Extracto
en la progresión tumoral alteraciones definidas en la matriz nuclear (NM) composición de proteínas, así como en la estructura de la cromatina se producen. El NM interactúa con la cromatina a través de secuencias de ADN especializadas llamadas regiones de unión a la matriz (MARS). En el presente estudio, utilizando un enfoque proteómico, junto con un ensayo del sudoeste de dos dimensiones y microscopía láser confocal, se muestra que la diferenciación de las células de carcinoma de próstata humano estabilizadas se caracteriza por modificaciones tanto en la composición de proteínas MN y la unión entre las proteínas y Marte NM. andrógenos sensible bien diferenciadas y de crecimiento lento células LNCaP se caracterizan por un patrón menos complejo y por un mayor número de proteínas de unión a secuencias MAR en comparación con 22Rv1 células que expresan receptor de andrógenos, pero independiente de andrógenos. Por último, en las células PC3 independientes de andrógenos pobremente diferenciado y fuertemente agresivas la complejidad del modelo NM nuevos aumentos y un menor número de proteínas se unen al Marte. Además, en esta línea celular con respecto a las células LNCaP, estos cambios son síncronas con modificaciones en tanto la distribución nuclear de las secuencias de Mar y en las dimensiones medias de bucle que aumentan de manera significativa. Aunque la expresión de muchos cambios proteínas NM durante la desdiferenciación, sólo un grupo muy limitado de proteínas de unión a MAR parecen jugar un papel clave en este proceso. Las variaciones en la expresión de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y especial rica en AT secuencia de la proteína de unión-1 (SATB1) junto con un aumento en la fosforilación de lamin B representar cambios que podrían desencadenar paso hacia un fenotipo más agresivo . Estos resultados sugieren que la aclaración de las proteínas de unión a MAR que están involucrados en la diferenciación de las células del cáncer de próstata podría ser una herramienta importante para mejorar nuestra comprensión de este proceso de carcinogénesis, y que también podría ser nuevas dianas para la terapia del cáncer de próstata.
Visto: Barboro P, E Repaci, D'Arrigo C, C Balbi (2012) El papel de las proteínas de la matriz nuclear unión a regiones de unión a la matriz (MARS) en el cáncer de próstata diferenciación celular. PLoS ONE 7 (7): e40617. doi: 10.1371 /journal.pone.0040617
Editor: Kaustubh Datta, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 22, 2011; Aceptado: June 11, 2012; Publicado: 11 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Barboro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por Regione Liguria (www.regione.liguria.it), subvención número 563/2009; Compañía de San Paolo (www.fondazioneintesasanpaoloonlus.org), el número de concesión 2.009,127; Ministero dell'Universita 'e Ricerca Scientifica - MIUR (www.prin.miur.it) PRIN proyecto, número de concesión 2005065404-003. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
organización nuclear anormal y alteraciones en la cantidad y distribución de la heterocromatina tiempo ha sido reconocido como características del cáncer humano [1]; Sin embargo, en la actualidad no sabemos las causas exactas de estas modificaciones, ni sabemos cómo se orquesta la actividad /silenciamiento de miles de genes. En eucariotas, el genoma está compartimentada en dominios de la cromatina por la unión de la cromatina a una estructura de soporte: la matriz nuclear (NM). Las interacciones entre la cromatina y el NM se producen a través de secuencias de ADN ricas en AT llamadas regiones de unión a la matriz (MARS). La función de Marte en varios procesos, incluyendo la organización de la cromatina bucles, aumentando la expresión del gen y facilitar la replicación [2]. No todos los potenciales Mars se unen a la NM o participan en la organización de las regiones de unión de bucle. MAR unión es un evento dinámico que es el tipo de célula y /o dependiente del ciclo celular y puede permitir la regulación de genes distantes de manera coordinada [3]. Varias proteínas de unión a MAR-han sido identificados, algunos de los cuales están desreguladas dramáticamente en las células tumorales. A menudo, su expresión también se correlaciona significativamente con fenotipos tumorales agresivas. Del mismo modo, las modificaciones en las interacciones entre las proteínas y Marte NM podrían estar relacionados con la cromatina reorganización a gran escala observada durante la carcinogénesis. Esto ha llevado a un creciente interés en Marte y proteínas como posibles objetivos para los fármacos antineoplásicos [2].
