeasy ( Qiagen, Crawley, Reino Unido) y el ADN residual se retiró por tratamiento con ADN libre ™ (Ambion, Cambridgeshire, Reino Unido) según las instrucciones de los fabricantes. Se sintetizó ADNc a partir de ARN 1 g usando cebadores aleatorios y la síntesis de ADNc kit de transcripción inversa de alta capacidad (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron en el termociclador iCycler iQ térmica (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido), utilizando la metodología de detección de SYBR Green. Los conjuntos de cebadores (Tabla 1.) fueron diseñados para ser exón-exón abarca el fin de minimizar la posibilidad de que cualquier contaminación de ADN genómico se amplifica. Los conjuntos de cebadores utilizados también fueron probados para asegurar que todos ellos demostraron la eficiencia de amplificación por igual. Todas las reacciones se realizaron por triplicado con 2 l de ADNc, 12.5 l iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido) y 0,2 M adelante y atrás primers, en un volumen de reacción final de 25 microlitros. β-actina y HPRT fueron utilizados como genes de referencia. condiciones de amplificación de PCR fueron 95 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. Doblar la expresión se normalizó en contra de las células epiteliales normales de la próstata PNT2.
Western Blot
La proteína total se extrajo utilizando tampón RIPA (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido). Treinta microgramos de proteína se ejecutan en cualquiera de 7,5% o 12% de Tris-glicina PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido), dependiendo del tamaño de la proteína de interés. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% sin grasa en tween /TBS para inhibir la unión no (todos de Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) específico y se incubaron durante la noche a 4 ° C utilizando anticuerpos primarios a, ocludina (1:83), zo- 1 (1:250), Claudín-1 (1:125), Claudín-7 (1:125) α-catenina (1:1000), β-catenina (1:1000) y e-cadherina (1:500) . β-actina (1:1000) se utilizó como control para la carga de proteínas. Las membranas se lavaron libres de anticuerpo primario y se incubaron con peroxidasa de rábano picante /anticuerpos conjugados secundarios anti-ratón anti-conejo (1:1000) para 1 hr a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron utilizando el kit Immun-Star WesternC detección chemiluminescene (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido) y la expresión relativa se cuantificó mediante densitometría y el programa de software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido). Las transferencias Western se realizaron por duplicado.
inmunofluorescencia
Tras el análisis de ARNm y proteína, Claudín 7 α-catenina y β-catenina parece tener niveles de expresión similares a las células normales de la próstata que se hizo alterados en células derivado de un tumor metastásico agresivo. Por lo tanto, solamente de inmunofluorescencia se realizó en estas moléculas para determinar si las alteraciones en la expresión de la proteína fueron seguidos por la localización aberrante. Las células se sembraron a 1 × 10
5 células /ml en portaobjetos de microscopio estériles contenidos en placas estériles de cultivo de tejidos quadriperm (Invitrogen, Paisley Reino Unido). Las células se dejaron durante la noche para adherirse a los portaobjetos y se hicieron crecer hasta la confluencia durante 5 días. Una vez se eliminó células medios confluentes, los portaobjetos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) (Invitrogen, Paisley UK) y se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) durante 15 minutos a temperatura ambiente. PFA se eliminó lavando los portaobjetos en PBS glicina mM /100 (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) 5 min tres veces. Las células se permeablised en 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 10 minutos y se lavaron en PBS tres veces. Para apagar los grupos reactivos siguientes fijación PFA, los portaobjetos se incubaron en borohidruro de sodio (Fisher Scientific, Leicestershire, Reino Unido) a una concentración de 1 mg /ml durante 10 minutos. Esto se realizó tres veces, seguido de un lavado de 5 minutos PBS antes de bloquear las diapositivas de 10% de albúmina de suero bovino (BSA) /PBS durante 30 minutos. Solución de bloqueo se eliminó mediante la realización de 3 x 2 lavados de hora en PBS. Los portaobjetos se incubaron con anti-Claudín 7 (1.100 en 1% BSA /PBS), α-catenina y β-catenina (01:50 1% BSA /PBS). Las láminas fueron incubadas durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo primario se eliminó mediante lavados 3 x 5 min, seguido de incubación con anticuerpos secundarios (1:100 en 6% de BSA /PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios se separaron por 3 × 5 min en PBS antes de portaobjetos se lavaron en agua (2 min) 70%, 85% y 95% de etanol (2 min cada uno). Las láminas fueron analizados utilizando un microscopio de fluorescencia AxioCam (Carl Zeiss Ltd, Hertfordshire, Reino Unido).
