Extracto
factor de crecimiento transformante (TGF) -β señalización /Smad juega un papel importante en el desarrollo del cáncer de colon, la progresión y la metástasis. En este estudio hemos demostrado que la familia microARN-130/301/454 es hasta reguladas en tejidos de cáncer de colon en comparación con la mucosa normal adyacente emparejado, que comparten la misma región 3'-untranslational (3'-UTR) secuencia de semillas son vinculantes y predicada para apuntar Smad4. En las células colorrectales HCT116 y SW480 del cáncer, la sobreexpresión de los genes miARN-130a /301a /454 imita aumenta la proliferación celular y la migración, mientras que los inhibidores de estos miRNAs afectan a la supervivencia celular. La función biológica de los genes miARN-130a /301a /454 sobre las células de cáncer de colon es probable mediada por la supresión de Smad4, y la sobre regulación de la miRNAs se correlaciona con Smad4 regulación a la baja en los cánceres de colon humano. En conjunto, estos resultados sugieren que los genes miARN-130a /301a /454 son nuevos miRNAs oncogénicos que contribuyen a la tumorigénesis de colon mediante la regulación de TGF-β /Smad de señalización, que pueden tener una aplicación potencial en la terapia del cáncer
Visto:. Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Wu X, et al. (2013) El papel oncogénico de microARN-130/301/454 en el cáncer colorrectal humano a través de la expresión de segmentación Smad4. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10.1371 /journal.pone.0055532
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2012; Aceptado 27 de diciembre de 2012; Publicado: 5 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto está apoyado por becas de los Programas nacionales de Investigación básica (2012CB518103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31100554, 31270820, 81230061, 81121004 y), Fundación del cuarto de niños del hospital general de PLA (12KMM48), y el Programa Nova Pekín (Z12111000250000). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es uno de los cánceres más frecuentes y una causa común de muerte por cáncer [1]. Debido al mal pronóstico y la invasión distante y la migración, la incidencia global de cáncer de colon es de aproximadamente 5% y la tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer de colon es muy baja [2]. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas para el desarrollo de tratamientos no convencionales es urgente y se aprovechen los avances en el conocimiento amplio y profundo de la patogénesis molecular del cáncer de colon.
Los microARN (miRNA) son una extensa clase de pequeños ARN no codificantes (18-25 nt), con un impacto significativo en un número de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, el crecimiento, el metabolismo, y la tumorigénesis, a través de la unión directa a la región untranslational la 3 '(3'-UTR) de objetivo mRNAs [3] - [5]. MicroARNs pueden regular la expresión génica mediante dos modos, dependiendo del grado de complementariedad con los objetivos de mRNA, para suprimir la traducción o inducir la degradación de ARNm [6], [7]. Los microARN pueden funcionar como supresores de tumores u oncogenes en función de si o no los miRNAs se dirigen específicamente a los oncogenes o genes supresores de tumores [8]. Tanto oncogénico miRNAs y miRNAs supresores de tumores se ha demostrado y descrito en la carcinogénesis de colon y la progresión, como upregulated miR-135, miR-21, miR-17-92, y miR-196a, y regulado por disminución de miR-34, miR-195, y miR-365 [9] - [13]. El perfil de expresión de miRNAs es altamente tejido y tipo celular específico, lo que demuestra la importancia funcional biológica de un miARN expresado [14]. Sin embargo, la aclaración de las características de expresión y las funciones de miRNAs en la biología del cáncer, especialmente el cáncer de colon, sigue siendo un proceso continuo.
El microARN-130ac /301ab /454/721 familia tiene la misma semilla de unión 3'-UTR secuencia. Recientemente, se ha informado de miR-130a /301ab ser aumentada en varios tipos de cáncer, como el carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón de células no pequeñas, leucemia mieloide crónica, cáncer de páncreas y cáncer de mama [15] - [21]; Sin embargo, el miR-130a /301a es el regulado en la leucemia linfocítica crónica y la anemia de células falciformes [22], [23], lo que indica la complejidad y diversidad de las funciones de miR-130a /301a en la tumorigénesis. Sin embargo, aún se desconoce el patrón de expresión y el papel de miR-130a /301a /454 en la carcinogénesis de colon.