Recientemente, hemos demostrado que en las primeras etapas de la carcinogénesis de hígado de rata, a gran escala de la cromatina es la reorganización MAR vinculante relacionada con alteraciones morfológicas y proteínas de composición de la NM. Estos cambios modifican la capacidad de las proteínas para unirse NM ARN y secuencias MAR contienen ADN [4]. Además, estas alteraciones son síncronas con los cambios en la organización de las laminas en el nucleoplasma. En los hepatocitos normales, las laminas se ensamblan en filamentos que forman una retícula ortogonal, mientras que en los hepatocitos transformados el bidimensional orden local se pierde [5].
carcinoma de próstata (CaP) representa un problema de salud importante debido a que su incidencia sigue aumentando, y no existen marcadores biológicos actualmente capaz de distinguir los tumores indolentes de los agresivos. La ablación de andrógenos es el enfoque terapéutico más común de CaP. Por desgracia, después de unos años de tratamiento, la enfermedad progresa en la mayoría de los pacientes que luego adquieren un fenotipo independiente de andrógenos para el que no hay tratamientos disponibles [6]. La comprensión de las vías que conducen a la independencia de andrógenos tanto, es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias. El trabajo llevado a cabo en nuestro laboratorio y otros para buscar marcadores ACC con características mejoradas de diagnóstico y pronóstico ha identificado varias proteínas NM que son expresados diferencialmente en el CaP con respecto al tejido no tumoral; Por otra parte, unas pocas proteínas se correlacionaron significativamente con la agresividad del tumor y /o riesgo de progresión bioquímica [7], [8].
En este estudio, hemos utilizado un enfoque proteómico, junto con dos dimensiones del sudoeste Blot (SWB ) y confocal análisis para caracterizar la unión entre proteínas y Marte nm en tres líneas celulares de CaP humanas que representan modelos de diferentes etapas de la progresión PCa: la línea celular LNCaP andrógeno-sensibles bien diferenciado, la AR intermedia diferenciar las células 22Rv1 que expresan el receptor de andrógenos ( ) pero independiente de andrógenos y, finalmente, la PC3 pobremente diferenciado y fuertemente agresivo que no expresa AR. Estas líneas celulares son un buen sistema modelo para estudiar la progresión de CaP como más de 70% de las proteínas expresadas NM coincidir las aisladas a partir de tejidos de CaP [9]. Aquí nos proporcionan la prueba de que existe una relación inversa entre la complejidad de la composición de proteínas NM y el grado de diferenciación de la línea celular y que las interacciones nm con secuencias MAR cambian durante la diferenciación, que modifica las dimensiones de bucle de la cromatina y en consecuencia la expresión génica.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
LNCaP, líneas celulares de carcinoma de próstata PC3 y 22Rv1 se obtuvieron a partir de ATCC (CRL-1740, CRL-2505 y CRL-1435, respectivamente; Rockville, MD, EE.UU.) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 sin rojo fenol (Celbio, Milán, Italia) que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (tratado con carbón vegetal), 1% penicilina, 1% de estreptomicina y 1% de glutamina. medio LNCaP y 22Rv1 también fue suplementado con HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 4,5 mg /ml de glucosa. Los números de paso en la que se colocan las células LNCaP en un medio de mantenimiento variaron de 24 a 34. Las células se cultivaron en una monocapa en presencia de 0,1 nM 5-α-dihidrotestosterona (SIGMA, St. Louis, MO, EE.UU.) a 37 ° C en 5% de CO
2. Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando células de un cultivo en fase exponencial.
Aislamiento del NM
Para uno o electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional-(1D o 2D-PAGE), el NM era aislado de acuerdo con Barboro
et al
. [10]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el Bio-Rad (München, Alemania) de microensayo de proteína con albúmina de suero bovino como estándar. Para la microscopía confocal, el NM se extrajo
In situ
como se describe por Zeng
et al
. [11].