Los controles negativos (para descartar la autofluorescencia) se llevaron a cabo mediante la sustitución del anticuerpo primario durante 1% de BSA /PBS.
el análisis estadístico
el análisis llevado a cabo mediante la prueba de ANOVA paramétrico. Se realizó un análisis post hoc de Dunnett para comparar las células cancerosas con las células control PNT2 epiteliales normales y análisis post hoc de Tukey se realizó para múltiples comparaciones de grupos. Un
p-valor
& lt; 0,05 fue considerado significativo
NOTA:. Sólo las diferencias en la expresión génica y los niveles de proteína que satisfacen tanto el p-valor y un factor de cambio biológico de & lt; 1,5 & gt ; se consideraría un cambio significativo.
Resultados
Análisis de Expresión Génica
Cuantitativo en tiempo real PCR (Fig. 1) mostró niveles de mRNA ocludina fueron significativamente diferentes entre todos los grupos (
p Hotel & lt; 0,001). Se observó una reducción significativa en los niveles de ARNm de ocludina en CAHPV-10 (-19,08 veces,
p
= 0,001), DU145 (-3,2 veces,
p
= 0,003) y PC-3 ( -4.3 veces,
p = 0,003)
células de cáncer de próstata en comparación con las células epiteliales normales de la próstata (PNT2). No hubo diferencia significativa en la expresión de ARNm ocludina entre las células de cáncer independientemente de la capacidad invasiva. Sin embargo, los niveles de mRNA fueron significativamente hasta regulado (2,2 veces,
p
= 0,001) en las células de cáncer de LNCaP comparación con las células epiteliales de la próstata (PNT2).
Los niveles de expresión se han normalizado a la línea celular de próstata normal PNT2 cuyo nivel de expresión se ha establecido en 1. * indica diferencia significativa (P & lt; 0,05) en comparación con PNT2
con respecto a ZO-1, no hubo diferencia significativa en la transcripción. entre los niveles de células epiteliales normales de la próstata y cualquiera de las células de cáncer de próstata.
Claudín 1 la expresión génica se reguló de manera significativa en todas las células de cáncer en comparación con PNT2. En las células de cáncer de próstata CAHPV-10 y LNCaP, Claudín 1 se regula por disminución -10 veces (
p
= & lt; 0,001) y -100 veces (
p
= & lt; 0,001), respectivamente . DU145 mostró un -2.1 veces regulación a la baja (
p
= & lt; 0,001) y PC-3 demostrado un pliegue -3.8 (
p
= & lt; 0,001). Reduce el nivel de expresión
Claudin 7 niveles de expresión génica fueron similares entre PNT2 y CAHPV-10 (valor de la expresión 1.1). Por el contrario, Claudín 7 de transcripción fue significativamente hasta reguladas en LNCaP, (4,63 veces,
p
= & lt; 0,001), pero las reguladas en DU145, (-5,3 veces,
p = 0,004
) y PC-3, (-24.8 veces,
p
= 0,01) en comparación con PNT2. También hubo una significativa regulación a la baja en los niveles de expresión cuando claudin 7 niveles de mRNA fueron comparados entre CAHPV-10 y (DU145, (
p
= 0,02) y PC-3 (
p = & lt
;.. 0.001)
niveles de transcripción de α- catenina no difirió significativamente entre PNT2, CAHPV-10, (-1,1 veces) o LNCaP, (- 1 veces) Una regulación inicial significativo se observó un -2,2 doblez en DU145 y -33 veces en las células PC-3, (ambos p = & lt; 0,0001). Cuando los niveles de ARNm para CAHPV-10 se compararon con DU145 y PC-3, se detectó una significativa regulación por disminución en la expresión (tanto DU145 y PC-3
p =
. & lt; 0,001)
β-catenina expresión de genes fue significativamente las reguladas en las células CAHPV-10, (-3 veces,
p
= 0,015) en comparación con PNT2 mientras que una regulación significativa se observó en LNCaP, (3,8 veces,
p
= & lt; 0,001), DU145, (2,2 veces,
p = 0,001
) y PC-3, (2,1 veces,
p
= 0,001). también había una regulación significativa en los niveles de expresión cuando los niveles de ARNm para CAHPV-10 se compararon con DU145 (
p
= 0,006) y PC-3 (
p
= 0,001).
e-cadherina niveles de expresión génica se redujo significativamente en CAHPV-10 (-2,3 veces,
p
= 0,004), DU145 (-5,6 veces,
p
= & lt; 0,001) y PC-3 (-7,25 veces,
p
= & lt; 0,001) en comparación con PNT2. No hubo diferencia significativa en la E-cadherina niveles de expresión génica entre las células de cáncer de próstata no invasivas e invasivas. En contraste, las células LNCaP una vez más demostraron una significativa regulación de la E-cadherina en comparación con PNT2 (1,6 veces,
p = 0,037
).
