Extracto
Hemos demostrado que el bloqueo de CXCR4 podría ser una terapia anti-metastásico potente para el cáncer oral CXCR4-relacionado. Sin embargo, como antagonistas de CXCR4 están actualmente en uso clínico para inducir la movilización de células madre hematopoyéticas, la administración continua como un inhibidor de la metástasis puede conducir a leucocitosis persistente. En este estudio, se investigó la novela abajo objetivo terapéutico (s) del sistema /CXCR4 SDF-1, utilizando B88-SDF-1 en las células, que tienen un sistema autocrino SDF-1 /CXCR4 y exhiben distante potencial metastásico
In
vivo. el análisis de microarrays reveló que 418 genes fueron regulados por incremento en B88-SDF-1 en las células. Se identificó un gen que es altamente upregulated en células B88 1-SDF-, metabotrópicos del receptor de glutamato 5 (mGluR5), que fue downregulated después del tratamiento con 1,1 '- [1,4-fenilen (metilen)] bis-1,4 , octahidrocloruro 8,11-tetraazaciclotetradecano (AMD3100), un antagonista de CXCR4. La regulación al alza de mGluR5 ARNm en el sistema /CXCR4 SDF-1 fue predominantemente regulado por la quinasa regulada por señal extracelular-Ras (ERK) 1/2 vía. Además, el crecimiento de B88-SDF-1 células no se vio afectada por el agonista de mGluR5 (S) -3,5-DHPG (DHPG) o los antagonistas de mGluR5 2-metil-6- (feniletinil) piridina (MPEP) y 3- ((2-metil-1,3-tiazol-4-il) etinil) piridina (MTEP). Sin embargo, se observó que DHPG promovido B88-SDF-1 la migración celular, mientras que tanto MPEP y MTEP inhibidos B88-SDF-1 migración celular. Para evaluar la toxicidad del fármaco, los antagonistas se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones inmunocompetentes para 4 semanas. Los ratones inyectados con MPEP (5 mg /kg) y MTEP (5 mg /kg) no mostró efectos secundarios, tales como hematotoxicidad, reacciones alérgicas o de pérdida de peso. La administración de antagonistas de inhibió significativamente la metástasis de las células B88-SDF-1 a los pulmones de ratones desnudos. Estos resultados sugieren que el bloqueo de mGluR5 con antagonistas tales como MPEP y MTEP podría prevenir la metástasis en el cáncer oral relacionada con el CXCR4 sin causar efectos secundarios
Visto:. Kuribayashi N, Uchida D, Kinouchi H, Takamaru N, Tamatani T, Nagai H, et al. (2013) El papel de los receptores de glutamato metabotrópicos 5 en el sistema derivado de células del estroma factor-1 /CXCR4 en el cáncer oral. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10.1371 /journal.pone.0080773
Editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2013; Aceptado: 6 Octubre 2013; Publicado: 13 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kuribayashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B; 24792225; http://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hemos demostrado previamente que las células B88, las células cancerosas orales que expresan el receptor de quimiocinas CXCR4, específicamente. metástasis a los ganglios linfáticos cervicales a través de un factor derivado de células estromales (SDF) -1 gradiente producido por el estroma linfático [1-3]. La expresión forzada de SDF-1 en las células B88 (llamado células B88-1-SDF) conferido mejora la motilidad celular y metástasis pulmonares después de la inoculación intravenosa [4]. Recientemente, también hemos demostrado que la expresión de CXCR4 contribuye al potencial metastásico de cáncer de las glándulas salivales [5]. Además, también hemos demostrado que el bloqueo de CXCR4 con 1,1 '- [1,4-fenilen (metilen)] bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano octahidrocloruro (AMD3100), un antagonista de CXCR4, puede ser un potente anti La terapia -metastatic de cabeza relacionados con el CXCR4 y el cáncer de cuello [5,6].
