Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es una enfermedad muy agresiva con pronóstico sombrío; peculiar es el microambiente tumoral se caracteriza por una extensa estroma fibrótico, lo que favorece la progresión del tumor rápido. Hemos informado anteriormente de que los pacientes con cáncer pancreático tienen un sesgo selectivo Th2 en el antígeno anti-carcinoembrionario (CEA) de CD4
+ inmunidad de células T, que se correlaciona con la presencia de un predominante GATA-3
+ infiltrado linfoide tumor. Esto tiene efectos negativos tanto en la inmunidad antitumoral eficaz y fibrinogenesis favoreciendo aún más. Objetivo de este estudio fue evaluar si la polarización Th2 específicos de CEA CD4
+ T las células de pacientes con cáncer de páncreas es estable o puede ser revertida por citoquinas inmunomoduladoras.
Metodología /Principales conclusiones
en primer lugar, se evaluó la influencia de la IL-12 e IL-27, como agentes únicos o en asociación, en la polarización de
+ clones de células T Th2 CD4 específicos de CEA de un paciente con cáncer de páncreas. Se encontró que sólo la combinación de IL-12 y IL-27 modificado la polarización de efectores Th2 por tanto la reducción de IL-5, GM-CSF e IL-13 y la inducción de la producción de IFN-γ, que duró después de la retirada de citocinas. En segundo lugar, se evaluó el efecto del tratamiento combinado en policlonal específicos de CEA CD4
+ células T en ensayos de re-estimulación de corta duración. De acuerdo con los datos obtenidos con los clones, se encontró que el tratamiento combinado modula funcionalmente la polarización Th2 específicos de CEA CD4
+ células T y mejorado preexistente Th1 tipo de inmunidad.
Conclusiones /Importancia
en conjunto, nuestros resultados demuestran que las células Th2 antígeno tumoral específico de CD4
+ T en el cáncer de páncreas están dotados de plasticidad funcional. . Por lo tanto, la entrega citoquinas loco-regional o terapia dirigida basada en anticuerpos o moléculas dirigidas al estroma del tumor podría mejorar la inmunidad anti-tumor y mejorar fibrosis, sin toxicidad sistémica
Visto: Tassi E, Braga M, Longhi R , Gavazzi F, Parmiani G, Di Carlo V, et al. (2009) El papel no redundante para la IL-12 e IL-27 en la modulación de polarización Th2 de antígeno carcinoembrionario Las células T CD4 + específicas de cáncer de páncreas pacientes. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10.1371 /journal.pone.0007234
Editor: Derya Unutmaz, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2009; Aceptado: 9 de septiembre de 2009; Publicado: 2 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Tassi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Comunidad Europea (DC-Thera), el Ministerio de Sanidad italiano, el Ministerio de Universidad e Investigación Científica italiana y la Fundación Rich (PLD Proyecto de Investigación del cáncer de páncreas). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas (CP) es una enfermedad muy agresiva con pronóstico sombrío [1]. Peculiar es el microambiente tumoral, que consiste en fibroblastos, células estrelladas pancreáticas, células endoteliales, células del sistema inmune y endocrino y perineural propagación y se cree que desempeñan un papel activo en la progresión de la enfermedad y la agresividad [2].
Recientemente [3], se determinó la calidad del antitumoral respuestas CD4
+ células T en los pacientes con CP sometidos a resección quirúrgica, mediante la comparación de los anti-carcinoembrionario (CEA) y anti-viral CD4
+ T inmunidad celular. Se encontró que el anti-CEA CD4
+ inmunidad de células T estaba presente en un número significativamente menor de pacientes de PC en comparación con los donantes normales. Lo más importante, mientras que CD4
+ T células de donantes normales producen principalmente granulocitos macrófagos factor de estimulación de colonias (GM-CSF) y el pro-inflamatoria (
es decir
, Th1) citocina interferón-γ (IFN-γ ), las células CD4
+ T de los pacientes principalmente la producción de interleuquina (IL) -5 y IL-13, lo que demuestra un sesgo hacia un anti-inflamatorio (
es decir
, Th2) tipo. Por el contrario, el grado de anti-viral CD4
+ inmunidad de células T fue comparable entre los dos grupos y mostró un tipo Th1. De acuerdo con la Th2 sesgar observado en la circulación de CEA CD4 específica las células
+ T, el análisis inmunohistoquímico de los linfocitos infiltrantes de tumores mostraron un número significativamente mayor de GATA-3
+ (Th2) en comparación con T-bet
+ (Th1) las células linfoides, apoyando un Th2 sesgan también en el sitio del tumor.