En este estudio se investigó la expresión y papeles de miR-130a /301a /454, en el desarrollo del cáncer de colon. Hemos demostrado que el miR-130a /301a /454 está regulado en los tejidos humanos de cáncer de colon resecado clínicamente y líneas celulares de cáncer de colon, y estos miRNAs muestran propiedades oncogénicas en células de cáncer de colon
in vitro
y
in vivo. También se investigaron los mecanismos que subyacen a las funciones de miR-130a /301a /454, en el desarrollo del cáncer de colon. Por lo tanto, nuestros datos ponen de relieve la importancia de la miR-130a /301a /454 /familia en la patogénesis del cáncer y sugieren un potencial aplicación en la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos
quirúrgicamente la extracción de tejidos de cáncer de colon y los tejidos normales adyacentes mucosa emparejados se obtuvieron de 35 pacientes con cáncer de colon en el hospital general de PLA (Pekín, china), y se utilizaron para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT PCR) y análisis de inmunotransferencia. Los tejidos resecados quirúrgicamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta el análisis. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de los pacientes y los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital General de PLA. Todos los participantes por escrito el consentimiento para participar en este estudio informados.
extracción de RNA y QRT-PCR
El ARN total, incluyendo miARN, fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante . Para el análisis de los genes miARN, se utilizó poli-A en tiempo real QRT-PCR. El ARN aislado se poliadenilado utilizando poli-A de la polimerasa (New England Biolabs) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, el poli-A ARN de cola se sometió a transcripción inversa utilizando ImProm transcriptasa inversa (Promega), siguiendo el protocolo del fabricante, y el cebador miR-RT (Invitrogen). El cebador de miR-RT fue: 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T) 18VN-3 '. PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit SYBR Green PCR Mix (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante [12], con los siguientes cebadores: miR-130a, 5'-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 '; miR-301a, 5'-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 '; miR-454, 5'-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 '; cebador universal, 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 '; U6-F, 5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ', U6-R, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'. El nivel relativo de expresión de miR-130a /301a /454 se normalizó con el control interno (U6), utilizando el 2
-ΔΔCt método de ciclo umbral.
Cultivo de células y transfección
el colon humano líneas celulares de cáncer HCT116, HCT15, HT29, LoVo y SW480 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), y se mantuvo en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina y estreptomicina, en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C. Los miméticos de miRNAs y los inhibidores de miARN fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, China). transfecciones miRNAs se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Análisis de la viabilidad celular
El
in vitro
la viabilidad celular de las células HCT116 o SW480 se evaluó utilizando el Kit de Recuento celular -8 (CCK-8, Dojindo, Japón) método. En pocas palabras, medio gastado se sustituyó por medio fresco que contiene 10 l de reactivo en el CCK8 períodos de tiempo indicados después de la transfección. Las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 1 h, y el número de células viables se evaluó por medición de la absorbancia a 450 nm.
La migración de células de ensayo
transfectantes HCT116 se mueren de inanición de suero durante 12 h en medio RPMI-1640 que contienen 0,1% de FBS. células privadas de suero se trataron con tripsina y se resuspendieron en medio RPMI-1640 que contiene 0,1% de FBS, a continuación, 1 × 10
se añadieron 5 células a la cámara superior (8 micras de tamaño de poro; Corning) de 24 pocillos en medio libre de suero (500 l). Después de incubación durante 24 horas a 37 ° C en 5% de CO
2, las células migradas en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con solución de tinción violeta 0,1% durante 30 min, y se contaron usando un microscopio invertido.