Análisis de la expresión de proteínas
Western blot y densitometría se realizaron (Fig. 2) para determinar si los niveles de expresión de mRNA fueron comparables a nivel de proteínas (Tabla 2). Los niveles de proteína para ocludina estaban reguladas en las células de cáncer de próstata CAHPV-10 (-2,8 veces), DU145 (-1,6 veces) y PC-3 (-9,3 veces), pero hasta reguladas en LNCaP (2,4 veces) en comparación con PNT2. Sin embargo, debido a la alta variación entre repeticiones (datos no mostrados), no hubo diferencia significativa entre cualquiera de las células de la próstata.
se utilizó β-actina como control de carga. Las transferencias Western se realizaron por duplicado y las bandas son representativos de los resultados obtenidos.
Los niveles de proteína de ZO-1 no mostraron ninguna diferencia significativa a través de cualquiera de las líneas celulares (CAHPV-10 1,1 veces, LNCaP 3,6 veces, DU145, 2,5 veces y PC-3 -1.1 veces).
en comparación con PNT2, los niveles de Claudín 1 se redujeron en todas las células del cáncer de próstata. CAHPV-10 se regula por disminución -2.1 veces, DU145 -2.3 veces y PC-3 -1.8 veces. LNCaP fue la única línea celular para mostrar una regulación a la baja significativa en comparación con PNT2 (-9,3 veces,
p
= 0,04).
Claudín 7 niveles de proteína no mostraron diferencias entre CAHPV-10 ( 1.2 veces) y PNT2 pero los niveles fueron significativamente reguladas en LNCaP (-1,1 veces), DU145 (-1,1 veces) y PC-3 (-1,5 veces). Todos tenían un
p =
valor de & lt; 0,01. Sin embargo, LNCaP y DU145 no cumplieron con el factor de cambio biológico y, por lo tanto, estos cambios no se han tenido en cuenta. Además, cuando los niveles de proteína claudin 7 de CAHPV-10 se compararon con PC-3, una regulación a la baja significativa También se documentó (
p
= & lt; 0,01)
En cuanto a. los niveles de proteína catenina alfa-, no hubo diferencia significativa entre CAHPV-10 y PNT2, mientras que para LNCaP (4,4 veces,
p
= 0,03), DU145 (-2 veces
p = 0,04
) los niveles α-catenina fueron significativamente las reguladas por diversos grados, en comparación con PNT2. Para, PC-3 una regulación a la baja sustancial en α - catenina se observó niveles de proteína, de manera que una banda de proteína fue indetectable y no se pudo obtener un valor densitometría. Además, CAHPV-10 niveles de proteínas también fueron significativamente diferentes de LNCaP (
p
= 0,03) y DU145 (
p
= 0,04).
No hubo una diferencia significativa en los niveles de proteína β-catenina entre CAHPV-10 (1,1), LNCaP (2 veces), DU145 (1,4 veces) o PC-3 (1,5 veces) y PNT2, por tanto, a pesar de que PC-3 exhibió el pliegue del cambio biológico, el resultado fue tenida en cuenta
Para los niveles de proteína e-cadherina una regulación inicial significativo fue evidente en CAHPV-10 (-1,7 veces,
p
= & lt; 0,01). y DU145 (-1,5 veces,
p
= & lt; 0,01). Una vez más, no se pudo obtener una regulación a la baja sustancial en PC-3, de manera que una banda de proteína fue indetectable y un valor de densitometría. En las células LNCaP E-cadherina fue hasta regulada a nivel de proteínas (2,7 veces
p
= 0,01).
inmunofluorescencia
Con el fin de determinar si las proteínas AJ y TJ estaban presentes en su localización sub-celular correcta (membrana celular), se utilizó inmunofluorescencia.