(A) teñido con púrpura profundo Representante gel de 1D y el bienestar subjetivo correspondiente. Las flechas a la derecha indican las tres bandas principales que surgen en 1D SWB, cada uno de los cuales corresponde a varios puntos en 2D como es evidente en (D), (F) y (H). (B) La comparación entre la cantidad relativa de XmnI unión a proteínas NM en las diferentes líneas celulares. Eje de ordenadas representa la media ± SE de las cantidades relativas de XmnI como se determina por análisis cuantitativo de tres preparaciones diferentes. La disminución de la 22Rv1 y PC3 con células LNCaP sentido fue significativa (* p = 0,004, ** P & lt; 10
-5). mapas de gel (C, E y G) Representante 2D teñidos con plata y (D, F y H) SWB de proteínas NM extraídos de LNCaP (C, D), 22Rv1 (E, F) y PC3 células (G, H). Las proteínas identificadas se destacan en cajas de color rojo. Las tres flechas muestran los tres grupos de proteínas señalado en (A). L, lamina; h, hnRNP, fr, fragmentos
Preparación de una sonda de ADN
Una secuencia de ADN altamente repetitivo de 370 pb (XmnI) obtenida a partir de la Base de Datos de transacción S /MAR [http.: //smartdb.bioinf.med.uni-goettingen.de] liberar 2.3 (número de acceso SM0000134) se utilizó como sonda para los experimentos de unión de ADN. XmnI es una secuencia de ADN ricas en AT dentro de una región de base-unpairing (BUR) y es capaz de unirse a las mismas proteínas que se unen al ADN que contienen MAR co-aislados con el NM, como hemos demostrado anteriormente [4]. El plásmido pUC57 con la secuencia XmnI fue construido por GenScript Corporation (Municipio de Piscataway, NJ, EE.UU.).
Escherichia coli TOP
F10 'se transformó con pUC57, y se seleccionaron las células transformadas en placas de agar suplementado con ampicilina. Los plásmidos se aislaron usando el kit Qiagen Maxi plásmido, digerido por restricción con
Xmn
I y posteriormente se purificó en gel de agarosa usando un kit de purificación de PCR de alta Pure producto (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
muestras de ADN fueron biotinilados mediante el procedimiento de desplazamiento de mella (Sistema BioNick Labeling DNA, Invitrogen /Life Technologies, San Diego, CA). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron de la muestra utilizando una columna giratoria Sephadex G-25 (Roche Diagnostics).
Nuclear de Halo y Halo Preparación fluorescencia de hibridación in situ (FISH) Técnica
Se prepararon halos nucleares de acuerdo con el método de de Belle
et al
. [12] con modificaciones menores. Brevemente, LNCaP y PC3 células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los núcleos se extrajeron mediante la incubación de las células en 100 mM KCl, sacarosa 300 mM, tubos 10 mM, pH 6,8, MgCl 3 mM
2, 0,5% de Triton X-100 en 4
°
C durante 20 min. Entonces, 3 × 10
5 núcleos se cytospun en portaobjetos durante 10 minutos a 100 ×
g.
Los portaobjetos se sumergieron durante 4 minutos en una solución que contenía NaCl 2 M, TUBOS DE 10 mM, pH 6,8 y EDTA y 10 mM después se aclara para 2 min por una serie de 10 veces, 5X, 2X y 1X PBS, pH 7,4. Después de la fijación con 3,7% de formaldehído en PBS, el ADN se tiñó con DAPI y se determinó el tamaño de halo relativa de cada núcleo según lo informado por Guillou
et al
. [13].
(A) Diagrama de Venn que muestra el número de manchas de proteínas se visualizaron en cada línea celular. Los números en las regiones superpuestas representan puntos comunes. tablas (B-D) circular que muestra el porcentaje de puntos que se unen a la secuencia XmnI en tres líneas celulares. Los colores cian y amarillo, indican los puntos que eran, con células LNCaP respecto, expresan de manera diferente o con ninguna diferencia, en 22Rv1 (C) o PC3 (D), respectivamente.