se ha demostrado que la fibrosis, que es un sello en PC, está fuertemente relacionado con el desarrollo de respuestas Th2 a través de la activación por citoquinas Th2 de la síntesis de colágeno por los fibroblastos y la degradación del colágeno reducida concomitante en ausencia de citoquinas Th1 [4]. Por lo tanto, la presencia de GATA-3
+ células linfoides, que se observó [3] en el microambiente del tumor de páncreas, podría contribuir aún más a la fibrosis y tratamientos locales destinados a reducir la presencia de citocinas Th2 puede ser beneficiosa.
Entre los diversos factores que promueven CD4
+ T células polarización, las citoquinas tienen un papel determinante [5]. IL-12, un producto de los fagocitos y células dendríticas en respuesta a la estimulación microbiana, tiene un papel importante en la promoción de la polarización Th1 y en la mejora de CD4
+ T células proliferación [6]. Por otra parte, IL-12 se ha demostrado que induce la inversión de polarización Th2 en las células Th2 específicas de alérgeno humanos [7], [8] y, en sinergia con la IL-18, para estimular la producción de IFN-γ de células mononucleares de sangre periférica (PBMC ) de pacientes con lepra lepromatosa [9]. IL-27, un miembro recientemente identificado de la familia IL-12 [10], también estimula la proliferación y la sinergia con IL-12 en la activación de la producción de IFN-γ de ingenuo CD4 células
+ T [10], [11]. Más recientemente, se ha demostrado [12] que la IL-27 inhibe Th2 polarización de murino naïve CD4
+ células T y suprime Th2 citoquinas la producción de
in vitro
células Th2 polarizadas.
en el presente estudio se investigó la posibilidad de revertir la polarización Th2 de
de buena fe in vivo
imprimado específicos de CEA CD4
+ T las células de pacientes de PC mediante el uso de IL-12 e IL-27 como inmunomodulador agentes. Hemos encontrado que la presencia de IL-27 sola era suficiente para inhibir la IL-5 y la secreción de IL-13, mientras que la IL-12 estimula fuertemente la producción de IFN-γ con efectos menores sobre Th2 citoquinas secreción; la combinación de las dos citoquinas induce una modulación funcional de la polarización Th2.
Materiales y Métodos
Sujetos y líneas celulares
PBMC se obtuvieron de dos pacientes de PC (pt#15 y#43 pt) y un donante sano (ND#11) de una cohorte de sujetos en los que previamente se detectó anti-CEA células CD4
+ T [3]. Los pacientes fueron extraídas antes de la cirugía y la estadificación de la enfermedad fue T3N1M0 en ambos casos. El Comité de Ética Institucional (Comitato Etico Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) aprobaron el protocolo de estudio y el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de sangre antes del muestreo. líneas celulares linfoblastoides transformadas con EBV (LCL) utilizados y su antígeno leucocitario humano (HLA) DR tipo fueron: SKP-LCL (β1 * 0405, * 1401; β3 * 02), establecido en nuestro laboratorio a partir de un donante sano; BM21 (β1 * 1101; β3 * 0202) y Pitout (β1 * 0701; β4 * 0101), proporcionado amablemente por K. Fleischhauer (Instituto Científico San Raffaele, Milán). LCL se cultivaron en RPMI 1640 (Bio Whittaker) que contiene 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina (BioWhittaker) y 10% de FCS (BioWhittaker).
Síntesis de péptidos de CEA
CEA
99 a 111, CEA
117-129, CEA
177-189 /355-367, CEA
425 a 437, CEA
568 a 582, y CEA
666-678 secuencias se sintetizaron por el método en fase sólida por etapas, como se describe anteriormente [13]; los péptidos se liofilizaron, se reconstituyeron en DMSO (Sigma-Aldrich) en 10 mg /ml y se diluyeron en RPMI 1640, según sea necesario.