SDF-1 sistema /CXCR4 funciona principalmente como un factor quimiotáctico en las células cancerosas para llegar a los sitios de metástasis. Sin embargo, con el fin de establecer la metástasis, varios procesos importantes, como la invasión, intravasación, extravasación y potencial de crecimiento ectópico, son indispensables. Por lo tanto, es crítico para investigar la función de objetivo (s) aguas abajo responsable del establecimiento de la metástasis en el sistema /CXCR4 SDF-1. Por otra parte, los ensayos clínicos recientes han demostrado que una sola administración de AMD3100 es eficaz en la movilización de células madre hematopoyéticas, a pesar del hecho de que AMD3100 se elimina rápidamente con un estimado de vida media de distribución de 0,3 horas y la vida media terminal de 5,3 horas [7, 8]. Sin embargo, las terapias eficaces relacionadas CXCR4-anti-metastásicos pueden requerir la administración diaria de AMD3100 para evitar continuamente la migración de las células premetastatic a sitios metastásicos, que pueden causar leucocitosis crónica. Si se identificaron el gen diana aguas abajo (s) de SDF-1 sistema /CXCR4 se expresa específicamente en las células cancerosas, se espera que la terapia anti-metastásico podría ser realizado de forma más segura y eficaz. Sin embargo, el gen (s) objetivo de sistema /CXCR4 SDF-1 no se entienden completamente. Por lo tanto, en este estudio, se investigó la novela abajo objetivo terapéutico (s) del sistema SDF-1 /CXCR4 en las células B88-SDF-1, que tienen un sistema autocrino SDF-1 /CXCR4 y exhiben potencial de metástasis a distancia en vivo, utilizando microarrays de ADNc [4].
Materiales y Métodos
Ética declaración
Los ratones fueron tratados de acuerdo a las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Tokushima (Número de Permiso: 10084). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
cDNA microarray análisis
El ARN total para el análisis de microarrays de ADNc fue extraído de las células B88-maqueta privadas de suero y células B88-SDF-1. El Biosystems quimioluminiscente RT-IVT kit de marcado Aplicada (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para convertir el ARN total con digoxigenina (DIG) marcado con ARNc. Una g de ARN total se utiliza para generar el ADNc de doble hebra. El cDNA fue transcrito con nucleótidos marcados con DIG (Roche Diagnostics, Basel, Suiza), fragmentadas y hibridado con matriz Encuesta del Genoma Humano (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Después de lavar cada matriz, la señal fue desarrollado con el uso de un kit de detección quimioluminiscente (Life Technologies). arrays procesados fueron escaneados con un analizador de microarray quimioluminiscente 1700 (Life Technologies). Estos resultados fueron analizados con el uso de GeneSpring GX 12,5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y análisis Ingenuity Pathway (IAP; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA) de software. Análisis funcional de IPA identifica funciones o enfermedades que eran más significativo al conjunto de datos biológicos. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para calcular un valor de p para determinar la probabilidad de que cada función biológica o enfermedad asignado a ese conjunto de datos se debió a la casualidad. Los microarrays de datos en bruto se depositan en la Expresión Génica Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) de acuerdo con la información mínima sobre directrices para experimentos de microarrays (MIAME). El número de acceso es GSE50507.
Células y cultivo celular
B88 células fueron establecidas originalmente de un paciente con cáncer de lengua [1] y consideradas libres de micoplasmas y bacterias contaminantes. Las células se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina en una atmósfera humidificada de 95 % de aire y 5% de CO2 a 37 ° C
ensayo de glutamato
Un total de 5 x 10
6 células, se sembraron en placas de 100 mm (Falcon;. Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). El medio se reemplazó con DMEM sin L-glutamina y FCS después de 24 h. Después de un adicional de cultivo de 24 h, se recogió el medio acondicionado y 100 l se analizó con un Amplex® Red ácido glutámico /glutamato oxidasa Assay Kit (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se midió con un lector de Flash multimodo Varioskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) con 530 nm de excitación y 590 nm de detección de fluorescencia.