ensayo de tumorigenicidad en ratones desnudos
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud de Guía para el Cuidado y uso de animales de laboratorio, con la aprobación de la Junta de Investigación Científica del hospital general de PLA. El ensayo de tumorigenicidad se realizó como se informó anteriormente [12]. Control negativo o /301a /454 células HCT116 o SW480 130a miR-imitan-transfectadas (1 × 10
7) se suspendieron en 0,1 ml de PBS, luego se inyecta por vía subcutánea en cada lado del flanco posterior de la misma 4-de semana edad ratones BALB /c atímicos ratones desnudos. Ocho ratones desnudos fueron incluidos en cada grupo y el crecimiento del tumor se midió diariamente usando calibres. El volumen del tumor se calculó según la siguiente fórmula: volumen = longitud x anchura
2 × 0,5. La expresión de miR-130a /301a /454 en muestras de tumores en los tiempos indicados se detectaron utilizando un ensayo de QRT-PCR.
indicador de luciferasa 3'UTR ensayo
El Smad4 humano 3'UTR plásmido informador de la luciferasa y el plásmido que contiene el sitio diana miR-130a /301a /454 eliminado o mutado Smad4 3'UTR se construyeron como se describe anteriormente [13]. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación de ADN. Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa, como se informó anteriormente [13]. Brevemente, se midieron las actividades de luciferasa a las 48 h post-transfección usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Reporter (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos se normalizaron dividiendo
actividad de la luciferasa de luciérnaga fotos: por
Renilla
actividad luciferasa.
inmunotransferencia
Los extractos de proteína de lisados fueron sometidos a dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, a continuación, se transfirió, como se informó anteriormente [24]. anticuerpo anti-Smad4 fue adquirido de Señalización Celular Tecnología. anticuerpos GAPDH y los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology.
El análisis estadístico
Los datos se muestran como la media ± S. D. Las comparaciones estadísticas entre los grupos experimentales fueron analizados por Estudiante
t
-pruebas, y un valor de p de dos colas & lt; 0,05 se consideraron significativos. La correlación entre el miR-130a /301a /454 expresión y el nivel de proteína Smad4 se analizaron mediante análisis de correlación de Pearson con valores de r y p, tal como se indica.
Resultados
miR-130a /301a /454 es hasta reguladas en los tejidos de cáncer de colon y líneas celulares
Para explorar las funciones de miR-130a /301a /454, en el desarrollo del cáncer de colon humano, se han detectado los niveles de expresión en 35 pares de cáncer de colon humano y tejidos de la mucosa normal adyacente. Según el análisis de QRT-PCR, los niveles de miR-130a /301a /454 expresión se incrementaron significativamente en los tejidos tumorales en comparación con tejidos adyacentes normales de la mucosa (Fig. 1A-C). Además, miR-130a /301a /454 se incrementó en líneas celulares de cáncer de colon (HCT116, HCT15, HT29, SW480, y LoVo; Fig. 1D-F). Además, no había una correlación positiva entre cada dos miRNAs entre miR-130a /301a /454 (Fig. 1G-I), que muestra un perfil de expresión común en esta familia miARN en el cáncer de colon. Estos resultados sugieren que el miR-130a /301a /454 es hasta reguladas en las células del cáncer de colon, que pueden ser relevantes para el desarrollo del cáncer de colon humano.
La expresión de miR-130a /301a /454 fue examinado por QRT -PCR en 35 emparejado cáncer de colon humano y los tejidos normales adyacentes de la mucosa (a, B, C) y, en líneas celulares de cáncer de colon como se indica (D, e, F). La expresión de miR-130a /301a /454 se normalizó a U6 en cada muestra. Los datos se muestran por separado en muestras humanas (A, B, C), o como la media ± S. D. (N = 3) en las líneas celulares (D, E, F). **,
p & lt; 0,01
. (G, H, I) Análisis estadístico de la correlación entre cada dos miRNAs entre miR-130a /301a /454 se ha realizado mediante el análisis de correlación de Pearson.
r
y
valores de p
se muestran como se indica.