in vitro
de propagación de CD4
+ clones de células T
policlonal CEA
177-189 /355-367 específica de CD4
+ células T de PT#15, obtenidos después de 13 días de cultivo a corto plazo con el péptido específico y autólogo de células CD4
+ -agotadas PBMC como células presentadoras de antígeno (APC), se clonaron por dilución limitante como se describe en [14]. Los clones se cultivaron en X-VIVO 15 (BioWhittaker) suplementado con 5% de suero inactivado por calor agrupado humano (BioWhittaker), penicilina (100 U /ml; BioWhittaker), estreptomicina (50 mg /ml; BioWhittaker), e IL-2 (250 UI /ml; Proleukine, Novartis). Los clones se volvieron a estimular cada 15-21 días con fitohemaglutinina (PHA) (0,5 mg /ml; Sigma-Aldrich) y se irradiaron alogénico PBMC
CD4
+ clones de células ensayo de estimulación T
CD4
+ células T (10
4 /pocillo) se cultivaron por triplicado en 96-u placas de fondo en presencia de irradiado LCL (5 × 10
4 /pocillo), o irradiado autólogo o HLA-DRβ3 * 02 coincide con PBMC (10
5 /pocillo) como APC pulsadas con el CEA
177-189 /355-367 péptido (10 mg /ml), o la proteína de CEA purificado (30 g /ml, BiosPacific), o normal IgG humano (30 g /ml, Venimmun N, Aventis Behring), como control negativo. En los experimentos de inhibición se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales (mAbs) (Beckton Dickinson): anti-HLA-DR (100 ng /ml), anti-HLA-DP (3 mg /ml) y anti-HLA-DQ (125 ng /ml). En experimentos de titulación de péptidos, se añadieron las siguientes concentraciones de péptido: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 y 0,005 g /ml. En los experimentos con citocinas inmunomoduladoras, IL-12 recombinante humana y /o IL-27; se añadieron a las siguientes concentraciones (R & amp; D Systems Inc.): IL-12, como agente único (5-20 ng /ml); IL-27, como agente único (0,01-1-10-100 ng /ml); combinado IL-12 y IL-27 de tratamiento (5 ng /ml + 100 ng /ml, respectivamente). Después de 48 h, el sobrenadante de cada pocillo se retiró y se agruparon para citoquinas 'de detección por ELISA, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes: GM-CSF (umbral de sensibilidad: 31,25 pg /ml) y factor de crecimiento transformante -β1 (TGF) ( umbral de sensibilidad: 62,5 pg /ml) (Biosource International Inc.); IFN-γ, IL-5 e IL-13 (umbral de sensibilidad: 15,6 pg /ml) (Mabtech) y IL-17 (eBioscience) (umbral de sensibilidad: 7,8 pg /ml). IFN-γ, el factor de necrosis tumoral (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 y la liberación de IL-2 se determinó también mediante el uso de la matriz de los granos citométricos (CBA) Human citoquinas Kit Th1-Th2 (umbral de sensibilidad :. 20 pg /ml), (Becton Dickinson), siguiendo las instrucciones del fabricante
A corto plazo la cultura y la liberación de citoquinas ensayo
purificada CD4
+ células T se estimularon una vez
in vitro
en presencia de los péptidos de CEA como se ha descrito anteriormente [3]. Brevemente, CD4
+ células T (3 × 10
4 /pocillo), purificados a partir de total de PBMC por perlas magnéticas (Miltenyi Biotec), se sembraron en placas de 96 pocillos en cinco repeticiones para cada condición y se cultivaron en X -VIVO 15 suplementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (50 mg /ml) y 3% de suero inactivado por calor agrupado humano (medio de cultivo tisular, TCM), en presencia de irradiado CD4
+ - agotado PBMC como APC, en una de CD4
+: ratio de APC de 01:03. Los estímulos fueron: PHA (10 mg /ml; Sigma-Aldrich), como control positivo; CD4
+ células T en la presencia de la APC solamente, como base de referencia (en blanco); y cada péptido solo (10 mg /ml). se añadieron IL-12 humana recombinante (5 ng /ml) e IL-27 (100 ng /ml) donde se indica. Al día 7, medio medio de cada pocillo se retiró y se repone con TCM fresco que contenía IL-2 (25 IU /ml), y la IL-12 y IL-27 donde se indica, sin ninguna estimulación más antígeno. Al día 14, se recogió el sobrenadante para IFN-γ, IL-5, IL-13 y la liberación de GM-CSF por ELISA, como se describe anteriormente.