Ratones y estudio in vivo
C3H /solteros, ratones y BALB /c ratones desnudos fueron adquiridos de CLEA Japón (Osaka, Japón) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. En la quimioterapia experimental, los ratones C3H /HeN se utilizaron como ratones de control inmunocompetentes [9], y se trataron diariamente con (sc) inyecciones subcutáneas de AMD3100 (2,5 mg /kg; Sigma) [5,6] o intraperitoneales (ip) inyecciones de 2-metil-6- piridina (feniletinil) (5 mg /kg; MPEP; Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) [10], 3 - ((2-metil-1,3-tiazol-4-il) etinil ) piridina (5 mg /kg; MTEP; Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) [10], o el mismo volumen de solución salina. Los ratones tratados con AMD3100 se sacrificaron en el día 1, 14 y 28, y los ratones tratados con MPEP o MTEP se sacrificaron en el día 1, 7, 14, 21, y 28. Todos los ratones fueron sacrificados por desangrado bajo anestesia con pentobarbital sódico y una sangre completa contar se ha realizado mediante un ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Tokio, Japón) a Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japón). Para el ensayo de metástasis, 1 x 10
6 B88-SDF-1 células se inocularon por vía intravenosa (i.v.) antes del tratamiento con agentes. Los ratones fueron sacrificados 30 días después de la inoculación de células, y los pulmones se extirparon y atravesada. Una media del pulmón se fijó para el análisis histopatológico y se tiñó con H-E y el otro se lisó para el análisis cuantitativo utilizando Alu-PCR. Los cebadores que se utilizaron para Alu-PCR fueron HALU-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, HALU-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. productos específicos del gen se midieron de forma continua por un ABI PRISM 7000 Sequence Detection System durante 35 ciclos utilizando SYBR qPCR THUNDERBIRD Mix (Toyobo, Osaka, Japón).
RT-PCR
Las células se cultivaron como monocapas fueron cosechadas en sub-confluencia. Después de 24 h, se aisló ARN con el reactivo TRIzol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. RT-PCR para mGluR5 y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mRNA se realizó bajo las siguientes condiciones: 94 ° C durante 2 min; luego 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min y 72 ° C durante 1 min; y una extensión final a 72 ° C durante 1 min. primer secuencias de mGluR5 humano y GAPDH fueron los siguientes: mGluR5-UP: 5'-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 ', mGluR5-DN: 5'-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3', GAPDH-UP: 5'-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ', y GAPDH- DN: 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 '. Por RT-PCR cuantitativa, se analizó la expresión de mGluR5 y GAPDH por un
Δ
? Ct método. mGluR5 y mRNA GAPDH se detectaron simultáneamente con Taqman
TM génica ensayos de expresión (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. productos específicos de genes se midieron continuamente por un sistema de PCR ABI StepOnePlus en tiempo real durante 40 ciclos de PCR.
El análisis de citometría de flujo
Logarítmicamente se trataron con tripsina y se fijaron en paraformaldehído al 4% (V células en crecimiento /V) en hielo durante 10 min. Las células se lavaron y se incubaron con anti-mGluR5 mAb (dilución 1: 100; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con D-PBS (-), después se incubaron con ficoeritrina (PE) marcado con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (Serotec, Sapporo, Japón) durante 30 min a temperatura ambiente y se analizaron con un citómetro EPICS flujo (Coulter, San Jose, CA, EE.UU.)
análisis de inmunofluorescencia
las células fueron sembradas en el Halcón CultureSlides (Falcon;. Becton Dickinson Labware). Veinte horas después, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS, la unión no específica se bloqueó con 1% de BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal primario de conejo contra mGluR5 (Genway Biotech, San Diego, CA, EE.UU.). se utilizó Alexa Fluor 488 conjugado con anticuerpo IgG anti-conejo (Life Technologies) para la detección. Las diapositivas se counterstained con DAPI (Life Technologies) y se monta con Prolong Reactivo Antifade Oro (Life Technologies). Las señales de fluorescencia se observaron con un microscopio confocal (Nikon, Tokio, Japón). Para la detección de F-actina, B88-SDF-1 en las células se incubaron con 100 mM mGluR5 agonista, (S) -3,5-DHPG (DHPG; TOCRIS) [12], MPEP 20 M o 20 MTEP M. Después de 24 h, las células se tiñeron con Alexa Fluor 488 faloidina conjugada (Life Technologies) y la inmunofluorescencia se detectó con un microscopio de epifluorescencia (Nikon, Tokio, Japón).