inmunofluorescencia (Fig. 3) para Claudín 7 mostró una fuerte tinción en la membrana celular para PNT2, CAHPV-10 y LNCaP. Por tanto DU145 y PC-3, se redujo la tinción fluorescente. La tinción se reduce notablemente tanto en el DU145 y PC-3 células con tinción evidente tanto en la membrana celular y en el citoplasma. La tinción para catenina α- mostró una fuerte tinción específica en la membrana celular para PNT2, CAHPV-10 y LNCaP células, mientras que para DU145 y la intensidad de la señal PC-3 se redujo notablemente y no específica. Con respecto a beta-catenina tinción de fluorescencia, PNT2, CAHPV-10 y DU145 mostraron tinción específica en la membrana celular. intensidad β-catenina en células LNCaP y PC-3 era fuerte en la membrana celular y en los sitios de contacto célula-célula, pero en PC-3 tinción también fue evidente en el citoplasma
.
En las células LNCaP, la proteína localización se produce en la membrana celular y la intensidad de la tinción parece similar a PNT2 (con la excepción de β-catenina, que parece tener una mayor expresión). En las células DU145, la expresión de todas las proteínas se reduce y la localización es difusa y citoplasmática. Para las células PC-3, 7 y Claudín catenina α-, la fluorescencia se reduce notablemente y /o citoplasmática en la distribución, mientras que la fluorescencia β-catenina es más fuerte, sino también en su localización citoplasmática.
Discusión
el primer paso en la cascada metastásica es la pérdida de adhesión célula-célula con el fin para que las células se separan del tumor primario. Por lo tanto, AJs han sido un foco importante de los estudios de cáncer y ahora componentes TJ también están siendo reconocidos por su participación. Las alteraciones en los componentes clave AJ y TJ tales como α-catenina, E-cadherina, β-catenina y Claudín 1 han sido aclamados como biomarcadores potenciales para la progresión del cáncer de próstata [18], [22], [23], [24] pero el mayoría de la investigación se ha llevado a cabo en las moléculas individuales. El cáncer es heterogéneo por naturaleza, por lo tanto hay una necesidad de un panel de biomarcadores, a diferencia de las moléculas individuales, para ayudar a determinar la progresión del cáncer y en el caso de cáncer de próstata, cáncer de distinguir latente de la enfermedad metastásica agresiva. Como resultado de ello, el objetivo de este estudio fue evaluar la expresión de varios componentes bien conocidos TJ y AJ, colectivamente, como un primer paso importante en la identificación de un panel de biomarcadores putativos que puede ayudar a distinguir el cáncer de próstata latente de la enfermedad metastásica agresiva. Siete biomarcadores putativos fueron escogidos debido a su expresión aberrante, que se han documentado en la literatura científica e investigado en los estudios centrados en el paciente anteriores [17], [18], [20], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Las proteínas 7 AJ y TJ elegidos fueron la E-cadherina, α- y β- catenina, ZO-1, ocludina, claudina claudina 1 y 7 y su expresión se investigó el uso de un
in vitro
modelo de progresión del cáncer de próstata . Fuera de la 7, destacamos 3 (7 Claudín, α- catenina y la β-) cuyos ARNm, los niveles de proteína y /o localización son similares en células derivadas de cáncer tanto normal y limitada al órgano de próstata, pero sus niveles y /o la localización de todo alterar en células derivadas de tumores metastásicos agresivos. Claudin 7 ARNm y los niveles de proteína en células de cáncer de próstata no invasivos (CAHPV-10) fueron similares a los encontrados en las células epiteliales de la próstata. Además, tanto el ARNm y los niveles de proteína fueron significativamente las reguladas en la línea celular metastásica más agresivo PC-3 en comparación con CAHPV-10. Estos resultados son compatibles con Sheehan et al, que mostró una disminución en Claudín 7 expresión correlacionada con tumores prostáticos de alto grado [19]. Por lo tanto, Claudín 7 niveles de proteína pueden ser un reflejo de la agresividad de estas células de cáncer de próstata y sólo puede ser modificado en la forma más agresiva de la enfermedad. Además, un mayor análisis por inmunofluorescencia reveló que Claudín 7 localización en las células PC-3 era citoplasmática, así como unida a membranas. localización aberrante de claudin 7 al citoplasma se ha demostrado que se producen en las células de cáncer de mama [28] y carcinoma de células escamosas del esófago [2]. Esta redistribución de Claudins se han atribuido a varios mecanismos incluyendo la proteína en la regulación que resulta en la internalización citoplasmática [2]. Basándose en estos resultados puede ser la hipótesis de que la claudina 7 podría ser un posible candidato para distinguir los cánceres indolentes de las formas metastásicas más agresivos, lo que requiere validación en muestras de pacientes.
