Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en el mundo. El riesgo de muerte está estrechamente correlacionada con la etapa de la CRC en el momento del diagnóstico primario. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante para la identificación de biomarcadores sanguíneos que pueden permitir la detección temprana del CRC. Se utilizó un enfoque proteómico cuantitativo con el etiquetado isobárica (iTRAQ) para examinar los cambios en el proteoma de plasma de 10 pacientes con CCR en comparación con voluntarios sanos. Ligado a enzimas Immunosorbnent (ELISA) y Western blot se utilizaron para su posterior validación. En nuestro análisis cuantitativo proteómica, detectamos 75 proteínas del plasma humano con la confianza de más de 95% usando etiquetado iTRAQ en conjunción con microQ-TOF MS. 9 hasta regulada y se observaron 4 proteínas regulan a la baja en el grupo CRC. El nivel ORM2 en plasma se confirmó que era significativamente elevado en los pacientes que sufren de CRC en comparación con los controles. ORM2 expresión en los tejidos de CRC se aumentó significativamente en comparación con la de los tejidos correspondientes mucosas normales adyacentes (
P Hotel & lt; 0,001). ITRAQ junto con Q-TOF /MS es una técnica sensible y reproducible de la proteómica cuantitativos. La alteración en la expresión de ORM2 sugiere que ORM2 podría ser utilizado como un biomarcador potencial en el diagnóstico de CRC
Visto:. Zhang X, Xiao Z, Liu X, Du L, Wang L, Wang S, et al. (2012) El papel potencial de ORM2 en el desarrollo del cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10.1371 /journal.pone.0031868
Editor: Anthony W. I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 7 de noviembre de 2011; Aceptado: January 13, 2012; Publicado: 21 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Contrato de subvención patrocinador: la Fundación Nacional clínicos clave especiales. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en 2009, la Sociedad Americana del cáncer estima un total de 146,970 nuevos casos de cáncer colorrectal (CRC) y 40% de las muertes en los Estados Unidos. Se espera que CRC considera el tercer cáncer más común en Estados Unidos. Desde 1975, ha habido una mejora notable en CRC tasas de supervivencia relativa a 5 años, como resultado de un diagnóstico precoz y la mejora de los tratamientos [1]. Sigmoidoscopia mejoró significativamente la tasa de detección de CCR. Sin embargo, su amplia aplicación es aún limitada debido a los altos costos e inconvenientes. Por lo tanto, se necesitan marcadores tumorales basados en sueros específicos para el diagnóstico precoz y el pronóstico.
marcadores de plasma /suero (por ejemplo, antígeno carcinoembrionario, CEA) son los marcadores tumorales más utilizados y fiables para la CRC, ya que son fáciles de medir cuantitativamente , reproducible y rentable. Aunque las directrices actuales de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) recomiendan que los niveles de CEA deben ser controlados cada 2-3 meses durante al menos 2 años después del diagnóstico, no hay un consenso claro sobre la validez de monitoreo CEA [2]. Varios estudios [3] - [5] cuestionaron el valor de CEA como un marcador de CRC recurrencia, especialmente en pacientes con niveles de CEA preoperatorios normales. Debido a estos problemas, se requieren nuevos biomarcadores para mejorar la detección precoz y la predicción de la recurrencia para todo tipo de CRC. Diferentes patrones proteómicos en suero presentan nuevas oportunidades para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico de alta sensibilidad para la detección precoz de los cánceres [6].