Citometría de flujo
análisis citofluorimétrico se realizaron en un citómetro y se analizó usando el software FlowJo (Árbol Star, Inc.). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-CD3-APC, anti-CD4-PerCP, anti-CCR4-PE, anti-CCR5-FITC (Pharmingen) y anti-CRTH2-PE (Miltenyi Biotec). TCRVβ expresión se determinó con el kit de prueba IO Beta Marcos (Immunotech), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultados
Caracterización de CEA
177-189 /355-367 específicas citoquinas Th2 la producción de células CD4
+ clones de células T
ya se ha informado que los pacientes tienen un PC en el sesgado Th2 anti-CEA CD4 inmunidad
+ células T, mientras que el mantenimiento de un repertorio intacto de las células Th1 antivirales [3 ]. Para caracterizar mejor la función de esta respuesta anti-CEA hemos clonado por dilución limitante CEA
177-189 /355-367 específico policlonal CD4
+ T células de PT#15, obtenido después de un
in vitro
corto plazo re-estimulación de las células CD4
+ células T con APC autólogas pulsadas con el péptido relevante; un ensayo que anteriormente mostró no favorecer
in vitro
cebado [15]. células policlonales producen altos niveles de IL-5 y muy poco de GM-CSF, pero no IFN-γ [3], lo que sugiere la presencia de
in vivo
cebado CD4
+ células T con características Th2. Se obtuvieron dos clones, que expresa el mismo receptor de la célula T de la cadena (TCR) Vβ,
es decir
la V? 17+ (Fig. 1E), y por lo tanto ellos utilizan indistintamente en ser los siguientes experimentos
bona fide
mismo clon.
Perfil de citocina secretada (A)
. CD4
+ T células fueron cultivadas con irradiado APC en presencia o ausencia del péptido relevante en un ensayo de estimulación de 2 días y la concentración de las citocinas indicadas en los sobrenadantes se determinó ya sea por CBA (panel superior) o ELISA (panel inferior). Los datos son representativos de al menos seis experimentos; para los ensayos de ELISA, los datos son medios de determinación duplicada ± SD.
restricción HLA (B)
. CD4
+ células T se cultivaron con PBMC autólogas irradiadas o HLA-DR emparejado LCL, como se indica, en presencia o ausencia del péptido relevante (10 g /ml) y en ausencia o en la presencia de anti-HLA DR, anti-HLA-DP y anti HLA-DQ-mAbs: después de 2 días fue probado IL-5. Panel superior:% de inhibición se calculó basándose en la secreción de IL-5 por CD4
+ células T en la presencia del péptido relevante (2 ng /ml más de 0 ng /ml de nivel de fondo). Los datos son representativos de dos (panel superior) y cuatro (panel inferior) y los experimentos son medios de determinación duplicada ± SD. Las respuestas significativamente más altas que las piezas en bruto (
es decir
, los niveles basales de la secreción de citocinas de CD4
+ T células en presencia de LCL solamente) se indican como: ***, p & lt; 0,001 (determinado por no apareado, la prueba t de Student de una cola).
Las curvas de dosis-respuesta (C)
. células CD4
+ T se cultivaron con dosis tituladas del péptido relevante en la presencia de APC irradiado en un ensayo de estimulación de 2 días y se ensayaron para IL-5 y la liberación de IL-13. Los datos son la media de determinación duplicada ± SD.
El reconocimiento de la proteína nativa (D)
. CD4
+ T células fueron cultivadas en la presencia de irradiado PBMC, como APC, pulsadas ya sea con el péptido relevante (10 g /ml) como control positivo, o la proteína de CEA purificado (30 g /ml) o IgG humano ( 30 g /ml) como control negativo en un ensayo de estimulación de 2 días y la prueba de liberación de IL-13. Los datos son la media de determinación duplicada ± SD. Las respuestas significativamente más altas que las piezas en bruto (
es decir
, los niveles basales de la secreción de citoquinas a partir de células CD4
+ T en presencia de PBMC solamente.) Se indican como: **, 0,001 & lt; p & lt; 0,05; ***, P & lt; 0,001 (determinado por desapareado, la prueba t de Student de una cola).
expresión TCRVβ (E)
. La prueba se realizó con el kit de prueba IO Beta Marco. Cuadrantes se fijaron basándose en la tinción de control de isotipo.