Para examinar la distribución de las secuencias XmnI en nucleoides, se aplicó la técnica de halo-FISH. Después de la extracción halo y fijación, los portaobjetos se incubaron con 70% de formamida, 2x citrato salino-sódico (SSC) y 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,0 a 73 ° C durante 3 min, seguido de 50% de formamida, 2x SSC y sodio 50 mM fosfato, pH 7,0, a 73 ° C durante 1 min. La mezcla de hibridación (4 ng /sonda XmnI l biotinilado, 2x SSC, 1 mg /ADN competidor ml, 10% de sulfato de dextrano y 25% de formamida) se desnaturalizaron por calor por separado durante 5 min a 73 ° C, se enfrió rápidamente en hielo y se aplica a el espécimen. Después de una incubación durante la noche a 37 ° C, los portaobjetos se lavaron tres veces con 50% de formamida y 2x SSC, pH 7,0, a 42 ° C durante 5 min seguido de otros tres lavados con 0,1 x SSC a 60 ° C durante 5 min. detección de FISH se llevó a cabo con estreptavidina conjugada con FQ
TM555 (dilución 1:100, Biotium, Hayward, CA), mientras que el ADN total se contratinción con DAPI. Las muestras se analizaron por microscopía de luz con un microscopio de epifluorescencia Leica DM LB2 (Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de 40x. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DP70 y se procesaron con el software ImageJ v1.43 FICA (http://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/).
electroforesis en gel
1D y 2D-PAGE de las proteínas NM se llevaron a cabo como se describe anteriormente [14]. Los geles se tiñeron ya sea para el análisis de patrones de proteínas o procesadas para Western blot (WB) o BS. El patrón de fosforilación lamin B se realizó mediante un análisis proteómico multiplexada. Los geles se incubaron inicialmente con Pro-Q Diamond (Molecular sonda Inc., Eugene, Oregón, EE.UU.), un colorante-fosfoproteína específica, seguido de incubación con el tinte SYPRO Ruby (Molecular sonda Inc.) para la visualización de proteínas totales, según lo recomendado por el fabricante.
Procedimientos SWB y WB
SWB se realizó como se informó anteriormente [4]. Brevemente, un gel 1D o 2D-PAGE se electrotransfirió a una membrana Hybond-P (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La membrana se incubó en tampón A (NaCl 150 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, mM MgCl 10
2 y 0,5% de Tween-20) durante 2 h a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 37 ° C en el mismo tampón que contiene 50 ng /ml de sonda de ADN y un exceso de 500 veces de un competidor no específico (ADN de esperma de arenque sonicado). A continuación, la membrana se lavó con tres cambios de tampón A durante un período de 60 min. Antes de la detección, las membranas sondadas con ADN biotinilado se incubaron durante 30 min con rábano picante estreptavidina peroxidasa ligada (Invitrogen, Carlsbad, CA) diluido 1:1200 en tampón A y después se lavaron cuatro veces con el mismo tampón durante 15 min a temperatura ambiente . detección no radiactiva de ADN unido a la NM se llevó a cabo con los ECL Plus Western Blot reactivos mejorados y reveló usando Hyperfilm ECL (GE Healthcare), con las mismas condiciones de exposición.
Las ordenadas representan la media ± SE de las cantidades relativas de estas proteínas como se determina por análisis cuantitativo de tres a seis WB llevadas a cabo utilizando al menos tres preparación diferente de NM (* P £ 0,05; ** P & lt; 0,0005). WB representativos se muestran a la derecha; los principales fragmentos proteolíticos de PARP1 y SATB1 están marcados por puntos completos. Se informó de los pesos moleculares relativos de proteínas estándar en kDa.