En la literatura, las tecnologías proteómicas se han utilizado para estudiar los biomarcadores séricos de CRC. En estos estudios, las estrategias proteómicas como de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida (2-D PAGE), la diferencia de fluorescencia de dos dimensiones en la electroforesis en gel (2-D DIGE), desorción por láser mejorada en superficie /tiempo de ionización de espectrometría de masas de vuelo (SELDI -TOF MS) y la tecnología de proteínas matrices se han utilizado, pero ninguno puede evaluar con precisión el nivel de altura o baja regulación de los biomarcadores propuestos. Por lo tanto, es difícil determinar sus especificidades y validez en estudios ciegos de las muestras [7], [8]. Para descubrir nuevos biomarcadores de plasma, un nuevo enfoque con Isobáricas Etiquetas para absolutas y relativas cuantificación (iTRAQ) se ha aplicado [9]. La incorporación estable de isótopos en un reactivo de marcado amina está involucrado en este método de marcaje químico. Mediante el uso de la espectrometría de masas, las proteínas se pueden detectar de forma fiable y permitir la cuantificación comparativa de una manera multiplex. El núcleo de esta metodología es un conjunto multiplexado de reactivos isobáricas que producen péptidos-amina derivada. Los péptidos derivatizados son indistinguibles en la EM, pero exhiben intensos iones de baja masa firma MS /MS que apoyan la cuantificación. Este método imparte una diferencia de masa como la base para la cuantificación mediante la medición de las áreas de pico relativas de MS y /o espectros de masas MS /MS. Hoy en día, los reactivos disponibles en el mercado 4-plex y 8-plex se puede utilizar para etiquetar muestras de proteínas de interés después de la digestión con tripsina. Diversas etiquetas isobáricas en este método sugieren que en un solo análisis de espectrometría de masas, hasta 4 u 8 muestras diferentes, uno de los cuales es una referencia, se puede examinar simultáneamente. Dada esta razón, el enfoque iTRAQ se propone como muy prometedor en el descubrimiento de biomarcadores en muestras con una amplia gama de plasma, fluidos y tejidos corporales.
En este estudio, iTRAQ se acopló con microQ-TOF /MS para detectar las proteínas expresadas diferenciales en el plasma de pacientes y los controles de CRC. Entre las proteínas que fueron elevados en el plasma CRC, 9 proteínas fueron reguladas y 4 se redujeron reguladas. Hablamos de sus posibles funciones y verificamos ORM2 que puede ser un biomarcador potencial para serológica (los) pacientes con CCR. La función específica de esta proteína aún no se ha determinado; sin embargo, ORM2 parece funcionar en la modulación de la actividad del sistema inmunitario durante la reacción de fase aguda, que tal vez jugar un papel potencial en el desarrollo temprano de CRC. La creciente evidencia indica que la inflamación asociada al tumor puede impulsar el desarrollo y progresión del tumor, mientras que el desarrollo y progresión del tumor podrían inducir la inflamación, que puede jugar un papel fundamental en todas las etapas de la tumorigénesis. Tales moléculas inflamatorias pueden ser detectados en muestras de sangre de pacientes cancaer y pueden ser tener un papel potencial en la detección temprana del cáncer. En este estudio, la sobre regulación de ORM2 fue confirmada por ELISA en el plasma de los pacientes con enfermedad del sistema intestinal.
Resultados
Identificación de biomarcadores candidatos por microQ-TOF MS
para microQ-TOF MS perfiles de proteínas, se recogieron muestras de plasma de 10 pacientes de CRC y 10 individuos en el grupo de control (2 ml de plasma a partir de cada individuo) y después se mezclan para formar un conjunto de muestras para su posterior ensayo. 100 l de muestras agrupadas de cada grupo se immunodepleted de 12 proteínas plasmáticas abundantes por la técnica de columna de inmunoafinidad como se describe en Métodos.
muestras de plasma Immunodepleted se digirieron con tripsina, marcado con una etiqueta isobárica único, combinaron y analizaron simultáneamente por microQ-TOF MS. grupo CRC se marcó con iTRAQ-114 y el grupo de control sano se marcó con iTRAQ-117 y luego se separa por cromatografía de intercambio catiónico fuerte y fraccionamiento C18. 75 proteínas fueron identificados por microQ-TOF MS con confianza ≥95%. Entre este grupo, se seleccionaron 13 proteínas expresadas diferencialmente basado en 1,5 veces sobre-expresión y 1,5 veces menores de expresión en pacientes con CRC, en comparación con los voluntarios sanos. Nueve de las 13 proteínas proteínas expresadas diferencialmente fueron hasta reguladas (Tabla 1). Se encontraron tres proteínas ser significativamente elevados en el grupo de CRC (con relaciones de transmisión desde 1.3 a 4.4). Cuatro proteínas se redujeron regulado en pacientes con CRC, y sus niveles de expresión se muestran en la Tabla 2. La varianza estadística de tumor frente proporciones normales fue dentro del nivel de confianza 95º (P = 0,05).