ensayo MTT
Un total de 5 x 10
3 células fueron sembradas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson Labware) en DMEM suplementado con 10% de FCS . Después de 24 h de cultivo, las células se trataron con 100 mu M DHPG, MPEP 20 M o 20 MTEP mu M durante 48 h. El número de células se cuantificó usando el ensayo MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, Sigma].
herida ensayo
Después 24 h de cultivo, una herida lineal se generó por raspado a monocapas confluentes de células con una punta de pipeta en presencia de ya sea 100 mu M DHPG o 20 MPEP M o 20 MTEP M. células no unidas se lavaron con agitación. Las células fueron imágenes en la misma ubicación de rejilla después de 48 h. Cada línea se sembró y herido por triplicado.
in vitro la migración de células de ensayo
Se evaluó el
in vitro
migración de las células de cáncer oral usando una cámara Transwell (Corning, Corning, NY, EE.UU.). Las células en los poros de la membrana o las células unidas a la superficie inferior de la membrana se contaron en 10 campos de visión a gran aumento (x 400). En algunos experimentos, 100 M DHPG, se añadió 20 MPEP M o 20 MTEP mu M a las células sembradas en la cámara superior.
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticas entre los valores medios de los diferentes grupos de tratamiento fueron evaluados con Statview 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, EE.UU.) utilizando un ANOVA de una vía con el conjunto importancia a
p Hotel & lt; 0.05.
Resultados
Aislamiento del gen diana, metabotrópicos del receptor de glutamato 5, que es inducido por el sistema de SDF-1 /CXCR4
Investigamos nueva diana aguas abajo terapéutico ( s) del sistema SDF-1 /CXCR4 utilizando las células de cáncer oral, B88-SDF-1, que tienen un sistema autocrino SDF-1 /CXCR4 y que exhiben potenciales metastásicos distantes
in vivo
. Microarray análisis reveló que 418 genes se upregulated en B88-SDF-1 en las células en comparación con células simuladas, y que la expresión del receptor metabotrópico de glutamato 5 (mGluR5) aumentó 46 veces (quinto desde la parte superior) en B88-SDF-1 en las células, con la puntuación más alta correspondiente a la vía de mGluR5 como se muestra por IPA (datos no mostrados). Por otra parte, Park y sus colegas demostraron que la expresión fuerte mGluR5 se asocia con la supervivencia del paciente y que los antagonistas de mGluR5 inhiben la migración de las células de cáncer oral
in vitro
[13]. Por lo tanto, se analizaron mGluR5 como un posible gen candidato implicado en el sistema /CXCR4 SDF-1. Para confirmar la especificidad del análisis de microarrays, la expresión de mRNA de mGluR5 fue confirmada por RT-PCR. Similar a los resultados de los microarrays, la expresión de mRNA de mGluR5 se upregulated en B88-SDF-1 células, en comparación con las células falsos (Figura 1A) y se inhibe por el tratamiento con AMD3100 (Figura 1A). Hemos demostrado anteriormente que el sistema /CXCR4 SDF-1 activa tanto el Ras-regulada por señal extracelular-quinasa (ERK) 1/2 y la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) itinerarios -Akt [1]. Por lo tanto, el próximo examinó la participación de estas vías en la regulación al alza de mGluR5. La expresión de mGluR5 fue completamente abrogada por tratamiento con U0126, un inhibidor de MEK y parcialmente inhibida con wortmanina, un inhibidor de PI3K (Figura 1B). También obtuvimos los resultados similares en la RT-PCR cuantitativa (Figura 1C). Por otra parte, la regulación al alza de la proteína mGluR5 también se observó en citometría de flujo y los resultados de inmunocitoquímica (Figura 1D, E).