miR-130a /301a /454 mejora la viabilidad celular y la migración en líneas celulares de cáncer de colon
la alta expresión de miR-130a /301a /454 en los tejidos de cáncer de colon y líneas celulares nos llevó a investigar la función biológica de estos miRNAs en el cáncer de colon. El ensayo CCK8 mostró que la restauración de miR-130a /301a /454 mejora de forma significativa la proliferación de células HCT116 de cáncer de colon o SW480 (Fig. 2A y B), mientras que la sobreexpresión de cualquiera de inhibidor de células contra reducida miR-130a /301a /454 viabilidad tanto en las células de cáncer de colon (Fig. 2C y D) Estos tres miRNAs exhibió efectos estimulantes del crecimiento similares en los cánceres de colon, y no hay regulaciones mutuas entre el miR-130a /301a /454 se observó (Fig. 2E y F). Por otra parte, miR-130a /301a /454 promueve la migración celular en las células HCT116, tal como se analizó por el ensayo de migración de células Transwell (Fig. 2G, panel izquierdo). Por el contrario, desmontables de miR-130a /301a /454 motilidad celular suprimida en las células de cáncer de colon (Fig. 2G, panel derecho). Estas observaciones sugieren que miR-130a /301a /454 promueve el crecimiento de células de cáncer de colon y la migración, actuando así como miRNAs oncogénica en cáncer de colon
.
células (A, B) HCT116 de cáncer de colon SW480 y se transfectaron con ARN de control o el miR-130a /301a /454 mímica como se indica. La viabilidad celular se detectó en la indicada puntos de tiempo después de la transfección utilizando ensayos CCK8. *,
p Hotel & lt; 0,05. (C, D) El inhibidor de miR-130a /301a /454 se transfectó en las células HCT116 y SW480, y se detectó la viabilidad celular en los puntos de tiempo indicados usando ensayos CCK8. *,
p Hotel & lt; 0,05. (E, F) Los niveles de expresión de cada dos miRNAs entre miR-130a /301a /454 fueron detectados por ensayos de QRT-PCR cuando el imitador o un inhibidor de la otra miARN se transfectadas en células HCT116. (G) HCT116 células fueron transfectadas con ARN de control, miR-130a /301a /454 mímica, o un inhibidor de miR-130a /301a /454. El número de células migradas se calculó y se muestra. Los datos se muestran como la media ± s.d. (N = 3) de un experimento representativo. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. *,
p
. & Lt; 0,05
miR-130a /301a /454 promueve tumorigenecity
in vivo
Además, confirmó que el tumor -Promover efectos de miR-130a /301a /454
in vivo
. ARN control negativo, miR-130a /301a /454 imitador o un inhibidor de transfectadas las células del cáncer de colon, se inyectaron en ratones desnudos ocho, como se ha descrito. Como se muestra en la Fig. 3, el miR-130a células HCT116 y SW480 /301a /454 transfectadas con la formación de tumores tenían rápido en comparación con los transfectantes de control negativo, mientras que desmontables de miR-130a /301a /454 causó la formación de tumores retardada (Fig. 3A-F). Los niveles de miR-130a /301a /454 expresión fueron validados mediante ensayos de QRT-PCR de las muestras tumorales en los tiempos indicados (Fig. 3G y H). Estos resultados indican que miR-130a /301a /454 mejorado significativamente la tumorigenicidad de células de cáncer de colon en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo.
Efecto de miR-130a /301a /454 sobre la tumorigenicidad en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo. ARN de control, 130a miR-/301/454 130 A miR-/301a /454 células HCT116 de cáncer de colon imitan o inhibidor transfectadas (A, B, C A) y células SW480 (D, E, F) se inyectaron por vía subcutánea en cada lado de el flanco posterior de los mismos ratones desnudos, respectivamente (n = 8 por grupo). La curva de crecimiento del tumor se visualiza como se indica. *,
p Hotel & lt; 0,05. (G, H) Los tejidos tumorales se obtuvieron de dos ratones en cada grupo a los tiempos indicados, y los niveles de expresión de miR-130a /301a /454 fueron examinados por ensayos de QRT-PCR.