Medición de ORM2 en muestras de plasma
Como se muestra en la Fig. 1, los niveles de plasma ORM2 sobre una escala logarítmica en diagramas de caja y bigotes, las concentraciones medias en plasma ORM2 fueron significativamente mayores en comparación con el CRC colon y recto normales, pólipo hiperplásico, y adenoma (todos a P & lt; 0,001, respectivamente). El nivel ORM2 plasma fue estadística y significativamente mayor en los pacientes con EII que en el colon y recto normales, pólipo colorrectal hiperplásico y adenoma (todos a P & lt; 0,001, respectivamente) y fue estadística y significativamente mayor en los pacientes con EII que en CRC (
P
. & lt; 0,05)
la estrella (estrellas) en la figura significa un signo para el análisis estadístico. Una estrella significa P & lt; 0,05 y el signo con tres estrellas significa P & lt; 0,001. CRC es estadísticamente diferente de la normal de colon y recto, pólipos hiperplásicos y adenomas (todos a P & lt; 0,001, respectivamente); La EII es estadísticamente diferente de lo normal el pólipo hiperplásico colorrectal y adenoma (todos a P & lt; 0,001, respectivamente). La EII es estadísticamente diferente del cáncer colorrectal (P & lt; 0,05).
Se evaluó si ORM2 de plasma podría eventualmente caracterizarla CRC de enfermedades colorrectales benignas. Se realizaron búsquedas de correlación (edad, sexo, estadio TNM y el grado histológico) entre los niveles de plasma y ORM2 parámetros clínico del paciente CRC (Tabla 3). No se encontró asociación significativa entre las concentraciones de plasma ORM2 y la edad, el género, el estadio TNM o el grado histológico.
Medición de ORM2 en muestras de tejido
Se utilizó el análisis de Western blot para determinar la expresión de ORM2 en los tejidos. Cuando la expresión de proteínas se midió mediante un densitómetro, el valor medio de densitómetro ORM2 en tejidos de cáncer de CRC era significativamente mayor que en los tejidos normales adyacentes mucosas correspondiente (
P
& lt; 0,01). (Fig. 2)
Discusión
En los últimos años, la proteómica basada descubrimiento de biomarcadores de suero /plasma ha ganado impulso. Un número de estudios han intentado utilizar enfoques proteómicos para el descubrimiento de nuevos biomarcadores para los pacientes de CRC [10] - [14]. Los estudios realizados por Kim Yong-Sam [10] reveló 26 biomarcadores candidatos para la Convención a cargo combinado 2-DE y nano-LC-FT-ICR /MS LTQ. Ma et al [11] identificaron 4 proteínas con potencial de diagnóstico por SELDI que investigan el proteoma de suero de 62 pacientes con CCR y 31 sujetos sin cáncer. Sin embargo, las cuestiones relativas a la complejidad y el rango dinámico de las proteínas constituyentes han hecho que sea difícil obtener datos significativos para la interpretación. Tanto el suero y plasma muestran gran variación en la abundancia de proteínas individuales. LC-MS /MS se acerca para el análisis de suero /muestras de plasma ofrecen mucho mejores capacidades de rango dinámico. Además, los reactivos iTRAQ han ganado interés en este campo como una herramienta útil para el descubrimiento de biomarcadores de proteínas. Es el primer estudio para combinar iTRAQ con Q-TOF /MS en muestras de plasma de pacientes con CRC para descubrir biomarcadores potenciales para la CRC. 13 proteínas con diferentes patrones de expresión en plasma CRC se identificaron con éxito. Entre estas 13 proteínas, había varias proteínas de interés, tales como ORM2, inhibidor de peptidasa Serpin (clado D), NADH deshidrogenasa subunidad 5 (ND5) y retinol proteína de unión 4 (RBP4), que fueron seleccionados como candidatos beneficiosos y puede estar además investigado. ORM2 (alfa-1-glicoproteína ácida), un miembro de la familia de proteínas de fase aguda encontrado estar relacionado con la enfermedad sistema intestinal [15] - [18], fue seleccionada para su posterior comprobación e investigación