(A) Expresión de ARNm de mGluR5 se confirmó en B88-B88-mock y SDF-1 células, tanto en la presencia y ausencia de AMD3100 (1 mg /ml). placenta humana se utilizó como control positivo (PC). (B) Las células se trataron con se analizó por RT-PCR U0126 (10 nM) o wortmanina (50 nM) durante 48 h y la expresión de ARNm de mGluR5. (C) Expresión de mRNA mGluR5 fue confirmada por la PCR en tiempo real. **;
p Hotel & lt; 0,01 cuando se compara con las células B88-SDF-1 no tratados por ANOVA de una vía. DAKOTA DEL NORTE; indetectable. (D) Expresión de proteínas de mGluR5 se evaluó en B88-mock y las células B88-SDF-1 mediante citometría de flujo. Logarítmicamente células en crecimiento se incubaron con o sin mAb anti-mGluR5 y se tiñeron con anticuerpo de cabra marcado con PE anti-IgG de ratón. zonas blancas y rojas indican las células teñidas con el control de isotipo y el anti-mGluR5 mAb, respectivamente. (E) Expresión de proteínas de mGluR5 se detectó por inmunocitoquímica. El núcleo fue teñido con DAPI (azul)
La expresión de los receptores de glutamato en las células B88-1 SDF-
Los receptores de glutamato se dividen en dos categorías.; mGluRs y GluRS ionotrópicos (iGluRs), que se caracterizan adicionalmente como sea N-metil-D-aspartato (NMDA), a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPA) o receptores de kainato (KA) [14,15]. Hemos validado la expresión de los receptores de glutamato involucrados en el sistema SDF-1 /CXCR4 usando una micromatriz de ADNc. De los 8 tipos de mGluRs examinados, sólo la expresión de mGluR5 se upregulated notablemente en B88-SDF-1 en las células (Tabla 1). Además, de los 14 tipos de iGluRs examinados, la expresión de GluR1, un receptor de AMPA, el aumento de 6 veces en la B88-SDF-1 en las células (Tabla 2).
Grupo
mGluRs
Doble induction
*
ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. Expresión de mGluRs en el análisis de microarrays de ADNc.
* Regulación al alza de B88-SDF-1 en las células frente a las células B88-maqueta CSV Descargar CSV Grupo
iGluRs
Fold inducción
*
AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. Expresión de iGluRs en el análisis de microarrays de ADNc.
* Regulación al alza de B88-SDF-1 en las células frente a las células B88-maqueta CSV Descargar CSV
La producción de glutamato en las células de cáncer oral
A continuación examinó la producción de glutamato, un ligando de mGluR5, en B88 y sus transfectantes, B88-B88-simuladas y SDF-1 células. la producción de glutamato se detectó en el medio acondicionado derivado de estas células a una concentración de aproximadamente 12 mM (Tabla 3). Sin embargo, la producción de glutamato no era dependiente de o bien el sistema SDF-1 /CXCR4 o el nivel de expresión de mGluR5. Las células B88
B88-B88 simulacro
-1-SDF liberación de glutamato
(M) 12.23 ± ± 0.3012.17 0.1712.21 ± 0.29Table 3. La producción de glutamato en el cáncer oral las células.
CSV Descargar CSV
el papel de mGluR5 en el crecimiento celular
Se examinó el efecto de mGluR5 en el crecimiento celular mediante el uso de un agonista específico mGluR5, DHPG, y dos antagonistas, MPEP y MTEP. El agonista y antagonistas no afectaron el crecimiento de cualquiera de los B88-mock o las células B88-SDF-1 (Figura 2).
una monocapa confluente de células se trataron con 100 mu M DHPG, 20 MPEP mu M (A) o MTEP 20 mM (B). El efecto de mGluR5 sobre el crecimiento celular se evaluó usando el ensayo de MTT. No hubo diferencias significativas entre los tres grupos por ANOVA de una vía.
El papel de mGluR5 en SDF-1 /CXCR4 dependiente de la migración de células
A continuación se investigó el efecto de mGluR5 en la migración SDF-1 /CXCR4 dependiente de las células. ensayos de curación de heridas revelaron que la motilidad mejorada de B88-SDF-1 células se aceleró aún más con el tratamiento DHPG, pero se vio afectada significativamente por MPEP y tratamiento MTEP (Figura 3A, B). Los antagonistas de mGluR5 también inhibieron la migración de las células B88-SDF-1, como se muestra mediante un ensayo de cámara de migración (Figura 3C). Por otra parte, DHPG mejorado la polimerización de actina F en el borde delantero, mientras que MPEP y MTEP inhiben la polimerización de actina F (Figura 3D-G). También se observó la inhibición de la invasión de Matrigel con el tratamiento MTEP en B88-SDF-1 en las células (datos no presentados).