La expresión superficial de Th2 (CRTH2 y CCR4) y Th1 (CCR5) marcadores (F)
. histogramas rellenos representan controles de isotipo; histogramas abiertos muestras teñidas con los marcadores indicados.
La caracterización de la CEA
177-189 /355-367 específica de CD4
+ clones T se representa en la figura 1. CD4
+ clones de células T producidas principalmente IL-5, IL-13 y GM-CSF, mientras que lanzaron baja cantidad de IL-4 e IFN-γ y no IL-2, TNF-α, TGF-β1, IL-10 o IL-17 (Fig. 1A). Aunque las células producen poca cantidad de IL-4, este patrón de secreción de citoquinas es coherente con una polarización Th2.
Para identificar el elemento de restricción primero a prueba el reconocimiento por CD4
+ células T de péptido cargado autólogo APC en ausencia o en presencia de anti-HLA-DR, anti-HLA-DP y anti-HLA-DQ mAbs. Como se muestra en la Fig. 1B (panel superior), la adición del mAb anti-DR inhibida (65,5%) IL-5 Producción por CD4
+ células T, lo que demuestra que una molécula de HLA-DR presenta el péptido. Para identificar el alelo de la presentación de HLA-DR, las células se estimularon con el péptido relevante en presencia de LCL que expresan diferentes combinaciones de los HLA-DRβ1, alelos ß3 y ß4 expresadas por el paciente (que se indica en la Fig. 1B) y se ensayaron para la liberación de IL-5. Como se muestra en la Fig. + células T 1B (panel inferior), CD4
reconocieron el péptido en asociación con el HLA-DRβ3 * 02, que es el alelo compartido entre el paciente y los dos que presenta LCL (BM21 y SKP).
también se realizó la curva de titulación del péptido en el que se expusieron las células CD4
+ T al aumentar la concentración del péptido relevante (Fig. 1C). Los experimentos indicaron la expresión por el clon de un TCR afinidad muy baja.
Hemos demostrado previamente que la secuencia repetida CEA en las posiciones 177-189 y 355-367 contiene un
in vitro
epítopo procesado de forma natural presentado en asociación con varios alelos HLA-DR [16]. Para confirmar estos datos, los clones de células CD4
+ T se estimularon con la proteína de CEA o normal de IgG humana, como control negativo, y se ensayaron para la liberación de IL-13. Como se muestra en la Fig. 1D, CD4
+ células T producen específicamente IL-13 en presencia del péptido y, más importante, en la presencia de la CEA, pero no de la proteína de control (
es decir
, IgG humana), lo que demuestra que a pesar de CEA
177-189 /355-367 específica de CD4
+ clones de células T TCR llevan una baja afinidad que reconocen el epítopo nativo.
Finalmente, para verificar si el perfil de citocinas Th2 correlacionada con los marcadores fenotípicos de las células Th1 y Th2, los clones se ensayaron para la expresión de CCR5, que se expresa preferentemente por las células Th1 [17] y de CRTH2 y CCR4, cuya expresión caracteriza Th2 células [17], [18]. Como era de esperar a partir del perfil de citoquinas, las células CD4
+ T expresan en su superficie tanto CRTH2 y CCR4 mientras que la expresión CCR5 estaba ausente (Fig. 1F).
Combined IL-27 y IL-12 inhibe la secreción de tratamiento de citocinas Th2 y estimula la producción de IFN-γ por células
CEA específicos CD4 + T
a continuación se probó la posibilidad de modular la polarización de la CEA
177-189 Th2 /355-367-específica las células de las citoquinas inmunomoduladoras IL-27 e IL-12.
Para este objetivo se evaluó por primera vez el efecto de aumentar las concentraciones de IL-27 o IL-12, como agentes únicos, sobre la producción de CD4
+ células T de citocinas Th1 y Th2 en presencia del péptido relevante. La adición de IL-27 se redujo en una dosis dependiente de la forma de IL-5 e IL-13, mientras que no se observó efecto de la IL-4 e IFN-γ (Fig. 2A). La adición de IL-12 alcanzó su efecto de meseta ya a la dosis de 5 ng /ml (Fig 2B.): IL-5 la producción disminuyó también en presencia de IL-12, mientras que, en diferencia con IL-27, el efecto sobre IL-13 era marginal como en IL-4. Es importante destacar que, y a diferencia con IL-27, IFN-γ producción fue fuertemente aumentó (Fig. 2B). Estos datos demuestran que ambas citocinas afectan a la función efectora de la CEA-específico CD4
clones de células T + pero ni IL-27 ni IL-12, como agentes únicos, fueron óptimas en la modulación de su polarización Th.