. se sabe que los cánceres se acompañan de numerosos cambios fisiológicos y bioquímicos sistémicas, incluyendo la glicosilación que es una de las modificaciones después de la traducción más importantes de las proteínas. Cada vez son más las atenciones están siendo pagados en el estudio de glicosilación aberrante durante varios estados fisiopatológicos, incluyendo la inflamación [19], la artritis [20], [21], y el cáncer [22], [23]. Durante la organización de nuestros datos, hemos encontrado varias proteínas glicosiladas serológicos como ORM2, EpCAM cambiante en los niveles durante el desarrollo del cáncer. En esta investigación preliminar, se informó ORM2 como un nuevo miembro de estas glicoproteínas asociadas al cáncer. Wandall [24] utiliza una novela de microarrays O-glucopéptidos a la pantalla de perfiles seromic de los pacientes con cáncer colorrectal cancer.Dai [25] fotografiada por separado el cambio en las glicoproteínas indirectamente. Estos informes fomentan otro ángulo para descubrir biomarcadores clínicos para el diagnóstico y el pronóstico
Hay varios informes de ORM2 en la enfermedad sistema intestinal y cáncer [15] -. [18], [26]. ORM2 se consideró que estar relacionado con la permeabilidad capilar [15]. Se informó de la función de orosomucoid estar relacionado con la inflamación y el cáncer. Se encontró que la concentración de S-orosomucoid ser aumentado en pacientes con la enfermedad de Crohn [16]. Al comparar los pacientes con cáncer de vejiga con los controles sanos, no hubo diferencias significativas, con mucho más orosomucoid expresa en el grupo de cáncer [17]. fenómeno similar podría también encontrado en pacientes con carcinoma bronquial [18]. Usando el 2-D DIGE y se analizaron por MALDI-TOF espectrometría de masas en pacientes con polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica más, se identificó importantes sobre regulación de la alfa-1 glicoproteína ácida 1 precursor [26]. Los estudios han indicado que el CEA, similar a la alfa-1-glicoproteína ácida (orosomucoid) en inmunología se postula como un precursor biosintético de alfa-1-glicoproteína ácida [27].
Este es el primer reporte de una regulación ORM2 de CRC en el plasma. Por otra parte, la sobre regulación de ORM2 fue confirmada por ELISA en el plasma de los pacientes con enfermedad del sistema intestinal. Se encontró que ORM2 se incrementaron significativamente en los pacientes que sufren de CRC y la EII en comparación con individuos normales y pacientes con pólipos hiperplásicos y adenoma. ORM 2 es una proteína plasmática de fase aguda clave en la inflamación, por lo que esta proteína se clasifica como un reactante de fase aguda. La función específica de esta proteína aún no se ha determinado, sin embargo, ORM2 parece funcionar en la modulación de la actividad del sistema inmunitario durante la reacción de fase aguda. Esto puede servir como un mediador potencial de escape inmune en CRC y la detección de ORM2 puede ser importante en la carcinogénesis colorrectal distintivo de la EII.
Para determinar la fuente de ORM2, el tejido tumoral y CRC correspondientes tejidos normales adyacentes mucosas se evaluaron por transferencia de Western. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de ORM2 en tejidos de cáncer de CRC se encontró que era más alta que en el tejido normal. Por lo tanto, se propone que ORM2 podría estar implicado en la carcinogénesis en pacientes con cáncer de CRC.
Este estudio también proporciona evidencia de que los niveles de ORM2 en pacientes con CRC pueden ser útiles como un biomarcador para el diagnóstico. ensayos de suero CEA no se recomiendan para el cribado de pacientes asintomáticos para el cáncer. Una razón es que el ensayo de CEA plasma no es suficiente de diagnóstico para discriminar entre tumores malignos localizados y trastornos benignos. En nuestro estudio, la detección de ORM2 mediante ELISA y Western blot es prometedor. Las concentraciones plasmáticas de ORM2 fueron significativamente mayores en CRC en comparación con el colon y recto normales, pólipo hiperplásico, y adenoma (P & lt; 0,001). Por lo tanto, el uso de ORM2 para monitorizar potenciales pacientes de CRC puede ser una buena manera de validar si ORM2 se puede utilizar para el cribado de pacientes asintomáticos. Sin embargo, es importante analizar aún más la importancia diagnóstica de ORM2 por un gran número de pacientes en múltiples centros de antes de la aplicación clínica final para el diagnóstico CRC
.