Para WB, las proteínas separadas por 1D o 2D-PAGE se transfirieron a una membrana Hybond-P (GE Healthcare), y la inmunodetección se llevó a cabo el uso de los anticuerpos en la Tabla 1. manchas inmunorreactivas o bandas se detectaron utilizando ECL. Después del análisis 1D WB, la cantidad relativa de cada proteína en estudio se obtuvo mediante la normalización de la densidad óptica integrada por ECL con la densidad óptica integrada de la cantidad total de proteínas NM determinados por el gel de tinción de color morado oscuro como [4] se describe anteriormente. En pocas palabras, cantidades iguales (8 g) de la misma preparación se cargaron en dos geles 1D-PAGE y se sometieron a electroforesis. Un gel se tiñó con Deep Purple y exploraciones densitométricas se realizaron en un escáner Molecular Imager FX (Bio-Rad) y las cantidades totales de proteínas (
Un
) fueron evaluados por integración de la curva de densidad óptica. El segundo gel se transfirió y bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando Hyperfilm ECL películas (GE Healthcare), que exhiben una respuesta lineal a la luz producida a partir de un aumento de quimioluminiscencia. Las cantidades relativas de proteínas Understudy se obtuvieron mediante la normalización de la densidad óptica integrada por ECL (
B
) a la densidad óptica integrada (
A
) del gel-púrpura manchado profunda correspondiente. Este método nos ha permitido obtener resultados cuantitativos. La comparación de las cantidades relativas de las proteínas se realizó mediante la exportación de los valores individuales de cada película y analizarlos utilizando la prueba t de Student en el software OriginPro 7.5. Análisis FODA
Imagen de patrones 2D gel spot
Todos los geles 2D teñidos con plata eran digitalizada con un densitómetro GS-800 (Bio-Rad) utilizando las mismas condiciones de escaneado. detección de puntos, la alineación y la normalización de gel se llevaron a cabo utilizando el paquete de software PDQuest (Ver. 7.3.0, BioRad). Análisis diferencial se realizó mediante la agrupación de geles 2D en tres clases, conteniendo cada uno de cuatro a seis geles obtenidos a partir de cuatro a cinco diferentes preparaciones NM aisladas de LNCaP o 22Rv1 o células PC3. Reproducibilidad de los geles, expresado como un porcentaje medio de puntos emparejados dentro de cada clase ± SD, fue 87 ± 5% para LNCaP, 83 ± 3% para 22Rv1 y 83 ± 1% para PC3. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para detectar manchas excesiva o insuficiente expresado; P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativas y manchas de proteínas cuya expresión es sólo 2 veces o más desregulado fueron analizados. Para compensar las diferencias sutiles en la carga de la muestra y la tinción del gel, el volumen de cada punto se normalizó de acuerdo con cantidad total en puntos válidos en cada gel.
El software de análisis PDQuest también se utilizó para detectar las proteínas que se unían los anticuerpos en 2D WB, haciendo coincidir los puntos de antígeno en autorradiografıas con manchas de proteínas en 2D réplica de BS.
(a, D) Las células enteras manchadas por inmunofluorescencia de dos colores. (B, E) NM preparó
In situ Opiniones y manchado por inmuno-FISH. (A, B) análisis con microscopio confocal de la localización de PARP (verde) y secuencia de ADN o XmnI (azul). (D, E) Localización de SATB1 (verde) y secuencia de ADN o XmnI (azul). En la parte inferior de los paneles B y E las exploraciones de línea perfil de intensidad, se realiza entre las cruces blancas del NM como se indica en las imágenes confocal de combinación en B y E, se muestran. La ordenada representa la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias, la abscisa representa la distancia en píxeles. Las barras corresponden a 5 micras. (C, F) Gráficos de dispersión que muestra la cuantificación de análisis de la colocalización de PARP /DNA (a), PARP /XmnI (b), SATB1 /DNA (a), o SATB1 /XmnI (b), respectivamente. R corresponde al coeficiente de correlación de Pearson; M1 a la fracción de la proteína en estudio la superposición de la DNA o XmnI y M2 la fracción de ADN o XmnI la superposición de la proteína. Las líneas horizontales representan los valores medios ± SE de 20 campos (122-226 NMS total) replicados en dos experimentos diferentes (* P≤0.03, ** P & lt; 0,001).