(a).
+ T fueron cultivadas con el péptido relevante y se irradiaron LCL como APC en presencia de concentraciones crecientes de IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml); después de 2 días la liberación de citoquinas se evaluó por CBA (IL-5 IL-4 e IFN-γ) o ELISA (IL-13). Los datos para la IL-13 son medios de determinación por duplicado ± SD.
(B)
. CD4
+ T células se cultivaron y probado, como se describe anteriormente, en presencia de concentraciones crecientes de IL-12 (0-5-20 ng /ml). El nivel basal de secreción de citoquinas CD4
+ células T en presencia de LCL solamente se restó de los valores de muestra y se comprendido entre 0 y 0,018 ng /ml. Los datos son representativos de al menos tres experimentos.
En segundo lugar, se evaluó el efecto del tratamiento combinado de las dos citoquinas (Fig. 3). Cuando se utiliza a 5 ng /ml, IL-12, como agente único, inducida por la inhibición de 61% de IL-5 y no tuvo efecto sobre la IL-13 y GM-CSF, mientras que la producción de IFN-γ tenía un aumento de casi 10 veces . IL-27 tratamiento por sí solo en la concentración más alta mostró 78%, 30% y% de inhibición de IL-5, IL-13 y GM-CSF, respectivamente 53; mientras que sólo el aumento de 1,4 veces en la producción de IFN-γ. Cuando se utiliza en combinación con los mejores concentraciones, se observó un efecto sinérgico en la inhibición de la IL-5 (91%) y IL-13 (48%), mientras que, como se espera de los resultados de los agentes individuales, la secreción de GM-CSF no fue inhibida más y la producción de IFN-γ no se incrementó aún más.
CD4
+ células T se cultivaron con el péptido relevante en ausencia (basal) o en presencia de IL-12 (5 ng /ml), como agente único; o IL-27 (100 ng /ml), como agente único; o combinado IL-12 e IL-27 en un ensayo de estimulación de 2 días y después se prueba para la liberación de citoquinas por CBA (IL-5 e IFN-γ) o ELISA (IL-13 y GM-CSF). Los datos para IL-13 y GM-CSF son medios de determinación duplicada ± SD. El nivel basal de secreción de citoquinas CD4
+ células T en presencia de LCL solamente se restó de los valores de muestra y se comprendido entre 0 y 0,006 ng /ml. Los datos son representativos de cinco experimentos.
La modulación de polarización Th2 por la IL-12 e IL-27 dura después de la eliminación citoquinas
Para verificar si la modulación de polarización Th2 obtiene por la el tratamiento combinado con IL-12 e IL-27 era estable, se diseñó un experimento en el que CEA-específico CD4
+ células T se estimularon primero con el péptido relevante en ausencia o en presencia de IL-12 e IL- 27 (5 y 100 ng /ml, respectivamente). En segundo lugar, las células estimuladas en ausencia de las citoquinas se mantuvieron en cultivo durante 14 días en TCM más IL-2 y se utilizaron como controles. Las células tratadas con las citoquinas se dividieron en dos alícuotas y se cultivan bajo condiciones diferentes para los siguientes 14 días: en una condición de las citoquinas se retiraron después de 2 días y las células cultivadas como los controles en TCM más IL-2, en la otra condición citoquinas se mantuvieron en cultivo todo el tiempo y se sustituye cada dos o tres días. Al día 14, las células de cada una de las tres condiciones se ensayaron en un ensayo de estimulación de 2 días con el péptido relevante y la liberación de citoquinas probado. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4. Las células de control confirmados producción de IL-5, IL-13 y no IFN-γ, mientras que las células mantuvieron en cultivo continuo con las citoquinas confirmados 98% y 74% de inhibición de IL-5 e IL- 13 de producción, respectivamente, y un aumento de 11 veces para IFN-γ. Es importante destacar que, células en las que se eliminaron las citoquinas después de 2 días de cultivo todavía mostraron 70% y la inhibición del 47% en IL-5 e IL-13 de producción, respectivamente, y un aumento de 5 veces en la liberación de IFN-γ.