inhibidor Serpin peptidasa, clado D (heparina cofactor), el producto codificado cofactor de heparina que comparte homología con la antitrombina III y otros miembros de la superfamilia de alfa 1-antitripsina puede inhibir rápidamente la trombina en presencia de heparina. Los defectos en SERPIND1 son la principal causa de la deficiencia de cofactor II de la heparina, heparina y deficiencia de cofactor II pueden conducir a un aumento de la generación de trombina y un estado de hipercoagulabilidad una. Esto es desventajoso para el desarrollo de cáncer. Hay varios informes sobre clado A y E en el cáncer [28], [29], pero pocos en el clado D. proteína similar también fue identificado como un precursor de alfa-1-antiquimotripsina. Alfa-1-antiquimotripsina pertenece a la familia de las serpinas, es altamente expresado en los astrocitos y se ha encontrado que juegan un papel en la patogénesis de las placas clásicas con la enfermedad de Alzheimer. Como un factor de fase aguda, se puede inhibir la actividad de ectoenzimas de macrófagos y la matriz metaloproteinasa-9 durante la cicatrización de heridas [30], pero induce la producción de TNF-α en el estudio de líneas de células microgliales [31]. Este tipo de inhibidor de la proteasa se ha descrito la formación de complejos con la familia de la calicreína, tales como hK3 (también conocido como un antígeno específico de la próstata), hK2 y hK6, y podría ser aplicado en el diagnóstico de cánceres de próstata [32].
Entre las proteínas reguladas por, ND5, un componente esencial de la subunidad complejo mitocondrial toda I [33], [34], desempeña un papel importante en el proceso de fosforilación oxidativa, así como en la carcinogénesis. Alguna literatura indicó que ND5 podría inducir hepatomas [35]. El ADN mitocondrial (ADNmt) mutaciones se han notificado en muchos tipos de cánceres. defectos genéticos de ADN mitocondrial pueden estar implicados en la patogenia de la manifestación fatal [36]. mutación de cambio de marco en genes ND5 ha informado en el carcinoma hepatocelular, y también en las lesiones preneoplásicas del tracto gastrointestinal [37]. En este estudio, hemos identificado ND5 (67 kDa) como un candidato potencial, pero su papel exacto en la carcinogénesis aún necesita más investigación, especialmente las mutaciones.
RBP4, una citocina secretada por el tejido adiposo, es una novela adipocina vinculados con la obesidad y la resistencia a la insulina de la diabetes tipo 2. RBP4 también se ha demostrado que participan, en cierta medida, en el desarrollo de la inflamación y el cáncer. Por ejemplo, RBP4 metilación se investigó en el carcinoma de células escamosas de esófago [38]. En el carcinoma colorrectal, el nivel de RBP disminuye [39]. En nuestro estudio, hemos identificado RBP4 como un posible candidato, pero una mayor investigación de su función en la patogénesis de desarrollo de cáncer que se requiere.
En este estudio preliminar de prueba de principio, la Tabla 1 y Tabla 2 lista de 13 candidatos biomarcadores para el CDN. La mayoría de ellas no han sido reportados como biomarcadores de cáncer, que han demostrado que iTRAQ junto con Q-TOF /MS es una técnica sensible, reproducible y robusto para identificar diferencias estadísticamente significativas de expresión de proteínas pacientes betweenCRC y muestras de plasma de control sanos. De la verificación de ORM2, se encontró que ORM2 puede ser un biomarcador potencial para distinguir CRC de IBD. En estudios futuros, se requerirá que las poblaciones de muestra más grandes para confirmar estos biomarcadores potenciales. En nuestra investigación, ORM2 se identifica en primer lugar como una proteína diferente regulada en pacientes con CCR en comparación con los controles normales con detección proteómica. Sin embargo, requiere una gran cantidad de experimentos de banco y las pruebas clínicas antes ORM2 se puede utilizar como un biomarcador fiable. Vamos a continuar nuestro estudio sobre ORM2 en dos aspectos. En primer lugar, estamos estableciendo una plataforma para distinguir y analizar las relevancias de niveles distintos en las modificaciones del patrón de glicosilo a diversas fases de desarrollo en base a las enfermedades ORM2. Al mismo tiempo, también estamos muy interesados en la función de ORM2 en la progresión tumoral, debido a que regula la homeostasis de los lípidos y las proteínas de control de calidad en la membrana del retículo endoplásmico.