(A) B88-B88-mock o SDF-1 células fueron cultivadas hasta confluencia. Un ensayo de curación de la herida se llevó a cabo en presencia de cualquiera de 100 mu M DHPG, MPEP 20 M o 20 MTEP M. (B) Los datos cuantitativos derivados de (A). *;
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas con DHPG por ANOVA de una vía. (C) La motilidad de B88-SDF-1 en las células en presencia de ya sea 100 mu M DHPG, 20 MPEP M o 20 MTEP mu M se examinó usando un ensayo de migración transwell. *;
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control sin tratar o las células tratadas con DHPG por ANOVA de una vía. polimerización (D-G) F-actina en el borde delantero de B88-SDF-1 células fue examinado por la inmunocitoquímica siguiente (D) sin tratamiento, el tratamiento (E) DHPG, (F) tratamiento MPEP y (G) de tratamiento MTEP. Núcleo se tiñó con DAPI (azul).
Efecto de los antagonistas de mGluR5 en ratones inmunocompetentes
Debido a que el mGluR5 puede ser un objetivo novedoso metastásico en el cáncer oral, se evaluaron los efectos secundarios de los antagonistas de mGluR5 en ratones C3 /soltera. No hay pérdida de peso o anormalidades macroscópicas de órganos se detectaron en ratones que fueron tratados con los antagonistas de mGluR5 MPEP y MTEP (datos no mostrados). Por otra parte, estos antagonistas no indujeron hematotoxicities como la anemia y leucocitosis (Figura 4A-C). También se evaluaron los efectos secundarios de AMD3100 en ratones C3H /soltera. No hay pérdida de peso, anomalías macroscópicas de órganos o cambio en las células rojas de la sangre recuento se observó en ratones administrados con AMD3100 (datos no mostrados); sin embargo, se observó leucocitosis significativa y crónica después de diario s.c. administración de AMD3100 (datos no mostrados).
ratones C3H /solteros, fueron tratados por vía intraperitoneal con MPEP (5 mg /kg), MTEP (5 mg /kg) o el mismo volumen de solución salina diariamente. Los ratones fueron sacrificados en el día 1, 7, 14, 21, y 28 por desangrado y CMB (
Un
), glóbulos rojos (RBC; B) y hemoglobina; se midieron los niveles (Hb C). No hubo diferencias significativas entre los tres grupos por ANOVA de una vía.
El papel de mGluR5 en el /CXCR4 dependiente de la metástasis de las células
SDF-1
Por lo tanto, se determinó la efecto de los antagonistas de mGluR5 en metástasis de pulmón de células B88-SDF-1. se detectaron numerosos nódulos metastásicos en los pulmones de los ratones que fueron inoculados con B88-SDF-1 en las células (Figura 5A, izquierda). Sin embargo, se observó una reducción significativa en los nódulos pulmonares metastásicos en ratones tratados con MPEP (Figura 5A, medio) y MTEP (Figura 5A, derecha), como se muestra por análisis histopatológico durante un periodo de observación de 4 semanas. También confirmó la presencia de células cancerosas metastásicas en tejido pulmonar extraído utilizando cuantitativa Alu-PCR. En consecuencia, la expresión del ADN Alu humano en ratones tratados con antagonistas de mGluR5 fue significativamente menor que en los ratones tratados con solución salina (Figura 5B).
Las células se inocularon en el vaso sanguíneo de ratones desnudos, que se sacrificaron el día 30. (A) Representante H & amp; E tinción de los pulmones de control tratado-(izquierda), MPEP tratados (medio), MTEP-tratada (derecha) ratones desnudos. (B) Análisis cuantitativo por Alu-PCR se realizó en los tejidos pulmonares-extirpado. **,
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con el control de solución salina por ANOVA de una vía.