(A)
. CD4
+ células T se cultivaron con el péptido relevante y dejaron sin tratar (péptido) o tratadas durante 2 días con combinados IL-12 (5 ng /ml) e IL-27 (100 ng /ml) y después se lavaron y se deja sin tratar (IL-12 + IL-27 (2-día)) o tratados continuamente con IL-12 e IL-27 en las mismas dosis durante 2 semanas (IL-12 + IL-27 (14 días)). Al día 14, se ensayaron las células en presencia o ausencia del péptido relevante y la IL-5 específica, IL-13 e IFN-γ liberación en el sobrenadante probados por ELISA. Los datos son la media de determinación duplicada ± SD. El nivel basal de citocinas secreción de células CD4
+ T en presencia de LCL solamente se restó de los valores de las muestras y fue el siguiente: IL-5 (0,093 ± 0,006 ng /ml), IL-13 (0,468 ± 0,028 ng /ml) y IFN-γ (0 ng /ml). Los datos son representativos de cuatro experimentos. (
B Opiniones). La expresión superficial de CRTH2, CCR4 CCR5 por CD4 + células T
después del tratamiento con combinación de IL-12 + IL-27. El análisis se realizó en las células tratadas durante 2 días y luego se deja sin tratar durante una semana más. histogramas rellenos representan controles de isotipo; histogramas abiertos muestras teñidas con los marcadores indicados.
Para comprobar si el tratamiento combinado también influyó en el fenotipo de la superficie Th2, CD4
+ células T, que había sido re-estimulados en presencia de la citoquinas por 2 días y después se cultivaron durante otros siete días en la ausencia de las citoquinas, se ensayaron para la expresión de CRTH2, CCR4 y CCR5. Como se muestra en la Figura 4B, las células, mientras que el mantenimiento de CRTH2 y CCR4 como en ausencia de tratamiento (Fig. 1F), adquirido de la expresión de CCR5.
En conjunto, estos resultados muestran que la modulación de Th2 polarización de CEA CD4
+ clones específicos de células T obtenidos con el tratamiento combinado es duradero, aunque con eficiencia reducida, incluso después de la eliminación citoquinas y se asocia con características funcionales y fenotípicas de Th0 o ambas células Th1 y Th2.
IL-12 e IL-27 aumenta combinación Th1 y Th2 modula la polarización espontánea de anti-CEA CD4
+ respuestas de células T
Para comprobar el efecto del tratamiento con IL-12 e IL-27 combinado de la polarización de
células CEA-específicos CD4 + T en un entorno más fisiológico y en el nivel policlonal, CD4
+ T células del paciente (PT#43) y donante normal (ND#11) fueron probados en un máximo de 14 días
vitro
ensayo de re-estimulación en el reconocimiento de los péptidos relevantes en la ausencia o en la presencia de las dos citoquinas inmunomoduladoras (Figura 5). Como se informó anteriormente en [3], en ausencia de la citoquinas inmunomoduladoras CD4
+ T células de PT#43 producido IL-5 en presencia de CEA
425 a 437; IL-13 en presencia de CEA
568-582; GM-CSF en presencia de CEA
568-582 e IFN-γ en presencia de CEA
568 a 582 y, aunque a un nivel mucho más bajo pero significativo, de la CEA
177-189 /355 -367 (panel de la Fig. 5,
izquierda
s, barras grises
). La combinación de IL-12 y IL-27 casi abolió IL-5 (inhibición 99%) y 13-IL (inhibición 76%), mientras inducida
de novo
IFN-γ secreción en presencia de CEA
425-437, mejorado (aumento de 9 veces) la producción de IFN-γ en presencia de CEA
177-189 /355-367 y confirmado IFN-γ, mientras que reduce fuertemente la IL-13 (inhibición 98%) y GM- LCR (80% de inhibición) de producción en presencia de CEA
568-582 (panel de la Fig. 5,
izquierda
s, barras negras
). Como se informó anteriormente [3], en ausencia de las citoquinas inmunomoduladoras CD4
+ T células de ND#11 mostraron una proliferación significativa [3] y muy poca cantidad de secreción de IFN-γ en presencia de CEA
99- 111, mientras que no se observó una importante producción de IL-5 y GM-CSF en presencia de cualquier péptido (Fig. 5,
panel de la derecha
s, barras grises
). la liberación de IL-13 no se probó. tratamiento de citoquinas aumentado fuertemente (aumento 23 veces) la liberación de IFN-γ contra CEA
99 a 111, mientras que, como se esperaba, no se observó efecto sobre la IL-5 y GM-CSF de producción (Fig. 5,
derecha Panel
s, barras negras
). En ambos casos, las dos citoquinas inducen la modulación de Th2 o la amplificación de las respuestas Th1 que ya estaban presentes, aunque a un nivel muy bajo, en ausencia de la combinación de citoquinas, mientras que no hubo evidencia de
-de novo
el reconocimiento específico de péptidos de CEA.