miR-130a /301a /454 directamente reprime la expresión de Smad4
sobre la base de los genes miARN objetivo de predicción (http://www.targetscan.org), más de un centenar de genes son los genes diana putativos para miR-130a /301a /454. A medida que estos miRNAs son capaces de mejorar la tumorigenecity de células de cáncer de colon
in vitro
y
in vivo
, el objetivo de genes regulados por miR-130a /301a /454 puede funcionar como un supresor de tumores. Entre los genes diana putativos, Smad4, un importante supresor de tumores implicados en la señalización de TGF-β /BMP, se demostró que contenía un putativo de miR-130a /301a /454 sitio diana conservada en base a la predicción TargetScan (Fig. 4A). Para determinar si es o no Smad4 está dirigido directamente por el miR-130a /301a /454 expresión, se construyeron plásmidos informadores de luciferasa que contenían Smad4 3'-UTR o que llevan supresión /mutación del miR-130a /301a /454 putativo sitio de destino. Por co-transfección con miR-130a /301a /454 mímica, que mostraron que la actividad luciferasa de tipo silvestre reportero Smad4-3'UTR fue suprimida, mientras que el sitio de destino eliminado o mutado reportero no pueden ser objetivo de miR-130 A /301a /454 co-transfección (Fig. 4B). De nota, el análisis de inmunotransferencia mostró que miR-130a /301a /454 reduce notablemente el nivel de expresión de la proteína endógena de Smad4 en comparación con el ARN control negativo en las células HCT116 y SW480 (Fig. 4C). Smad4 actúa como un transductor central de factor de crecimiento transformante (TGF) -β proteína morfogenética ósea y (BMP) de señalización, porque R-Smad forma un complejo heteromérico con Smad4 y se transloca en el núcleo para regular la transcripción de genes. Por lo tanto, hemos tratado de identificar si estos miRNAs influyen TGF y BMP actividades de señalización. inhibidor de miR-130a /301a /454 fue introducido en las células HCT116 transfectadas con el TGF-β reportero CAGA12-lux o el reportero BMP BRE-lux. Como se muestra en la Fig. 4D, miR-130a /301a /454 inhibidor marcadamente mejorada respuestas TGF y BMP cuando la forma constitutivamente activa de TGF-β /BMP-receptor I (TβRI-ca /BMPRI-ca) fue co-expresado, acompañado de Smad4 regulación , lo que sugiere que el miR-130a /301a /454 puede suprimir el TGF-β señalización /BMP mediante la inhibición de la expresión de Smad4
.
(a) Smad4 humano podría ser una diana molecular de miR-130a /301a /454. Se muestran los alineamientos de secuencias de miR-130a /301a /454 y sus sitios de destino en 3'UTR de Smad4, descargado de TargetScan (http://www.targetscan.org). (B) las células HCT116 se co-transfectaron con Smad4 humano 3'UTR
luciérnaga luciferasa
plásmido reportero, miR-130a /301a /454 sitios objetivo eliminado o mutado constructo indicador, junto con plásmidos RL, ARN de control, o miR-130a /301a /454 mímica, como se indica. Después de 48 h,
luciérnaga se midió la actividad luciferasa
y normalizado por
Renilla
actividad luciferasa. Las células HCT116 y SW480 (C) fueron transfectadas con ARN de control o miR-130a /301a /454 sinóptico. Después de 48 h, Smad4 humano y GAPDH de control interno se detectaron por inmunotransferencia (panel superior), y los niveles de miR-130a /301a /454 expresión se midieron mediante el ensayo de QRT-PCR (panel inferior). Se muestra la relación de la densitometría para inmunotransferencia. (D) las células HCT116 se co-transfectadas con el reportero CAGA12-lux TGF o el reportero BMP BRE-lux, junto con el plásmido RL, el ARN control, o el inhibidor de miR-130a /301a /454, y TβRI-ca o BMPRI-ca , como se indica. Después de 48 h,