Discusión
El glutamato es un ligando único para mGluR5, un receptor de glutamato metabotrópico que pertenecen a la familia de la proteína G acoplada receptores [16,17] que se encuentra de forma ubicua en la corteza cerebral, el hipocampo, núcleo caudado y el núcleo accumbens del sistema central nervioso (CNS) [16,17]. Se ha sugerido que mGluR5 está implicado en trastornos del SNC que son inducidos por la hipersecreción de glutamato, tales como la epilepsia, el dolor neurogénico o inflamatoria, psicosis, discinesia, dolores de cabeza y adicción a las drogas [16,17]. A nivel celular, mGluR5 regula el crecimiento y la migración de las células gliales [18], las células madre precursoras neuronales [19], las células madre embrionarias [20] y células de glioma [21]. Aunque el papel de mGluR5 en la progresión del cáncer sigue siendo poco clara, investigaciones recientes sugieren que las funciones de mGluR5 en el colon [22], de mama [22] y las células de cáncer de próstata [23]. Por otra parte, Park y sus colegas demostraron que la expresión fuerte mGluR5 se asocia con la supervivencia del paciente y que los antagonistas de mGluR5 inhiben la migración de las células de cáncer oral
in vitro
[13]. Estos resultados sugieren que las funciones de mGluR5 como un oncogén en cánceres sólidos, incluyendo cáncer oral. En las otras manos, las investigaciones recientes han demostrado que el glutamato es producido por células mesenquimales, tales como osteoblastos y osteoclastos, células epiteliales, tales como las células de los islotes pancreáticos y queratinocitos, de mama y células de cáncer de próstata [24-27]. Adicionalmente, se ha reportado la producción de glutamato en células de glioma que se asocia con la proliferación y la invasión [21,28,29]. Además, bañarse y colegas demostraron aumentaron significativamente las concentraciones de glutamato en el suero de pacientes con cáncer de páncreas, tal como se mide por análisis de la metabolómica [30]. En el presente estudio, hemos demostrado que las células B88 y sus derivados transfectadas, producen glutamato en su medio condicionado a una concentración de aproximadamente 12 mM. Estas concentraciones fueron similares a los hallazgos descritos por Seidlitz y sus colegas en la línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-231 [29]. Estos resultados indican que el glutamato y su receptor están asociados con la progresión del cáncer. Sin embargo, no se observó diferencia en la producción de glutamato entre la B88-mock y las células B88-SDF-1, aunque la expresión de mGluR5, un receptor para el glutamato, se upregulated en B88-SDF-1 en las células. Estos resultados sugieren que la expresión de mGluR5, en lugar de la producción de glutamato, es necesario para el sistema glutamatérgico a estar implicada en la señalización /CXCR4-1 SDF.
Recientemente, los antagonistas de mGluR5 sintéticos se han desarrollado como fármacos potenciales para trastornos del SNC que son inducidos por la hipersecreción de glutamato [11,31,32]. Se ha informado de que la administración de MPEP y MTEP se ha utilizado para tratar eficazmente los síntomas de dolor, la enfermedad de Parkinson, el trastorno de la cognición, la depresión, la ansiedad y la esquizofrenia [16,17]. A pesar de que inicialmente utilizó MPEP como un antagonista mGluR5 en este estudio, las acciones no específicas significativas de MPEP, incluyendo la inhibición de los receptores AMPA o NMDA, se han indicado [10]. Además, se detectó un aumento de 6 veces en la expresión de GluR1, un receptor de AMPA que participan en el crecimiento y la invasión de células de glioma, en B88-SDF-1 en las células [33,34]. Para excluir el efecto no específico de MPEP en mGluR5, que re-evaluado el papel de mGluR5 en el sistema SDF-1 /CXCR4 utilizando el recientemente desarrollado mGluR5 antagonistas MTEP, que es más altamente selectivo para el receptor mGluR5 y tiene menos efectos fuera de la meta de MPEP [10]. Sin embargo, tanto MPEP y MTEP tenían efectos similares sobre la migración y metástasis de las células B88-SDF-1, lo que indica un efecto específico de mGluR5 en el sistema /CXCR4 SDF-1.