escaneo láser confocal Microscopía y análisis de imágenes
En las células LNCaP y PC3 enteros, el análisis de la relación espacial entre las proteínas en estudio y el ADN total fue realizada por dos colores tinción de inmunofluorescencia como se informó anteriormente [15]. Las proteínas se marcaron usando un anticuerpo primario contra ya sea especial rica en AT secuencia de la proteína de unión-1 (SATB1) (1:20 dilución, Santa Cruz) o poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (01:50, Santa Cruz) con CF
TM555 IgG de cabra anti-conejo (dilución 1:200, Biotium) como anticuerpo secundario, mientras que el ADN se marcó con 5 M SYTOX Orange (Molecular Probes). Con el fin de estudiar las interacciones entre las proteínas nm y secuencias MAR, se realizó la inmuno-FISH en NM extrae directamente sobre portaobjetos siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Esta técnica de inmuno-FISH involucrado tinción simultánea de las proteínas y secuencias de ADN NM y consta de dos partes. En la primera parte (FISH), las secuencias MAR se visualizaron utilizando una sonda con biotina XmnI como se informó anteriormente (véase la sección de halo-FISH). En la segunda parte, las proteínas NM se detectaron por inmunofluorescencia utilizando conejo anti-SATB1 (dilución 1:15, Santa Cruz), de conejo anti-PARP (1:40, Santa Cruz) o de cabra anti-Lamin B (dilución 1:20 , Santa Cruz). Inmunolocalización de los complejos proteína-MAR se llevó a cabo usando un cóctel de anticuerpos secundarios marcados (CF
TM633 anti-Ig de conejo, dilución 1:100 y Alexa 488 anti-Ig de cabra, 1:100 dilución) y estreptavidina conjugada con CF
TM555 (1:100 dilución). Todas las imágenes confocales se recogieron de acuerdo con el criterio de Nyquist como conjuntos de datos 3D (z-pilas) con un tamaño de paso de 250 nm usando un Olympus FV-500 de escaneo láser confocal microscopio equipado con un 60 × /1,4 NA objetivo de inmersión en aceite. El procesamiento de imágenes y análisis de co-localización se realizaron como se describe anteriormente [15] utilizando el software ImageJ v1.43 FICA que proporciona tanto el coeficiente de correlación de Pearson (R) y la co-ocurrencia Manders coeficientes (M1 y M2).
(a) imágenes de microscopía confocal representativos de Lamin B (rojo) y la secuencia XmnI (azul) en el NM extraída
In situ Opiniones y manchado por inmuno-FISH. Las barras corresponden a 5 micras. (B) sección magnificada de 2D-PAGE teñido con SYPRO Ruby (a, c) o Diamond Pro-Q que tiñe selectivamente sólo fosfoproteínas (b, d). Las puntas de flecha indican las diversas isoformas de lamin B. El mismo color corresponde a la misma isoforma en dos líneas celulares. En las células PC3, el péptido no fosforilado presente en las células LNCaP desapareció (puntas de flecha roja).
Resultados
La expresión de las proteínas de unión NM Marte Depende de Diferenciada Estado de CaP Línea Celular
las proteínas NM extraídos de LNCaP, 22Rv1 y células PC3 se separaron por 1D-PAGE y una pantalla de unión a la secuencia XmnI se llevó a cabo. En todas las líneas celulares examinadas, tres grupos de proteínas (centrados alrededor de 107, 71 y 55 kDa, respectivamente) que une fuertemente se identificaron de ADN (Fig. 1A, flechas). No hay cambios cualitativos eran apreciables entre las tres líneas celulares; sin embargo, la cantidad de ADN de unión a las proteínas NM fue significativamente mayor en las células menos agresivos (Fig. 1B).
(A) nucleoides representativos tiñeron ya sea por DAPI (azul) para visualizar sólo el ADN total (izquierda paneles ) o con halo-FISH para resaltar la secuencia XmnI (rojo) y de contraste con DAPI para detectar el ADN total (azul) .La barra corresponde a 10 micras. plot (B) de dispersión que muestra la distribución de tamaño de halo ADN. Las líneas horizontales indican los valores medios obtenidos de medición para cada línea celular por lo menos 100 Nucleoides. El tamaño medio de halo ADN ± SE fue de 6,8 ± 0,2 para las células LNCaP y 7,5 ± 0,2 para células PC3, respectivamente (P = 0,009). El panel inferior muestra la distribución de frecuencias de las radios de halo agrupados en intervalos de 2 micras. (C) Un modelo esquemático de la interrelación entre los bucles y el NM en la desdiferenciación de las células de CaP. En las células más diferenciadas (LNCaP) del NM está bien organizada con varias proteínas unidas a secuencias MAR. En PC3, donde algunas regularidades estructurales del NM desaparecen, un menor número de especies de proteínas obligado el Marte y así un bucle de ADN mayor está anclado en la MN.