En combinación con Claudín 7, alfa-catenina niveles en células de cáncer de próstata no invasivos fueron similares a los niveles en las células epiteliales de la próstata, pero al igual que Claudín 7, se redujo significativamente en las células metastásicas más agresivas. Una relación significativa entre la expresión de α-catenina reducida y alta puntuación de Gleason se ha informado en los tumores de próstata [24]. Del mismo modo, α-catenina se ha informado de que se presente en los tumores de próstata con un bajo grado de Gleason [17]. Se ha sugerido, por lo tanto, que la pérdida de α-catenina conduce a la pérdida de la función e-cadherina conduce a un peor pronóstico [18], mientras que, la repleción de α-catenina en células de cáncer de próstata nulos α-catenina se ha informado de aumentar adherens la formación de uniones y la reducción de la actividad transcripcional de β-catenina, ciclina D1 niveles y la proliferación celular [26].
para β-catenina niveles de proteína mRNA y la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia de las células CAHPV-10 fueron similares a la próstata normal células epiteliales y, curiosamente, la inmunofluorescencia reveló β-catenina en las células PC-3 para estar tanto en la membrana citoplasmática y. β-catenina localiza en el citoplasma como resultado de la unión adherente desglose complejo y, a continuación se transloca al núcleo donde ejerce su efecto transcripcional [29]. Esta localización aberrante al citoplasma se ha demostrado que contribuyen a carciongenesis tiroides [30] y vinculado a un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama [31]. Nuestros resultados sugieren que puede ser pertinente para mirar localización citoplasmática de β-catenina, en lugar de evaluar cuantitativamente es los niveles de ARNm o proteína, como un biomarcador putativo de la enfermedad agresiva.
Cabe señalar que el ARNm y los niveles de expresión de proteínas en la línea celular LNCaP rara vez siguieron la misma tendencia que DU145 y PC-3. Esta diferencia en los niveles de expresión podría explicarse por el estado de potencial metastásico y la diferenciación de la línea celular. LNCaP ha sido documentada como que limitan el potencial metastásico y sigue siendo bien diferenciado cuando se introduce en modelos de ratón [32]. Por lo tanto, puede postularse que después de la metástasis a los ganglios linfáticos, esta línea celular se ha vuelto de nuevo a una forma más epiteliales como resultado de la colonización [33] y el crecimiento. Además, también hubo algunas discrepancias entre los niveles de ARNm y proteínas para Claudín 7 y ocludina en LNCaP, y β-catenina en CAHPV -10 y DU145 y α-catenina en CAHPV-10 y LNCaP. Como mRNA se traduce en proteína se puede suponer que no debe haber una correlación entre los niveles de mRNA y proteína. Sin embargo, los estudios que han investigado una correlación entre los niveles de ARNm y la expresión de proteínas han reportado correlaciones mínimos o limitados [34]. La cantidad de proteína detectada puede probablemente ser afectada por las modificaciones de traducción y post-transcripcional que proporcionan un grado de control de la expresión secundaria que podrían explicar estas diferencias.
Conclusión
Debido a la naturaleza heterogénea de cáncer , el análisis de moléculas individuales proporciona información limitada y es imposible para diagnosticar el cáncer o predecir la progresión de la enfermedad utilizando un único biomarcador. Se han notificado los 7 biomarcadores analizados aquí, que se expresa de manera aberrante en muestras de tejido de cáncer de próstata, pero principalmente sobre una base individual. Sin embargo, nuestro
in vitro
investigación ha mostrado que de éstos sólo el 3 7 (7 Claudín, α-catenina y la β-catenina) puede ser utilizado en conjunto para distinguir el cáncer de próstata localizado de células que representan enfermedad metastásica agresiva. Creemos que este
in vitro
identificación de alteraciones en varios genes clave en combinación pone de relieve la importancia de utilizar varios marcadores moleculares y es un importante primer paso en la identificación de un panel de biomarcadores putativos que pueden ayudar a distinguir el cáncer de próstata en estado latente desde enfermedad metastásica agresiva. Un estudio IHC grande de pacientes que ahora se necesita para validar estos resultados.