CD4
+ T células de PT#43 y#11 ND se cultivaron en cinco repeticiones, como se describe en Materiales y Métodos, con los péptidos de CEA que responden, en ausencia ( barras grises) o en presencia (barras negras) del tratamiento combinado con IL-12 (5 ng /ml) más IL-27 (100 ng /ml). Después de 14 días, IL-5, IL-13, GM-CSF y la liberación de IFN-γ se ensayó por ELISA. Los datos reportados son medios de determinación por duplicado ± SD. Las líneas de trazos identifican el nivel basal de la secreción de citoquinas en presencia de sólo el APC. Dakota del Norte. = No determinado.
En conjunto, estos resultados sugieren que la IL-12 e IL-27 promueven la modulación funcional de tipo Th2 y la amplificación de las respuestas de tipo Th1 pre-existentes anti-CEA.
Discusión
En el presente estudio, informamos que la asociación de las citoquinas inmunomoduladoras IL-12 e IL-27 es capaz de modular la polarización funcional de anti-CEA Th2 CD4 + células T
de los pacientes con CP y para mejorar las células preexistentes tipo Th1 anti-CEA CD4
+ T.
Nos muestran que el tratamiento con IL-27 como agente único inhibe tanto la IL-5 e IL-13 de liberación por las células Th2-CEA específico. Esto confirma en el sistema humano un informe anterior que describe la IL-27 como capaces de suprimir la producción de citocinas Th2 de
in vitro
células Th2 polarizado de ratón [12]; pero, a diferencia con este informe, en nuestro sistema en el que nos ocupamos de
de buena fe in vivo
polarizado CD4
+ células T IL-27 no tuvo ningún efecto sobre la secreción de IFN-γ. Es importante destacar que también reveló una nueva función para la IL-27, que es la inhibición de la producción de GM-CSF. Cuando se utilizó IL-12 como agente único, que mejora fuertemente la producción de IFN-γ, mientras que sólo tenía un efecto marginal en la supresión de la liberación de citocinas Th2, y de la IL-13, en particular, y ningún efecto sobre el GM-CSF. Esto es también en diferencia con los informes anteriores [7], [8], en el que se muestra IL-12 para revertir la polarización de las células Th2 específicas de alérgenos humano mediante la inducción de IFN-γ y la inhibición de la producción de IL-4. De hecho, en el caso de nuestros clones IL-4, que sin embargo no se produce en grandes cantidades, no fue inhibida ni por IL-27 ni IL-12. La única citocina Th2 afectados por la IL-12 era IL-5; Esta función también se informó anteriormente para clones de células T obtenidas de la lavado broncoalveolar de pacientes asmáticos [19].
En conjunto, se muestra que en nuestro sistema de IL-12 y IL-27 tienen papeles no redundantes en la modulación de la se obtuvo polarización de establecido CEA-específica Th2 CD4
+ células T y que la modulación de la polarización funcional y fenotípica Th2 de anti-tumorales CD4
+ efectores en un tipo Th0 sólo en la presencia de el tratamiento sinérgico en combinación con las dos citoquinas. Modulación de la producción de las citoquinas 'era, al menos en el caso de los clones, la mayoría funcional con la inducción de un fenotipo más bien peculiar donde CCR4, CCR5 CRTH2 y expresión coexistieron (
es decir
, no es típico de ya sea Th1 o células Th0). Los experimentos preliminares (datos no mostrados), en la que evaluó la producción de citoquinas 'a nivel de células individuales mediante tinción intracelular, indicaron que:
i
) IL-27 solo no afectó el porcentaje de IL-5 e IL-