Métodos
Preparación de muestras
Este estudio fue aprobado y supervisado por el Comité de Ética del hospital Qilu, Universidad de Shangdong. Las muestras de plasma para la proteómica de 10 pacientes del grupo CRC y 10 grupo control sano se recogieron (Tabla 4). Para cada persona, 2 ml de sangre se obtuvo por punción venosa y se recoge en un tubo con EDTA, y el plasma se preparó según lo recomendado por el HUPO Plasma Proteoma Proyecto [40]. Hubo un total de 419 sujetos para ELISA, que fueron clasificados en cinco categorías por endoscópica radiológica estándar clínico, y los criterios histológicos: control normal (n = 65), pólipo hiperplásico (n = 59), la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (n = 62), adenoma (n = 53) y CRC (n = 180). Por Western blot, se evaluaron un total de 41 pacientes consecutivos con diagnóstico de CCR. las muestras de tumor y los correspondientes tejidos normales adyacentes mucosas (& gt; 5 cm del margen del tumor) se recogieron y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Ninguno de los pacientes en este studyreceived cualquier tipo de terapia, tales como la radiación o la quimioterapia.
inmunodepleción de proteínas de plasma de alta abundancia
Plasma muestras de 10 pacientes con CCR y 10 individuos en el control grupo se recogieron (2 ml de plasma de cada individuo) y luego se mezcla para formar un conjunto de muestras para su posterior examen. Las muestras de plasma reunidas se agotan de los 12 mejores proteínas más abundantes (albúmina, IgG, IgA, IgM, transferrina, el fibrinógeno, α
2-macroglobulina, α
1-antitripsina, haptoglobina, α
1-ácido glicoproteína, apolipoproteína AI y apolipoproteína a-II) utilizando una columna de afinidad LC Seppro ™ MIXED12 de 2 ml preenvasados (Genway Biotech, San Diego, CA) en un sistema de la serie de HPLC Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA) de acuerdo el procedimiento recomendado por el fabricante
.
Tras el agotamiento, las proteínas precipitadas se disolvieron por tampón de lisis (6 M urea, 4% CHAPS, PMSF 1 mM, EDTA 2 mM). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el Kit 2D Quant (GE Healthcare, EE.UU.), usando albúmina como patrón de referencia (1 mg /l-10 g /l). Las concentraciones se miden a 4,83 g /l (el grupo de CRC) y 2,27 g /l (el grupo sano).
Trypic Digeston y iTRAQ reactivo de marcado
Después de la reducción (DTT 10 mM, 100 mM NH4HCO3, 56 ° C, 45 min) y alquilación (IAA 55 mM, NH4HCO3 100, 45 min), cada muestra (100 g) se digirió con tripsina y se marcaron con reactivos iTRAQ. Estas muestras se digirieron en tampón de disociación (trypsin:protein = 1:30) durante la noche a 37 ° C. Los péptidos se marcaron con reactivos iTRAQ (114 para el grupo CRC, 117 para el grupo sano).
cromatografía de intercambio catiónico fuerte y C18 columna de fraccionamiento
cromatografía de intercambio catiónico fuerte se utiliza para eliminar la redundancia iTRAQ reactivos y sustancias de interferencia que pueden afectar el análisis de MS. Se añadieron las muestras marcadas con 10 x tampón A (KH2PO4 10 mM en 25% de acetonitrilo, pH 3,0). a continuación, se llevó a cabo la cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución para separar las muestras marcadas en 10 fracciones. Los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de KCl 0~500 mm (25% v /v ACN, 10 mm KH2PO4, pH 3) durante 15 min a una velocidad de flujo de 1 ml /min, con fracciones recogidas a intervalos de 1 min. Las muestras se desalaron y se fraccionó adicionalmente usando una columna C18 HPLC en nano (PROXEOME, América), seguido por análisis de MS. El gradiente fue 5~40% de ACN durante 70 min.
Matrix asistida por láser de ionización-desorción tiempo de vuelo (MALDI-TOF) /TOF-TOF y microQ análisis
Parámetros de la máquina se establecieron de la , fuente de iones de 25 kV para la factorización positivo matriz (PMF) y 8,0 kV para tándem MS /MS reflector de 26,3 kV para PMF y 29,5 kV para tándem MS /MS, lente de 9,5 kV para PMF y 3,5 kV para tándem MS /MS, levante 19.0 kV y los espectros fueron adquiridos en modo de reflexión en MALDI TOF /TOF con rango de masas 700~4000. Los picos con una relación de S /N de más de 5 se marcaron automáticamente por FlexAnalysis (Bruker, Alemania). Se seleccionaron los picos PMF con intensidad masa de más de 5000 para más MS /MS. Los espectros se adquirieron en modo de iones positivos en microQ-TOF con rango de masas 50~3000, y el gas seco y el gas nebulizador se establecieron como 3 L /min, y 2 L /min, respectivamente. La temperatura de la cámara de pulverización se fijó como 150 ° C, y se fijó la fuerza del campo eléctrico como 1.400 V, la energía de colisión se estableció como 35% de temporización para masas de iones baja y 65% de temporización para masas de alta de iones. Otros parámetros fueron configurados como predeterminados.