polipéptidos, se caracterizan, además, la expresión de las proteínas NM por 2D-PAGE seguido de análisis 2D SWB. Los perfiles de expresión globales obtenidos a partir de los geles de 2D fueron bastante similares; sin embargo, un análisis en profundidad mostró que la complejidad del patrón de proteínas fue inversa al grado de la diferenciación celular. células PC3 mostraron el patrón de proteínas NM más complejo y 22Rv1 muestran un patrón intermedio entre LNCaP y células PC3 (Fig. 1C, E y G). En promedio, se detectaron 725 manchas de proteínas en el NM aislado de células LNCaP (rango 598 a 781), 847 (rango de 808 a 909) a partir de células 22Rv1 y 918 (rango de 727 a 1142) de las células PC3. El diagrama de Venn informado en la Fig. 2A muestra que la mayoría de los lugares visualizados en partido 2D-PAGE en tres líneas celulares, de acuerdo con el resultado, ya se ha informado, que más del 70% de las proteínas NM son comunes entre las líneas celulares y tejidos de CaP; estas proteínas son el componente de NM-tipo específico de célula [9], [16]. Las manchas de manera diferente expresadas en 22Rv1 y PC3, con respecto a las células LNCaP, eran 98 y 155, respectivamente. En particular, 22 puntos fueron sobreexpresados y 76 eran menores de expresarse en células 22Rv1 y 98 fueron sobreexpresados y 57 fueron menores de expresarse en PC3. Esta observación confirma los resultados previos que indican que el patrón de proteínas NM experimenta cambios con la diferenciación celular [16] y el aumento de la complejidad en el paso de más- a los tumores menos diferenciados [7], [8], [17].
Cuando geles 2D se analizaron por SWB, varias proteínas NM ligado fuertemente la secuencia XmnI (Fig. 1D, F y H). La unión era una secuencia específica en lugar de una interacción no específica (electrostática), porque después de la incubación de las membranas durante la noche en 2 M NaCl la unión era todavía detectable (datos no mostrados). De acuerdo con el análisis 1D, la unión se observó una disminución global de ADN en función de la diferenciación celular: aproximadamente 136 puntos MAR-unión se visualizan en LNCaP, 79 en 22Rv1 y 63 en las células PC3. En su conjunto, este análisis muestra que un aumento en la complejidad del patrón de proteínas NM es síncrona con una disminución del número de proteínas de unión a la secuencia de XmnI. De hecho, estos últimos fueron 19, 9 y 7% de la proteína total, expresada NM para LNCaP, 22Rv1 y células PC3, respectivamente (Fig. 2 B-D).
Los puntos de unión director XmnI fueron identificados por el BM y así fue posible asignar una identidad a las proteínas detectadas por 1D BS. El primer grupo, con un peso molecular más alto, corresponde a la co-migración de PARP1, ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) T, Marpa y Matrin3; el segundo grupo corresponde a MARPb, lamina A, B y lamina hnRNP H; y el tercer grupo corresponde a PARP2, hnRNP I, hnRNP K y los fragmentos de PARP1 y SATB1.
La comparación entre los SWB 2D de las diferentes líneas celulares muestran suplente que, además de una alteración del número de proteínas expresado también la intensidad de la señal de unión a ADN de una parte de su cambio. Los cambios más evidentes fueron entre células LNCaP y PC3, mientras que, también en este caso, el comportamiento de las células 22Rv1 fue intermedia. Por lo tanto, los siguientes análisis se llevaron a cabo la comparación de los dos celulares más disímiles es decir PC3 LNCaP vs.