No se detectaron efectos aditivos de los agonistas de mGluR5 DHPG en ensayo de migración, a pesar de que contiene una gran cantidad de glutamato en los medios. Aunque no se observó la activación directa de mGluR5, se considera que DHPG probablemente activar mGluR5 en B88-SDF-1 células debido DHPG no aumentó la migración de las células simuladas, que no expresan mGluR5 (datos no mostrados). Cleva y Olive demostraron que mGluR5 están acoplados físicamente a los receptores de NMDA por diversas proteínas de andamiaje, y están acoplados bioquímicamente a la función del receptor de NMDA a través de PKC [35]. Además, esta interacción mGluR5-NMDA se ha observado en numerosas preparaciones de cerebro, por lo que la activación de receptores de mGluR5 con DHPG potencia las respuestas mediadas por el receptor de NMDA al glutamato o NMDA [35] aplicados exógenamente. Dado que las células B88-SDF-1 expresan los receptores de NMDA en nuestro análisis de microarrays (Tabla 1), este efecto aditivo de DHPG podría ser debido a la activación concomitante de vía del receptor de NMDA.
En el presente estudio, se demostró la participación de la vía Ras-ERK1 /2 en la regulación al alza de mGluR5 por el sistema /CXCR4 SDF-1. Aunque una asociación entre mGluR5 y el sistema de SDF-1 /CXCR4 no se ha informado en las células cancerosas, Luo y colegas han demostrado la inducción de mGluR5 en células precursoras neuronales E14.5 mediante la estimulación con SDF-1. También sugirieron que mGluR5 expresión por el sistema /CXCR4 SDF-1 es inducida por el factor de transcripción, Ets, que se activa por la vía ERK1 /2 señalización [36]. Debido a que el
mGluR5
gen ha Ets sitios de unión en sus promotores [37], la vía /2 /Ets CXCR4 /ERK1 podrían estar involucrados en la inducción de mGluR5 que se observó en nuestro experimento.
Hicimos el mismo experimento utilizando una línea oral de SCC celular, HNT, en el que la expresión de CXCR4 es 7,5 veces menor que la de las células B88 [1]. HNT-SDF-1 en las células se dieron cambios leves, pero no significativa, fenotípicas in vitro e in vivo [4], y la inducción mGluR5 se detectó sólo en un nivel marginal, probablemente debido a la reducción de la expresión de CXCR4, en comparación con la de células B88. Por lo tanto, el nivel de expresión de CXCR4 y fuerte de señalización corriente abajo podría ser también crítica para la activación de la vía mGluR5.
Hemos descubierto que los antagonistas de mGluR5, inhibió la SDF-1 /CXCR4 la migración dependiente y la metástasis. Aunque el sistema /CXCR4 SDF-1 funciona principalmente como un factor quimiotáctico en las células cancerosas, sino que también participa en los varios procesos metastásicos, tales como la neovascularización, la adhesión celular, invasión, y excrecencia transición epitelial a mesenquimal [38-43]. En el presente estudio, mGluR5 regula la migración celular asociado con el sistema SDF-1 /CXCR4; Sin embargo, es poco probable que los antagonistas de mGluR5 suprimen SDF-1 /CXCR4 metástasis dependiente sólo a través de la migración de células inhibida. Aunque mGluR5 se ha demostrado para mejorar la adherencia y la invasión de células de cáncer oral [13] y la derivación de células neuronales [44], hay poca información disponible sobre las funciones relacionadas con metástasis. mGluRs activan tanto las vías de MAPK y Akt, que son dos vías de señalización sello que promueven el crecimiento del cáncer y la metástasis [45,46]. Por lo tanto, la orientación mGluR5 puede suprimir estas vías metastásicas críticos e inhibir la metástasis del cáncer.
En nuestro estudio anterior, se detectó la expresión de CXCR4 en aproximadamente el 60% de los cánceres orales primarias y llegado a la conclusión de que los casos de CXCR4-positivos tenían un pronóstico significativamente peor que los casos CXCR4-negativas [3]. Aunque aún no hemos analizado la expresión de mGluR5 en tejidos de cáncer oral, Park y sus colegas demostraron que el 70% de los cánceres orales expresar mGluR5 y que la sobreexpresión del receptor mGluR5 disminuye la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer oral [13]. En su conjunto, la asociación entre el CXCR4 y mGluR5 se sugiere fuertemente para promover la progresión del cáncer oral.