Base de datos de búsqueda
Los espectros fueron procesados con el control microQ-TOF 3.0 (Bruker, Alemania) utilizando la configuración predeterminada, excepto que los parámetros de RF transferencia de embudo y colisión celular de RF se establece como 120 Vpp y 600 Vpp, respectivamente. El posterior análisis de datos se realizó mediante el análisis de datos 4.0 Biotools 3.0 (Bruker, Alemania), WARP-LC 2.0 (Bruker, Alemania), y la mascota 2,2 (Matrix Science, Londres, Reino Unido), respectivamente. Identificación de proteínas se realizó mediante la búsqueda en la base de datos Swiss-Prot Human2009-12 con un ión precursor y la tolerancia de masas de fragmentos tanto establecer como 0,04 Da. Carbamidomethylation de cisteínas se estableció como la modificación fija, y la oxidación de metioninas, iTRAQ 8 modificación plex de terminal de N, K y Y se consideraron como modificaciones variables, respectivamente. Se aceptó un máximo de errores de la escisión. Los puntos de corte de puntuación de iones se establecieron a 25 para los péptidos y a 68 para las proteínas. péptido identificaciones fueron aceptados si podían establecerse en más del 90,0% de probabilidad según lo especificado por el algoritmo PeptideProphet. la identificación de proteínas fueron aceptados si podían establecerse en más del 90,0% de probabilidad o contenían al menos 2 péptidos identificados. Las proteínas que contienen péptidos similares y no pueden ser diferenciados en base al análisis de MS /MS solo se agruparon para satisfacer los principios de la parsimonia. Para la clasificación, fueron curadas los símbolos de la ontología de genes (GO) de las proteínas identificadas usando la base de datos XRef, y preguntó en contra de la base de datos de ontología de genes utilizando la herramienta GoMiner (http://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Predicción del origen de las proteínas con la localización celular desconocido se realizó utilizando el PSORT II (http://www.psort.org/).
Todas las proteínas proporciones iTRAQ fueron transformados a base 2 los valores de logaritmos. En el espacio de base 2 logaritmo, se informó de un cambio de 2 veces en los niveles como 1 o -1 para regulada hacia arriba y los cambios hacia abajo-regulada, respectivamente.
Elisa para ORM2
niveles
ORM2 en plasma se cuantificó usando un kit de ELISA disponible comercialmente (Groundwork Biotecnología diagnosticar, San Diego, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Western blot para ORM2
los tejidos tumorales y los correspondientes tejidos normales adyacentes mucosas fueron re-suspendido en radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón enfriado con hielo para la lisis. Se utilizó un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime, Biotecnología, China) para el ensayo de proteínas. Sobre 25 g de proteína de las muestras se cargó, separados en 9,0% de Tris-glicina-SDS geles de poliacrilamida y luego electro-transferido a membranas de fluoruro de polivinilideno. Tras el bloqueo con leche desnatada al 5%, las membranas se incubaron con ORM2 Ab (1:150, Tecnología Biológica Yueyan, Shanghai, China) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se incubaron adicionalmente con el ratón policlonal anti-cabra conjugado con HRP anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o policlonal de cabra anti-ratón conjugado con HRP anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La intensidad de cada banda se cuantificó utilizando el software ImageJ 1.32 (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) después de la exploración densitométrica de las películas.
El análisis estadístico
La prueba de Kolmogorov-Smirnov se realizó para determinar la distribución de las muestras de cada grupo. Los datos se expresan como (rango intercuartil, 1IQR) mediano. Se aplicó una prueba no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis) para analizar las diferencias entre el CRC y otros grupos. P & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó con versiones de software SPSS 13.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.).
Reconocimientos
Gracias al Dr. Edward C. Mignot, anteriormente de la Universidad de Shandong, para el asesoramiento lingüístico .