La expresión y localización de PARP y SATB1 dependerá del nivel de diferenciación de las células de CaP
células PC3 con respecto LNCaP, la intensidad de la señal de la unión al ADN de Matrin3, fragmento SATB1, hnRNP U y todos los hnRNPs básicos disminuyeron. Esta disminución puede deberse a abajo-expresión de los hnRNPs básicas (que estaban entre los 57 puntos que se encuentran a estar bajo-expresado en células PC3), un cambio en la relación de la expresión de diferentes isoformas (por ejemplo, para hnRNP U y Matrin3) o un patrón diferente de fragmentación (por SATB1). A la inversa, la expresión de PARP2, Marpa y MARPb aumentó. Aunque estas dos últimas proteínas estaban presentes en una cantidad tan pequeña que a menudo no se detectaron por tinción con plata (Fig. 1C y G), que unidos muy fuertemente a la Marte. Por desgracia, como ya se ha informado [4], Marpa y MARPb no han sido todavía indentified y son muy propensos a ser nuevas proteínas no caracterizadas. Por lo tanto, hemos cuantificado la expresión de las proteínas que diferencialmente limitan la secuencia XmnI por análisis 1D WB utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.
Diagramas que ilustran las cantidades relativas de proteínas y experimentos WB representativos se muestran en la Fig. 3. Para hnRNP U y Matrin3, sólo una tendencia hacia una disminución puede observarse en PC3 con respecto a las células LNCaP; viceversa, tanto PARP y SATB1 sufren modificaciones significativas en su expresión. se detectó la expresión de PARP Superior en células PC3, y la proteína estaba en su estado nativo con sólo una pequeña cantidad (aproximadamente 19%) de la descomposición característica para 89 kDa [18] detectado. De la expresión de esta proteína en las células PC3 (que representan un fenotipo más diferenciado con respecto a las células LNCaP) está de acuerdo con la correlación inversa entre el grado de diferenciación celular y la actividad PARP [18].
En lo que respecta a SATB1, dos destacadas bandas de aproximadamente la misma intensidad a los 89 años (SATB1 nativa) y 54 kDa son detectables en las células LNCaP. En las células PC3, la expresión de la proteína de longitud completa disminuye y tres fragmentos de 62, 54 y 43 kDa están presentes. Además, la intensidad de estas tres bandas disminuye a 60% con respecto al intacta SATB1, lo que indica que no sólo era la proteína diferente expresado entre las dos líneas de células, pero que la intensidad y el patrón de fragmentación era diferente también (Fig. 3). Los productos más comunes de degradación SATB1 dos fragmentos de aproximadamente 70 y 30 kDa [19], a pesar de que otros fragmentos, con pesos moleculares muy cerca de los observados en nuestros experimentos, también se informó de [20], [21]. El anticuerpo policlonal de cabra usado en este estudio reconoce la SATB1 N-terminal; Por lo tanto, esperábamos para detectar las bandas correspondientes a SATB1 de larga duración y los péptidos más cortos. En cambio, en las células LNCaP el producto de degradación principal era un fragmento de 54 kDa que podría corresponder a la deleción C-terminal de aminoácidos 494 (Mr calculado 54.915) que contiene los dominios necesarios para la localización en el NM y para la unión a los Mars [22 ]. Como confirmación de lo anteriormente dicho, en 2D SWB (Fig. 1D), se detectó un fragmento de unión a la secuencia SATB1 XmnI de aproximadamente 54 kDa. Por otra parte, la existencia de un patrón de fragmentación de proteínas diferentes en PC3 con respecto a LNCaP no se debe a la presencia de poblaciones de apoptosis porque no detectamos cualquier fragmentación de ADN ni cuerpos apoptóticos en preparaciones de células (datos no presentados). Por lo tanto, es posible que los patrones de escisión dependen del estado de diferenciación y de proliferación particular de una célula [21] altamente, [23]. La razón por la cual todo el SATB1 no migra en 2D a pesar de la migración en los experimentos 1D WB es actualmente desconocido. Se podría depender de la baja concentración de la proteína en la solución utilizada para cargar muestras en tiras de gel para el isoelectroenfoque, incluso si los problemas de solubilidad no pueden ser excluidas.
Para determinar si la distribución e interacción de PARP y SATB1 con el ADN y o secuencias /MAR cambian como una función del grado de diferenciación de las células, se realizó un análisis de microscopía confocal.
en las células LNCaP y PC3 enteros, PARP (visualizado en verde en la Fig. 4A) estaba presente en el nucleoplasma donde aparece una tinción granular homogéneo, de acuerdo con investigaciones anteriores [24]. [25]. 5B.