luciérnaga se midió la actividad luciferasa
y normalizado por
Renilla
actividad luciferasa. La expresión endógena de Smad4 y GAPDH se detectaron por inmunotransferencia. TβRI-ca, la forma constitutivamente activa del receptor de TGF-β I; BMPRI-ca, la forma constitutivamente activa de BMP-receptor I. expresión (E) Smad4 en el vector pCDNA vacío o Smad4 que expresan de forma estable el plásmido-transfectadas las células HCT116 se detectaron por inmunotransferencia. Las células HCT116 transfectadas de forma estable (F, G) de control o Smad4 fueron transfectadas con ARN de control, miR-130a /301a /454 mímica (F), o un inhibidor de miR-130a /301a /454 (G), como se indica. La viabilidad celular se detectó 96 h después de la transfección utilizando ensayos CCK8. *,
p
. & Lt; 0,05
Además, se determinó si los efectos estimulantes del crecimiento de miR-130a /301a /454 son principalmente a través de la orientación expresión Smad4. plásmido Smad4 que expresan de forma estable las células HCT116 transfectadas se prepararon, que transcribe Smad4 mRNA sin la secuencia 3'UTR. En estas células, se confirmó la expresión de Smad4 que aumentarse en comparación con las células control (Fig 4E.); Sin embargo, el miR-130a /301a /454 ya no dirigidos expresión Smad4, ya que estas células transcriben Smad4 mRNA sin el 3'UTR. En particular, el aumento de los efectos del crecimiento de miR-130a /301a /454 se suprimieron significativamente en las células HCT116 transfectadas con Smad4 (Fig. 4F). Por otra parte, inhibidor de miR-130a /301a /454 no reprimir la viabilidad celular en estas células (Fig. 4G). Estos resultados demostraron además que los papeles que promueven el crecimiento de miR-130a /301a /454 eran principalmente a través de la inhibición de la expresión de Smad4.
correlación clínica entre miR-130a /301a /454 niveles y expresión Smad4
Para entender el significado clínico de miR-130a /301a /454 y su objetivo en el cáncer de colon, a fin de determinar los niveles de miR-130a /301a /454 y expresión de proteínas de Smad4 en 14 pares de muestras de cáncer de colon emparejados por QRT PCR e inmunotransferencia, respectivamente (Fig. 5A y B). Como era de esperar, el análisis de coeficiente de correlación de Pearson sugerido que la expresión Smad4 se correlacionó inversamente con miR-130a /301a /454 expresión en tejidos de cáncer de colon (Fig. 5C-E). Estos datos apoyan la noción de que la sobre expresión de miR-130a /301a /454 conduce a Smad4 baja regulación, inhibiendo de este modo la supresión del crecimiento de células de señalización mediada por TGF-β, que contribuye al desarrollo de cáncer de colon.
(a, B) Expresión de Smad4 y GAPDH en muestras de cáncer de colon emparejado y los tejidos de la mucosa no neoplásicas se detectó por inmunotransferencia (a). miR-130a /301a /454 expresión fue examinado por QRT-PCR (B). Se muestran cuatro casos representativos. (C) El nivel relativo de Smad4 o miR-130a /301a /454 expresión se normalizó a GAPDH la expresión interna o U6. El análisis estadístico se realizó mediante el análisis de correlación de Pearson. Normalizadas miR-130a /301a /454 y proteína Smad4 niveles de expresión se muestran como valores estandarizados.
r
y
valores de p
se muestran como se indica.
Discusión
En el presente estudio, se demostró que el miR-130a /301a /454 es hasta reguladas en el cáncer de colon, y demostró aún más el efecto de la proliferación de la promoción de miR-130a /301a /454 en células de cáncer de colon. MicroARN-130a /301a /454 se indica como miARN oncogénicas en el desarrollo del cáncer de colon y la progresión, que es coherente con papeles en otros tipos de cáncer, como el carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón de células no pequeñas, la leucemia mieloide crónica, cáncer de páncreas y cáncer de mama [15 ] - [21]. Sin embargo, el miR-130a es el regulado en la leucemia linfocítica crónica, y puede modular la supervivencia celular mediante la inhibición de la autofagia el programa [22]. Además, el nivel plasmático de miR-301a es regulada hacia abajo en los pacientes con anemia de células falciformes, en comparación con los controles normales, que está relacionado con PAI-1 supresión [23]. Los patrones conocidos de expresión, objetivos potenciales, y las funciones biológicas de esta familia miR-130a /301a /454 se resumen en la Tabla 1 [15] - [23], [25] - [29]. Las diferentes características de expresión de miR-130a /301a siempre son representativas de las diversas funciones de la familia de miR-130/301 en diferentes tipos de cáncer. Por lo tanto, la desregulación de miR-130a /301a /454 existe en distintos tipos de cáncer, así como las funciones de esta familia de genes miARN en la carcinogénesis y la progresión no se puede concluir simplemente como un supresor de tumores u oncogén. La exploración de los perfiles de expresión y las funciones de miR-130a /301a /454 en el cáncer de colon ampliará en gran medida nuestra comprensión de esta familia miARN importante en la tumorigénesis.
La vía de señalización de TGF-β juega un papel esencial en numerosas procesos biológicos. Smad4, el transductor pivotante del TGF-β y vía de señalización de BMP, actúa como un importante supresor de tumor. mutaciones Smad4 o supresiones han sido ampliamente observado en diferentes tipos de cáncer, como el colorrectal, de páncreas, y cáncer de mama [30] - [32]; sin embargo, el mecanismo detallado de Smad4 inactivación es limitado. Hemos demostrado que el miR-130a /301a /454 reprime la expresión Smad4 través de la unión directa a 3'UTR, mientras que también señaló que hay otros sitios consenso miARN en la Smad4 3'-UTR (por ejemplo, sitios de miR-34a, miR 146a, y miR-199a, que han sido identificados como reguladores negativos de Smad4 en el cáncer gástrico y glioblastoma) [33] - [35]. Por lo tanto, no podemos descartar la posibilidad de que estos miRNAs también participan en la regulación negativa de la expresión de Smad4 en el desarrollo de cáncer de colon. Además, no podemos excluir la posibilidad de que otros posibles objetivos de miR-130a /301a /454 pueden regir vías adicionales del cáncer y promover el desarrollo del cáncer de colon, como una sola miARN es conocido por dirigir múltiples ARNm. Estas hipótesis indican la necesidad de realizar más estudios para revelar toda la "targetome" de la familia de miR-130/301/454 en la carcinogénesis de colon y la progresión.
células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden ser generados por la expresión forzada de factores de transcripción, incluyendo Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc [36]. miRNAs específicos han demostrado estar involucrados en la generación de IPSC, como miR-290 y miR-302 [37] - [39]. Recientemente, Pfaff et al. [25] mostró que la familia de los genes miARN (MIR-130/301/721) funciona como un importante regulador de la inducción de IPSC apuntando el factor de transcripción homeobox, MEOX2. La generación de iPSCs implica un proceso de mesenquimales-a-epitelial de transición (MET), por lo tanto, los factores de inducción de MET o el bloqueo de la epitelial a mesenquimal transición (EMT) mediante la inhibición de TGF-β de señalización juega un papel esencial en la reprogramación celular [40] . Hemos descubierto una nueva diana de MIR-130/301/454 familia (Smad4), que tiene la función clave en la señalización de TGF-β, proporcionando la posibilidad de que la familia de miR-130/301/454 puede controlar la reprogramación por la supresión de TGF-β /Smad4 actividad. Por lo tanto, nuestros estudios han arrojado nueva luz sobre el mecanismo molecular y la diafonía de la regulación de células madre y la tumorigénesis.
En conclusión, nuestros resultados confirman que la familia miR-130a /301a /454 es un determinante crítico de diferentes tipos del desarrollo y progresión del cáncer. Por lo tanto, el miR-130a /301a /454 familia puede representar una diana molecular prometedora para la detección precoz de los cánceres.