Extracto
de alta resolución de matriz asistida por láser de desorción /ionización de imágenes espectrometría de masas (MALDI-HR-IMS) es una aplicación emergente para el análisis completo y detallado de la distribución espacial de las moléculas ionizadas in situ sobre diapositivas de tejidos. HR-MALDI-IMS en el modo negativo en un rango de masas de m /z 500-1000 se realizó en la temperatura óptima de corte (OCT) muestras de tejido de próstata humano compuestos embebido obtenidas de pacientes con cáncer de próstata en el momento de la prostatectomía radical. análisis HR-MALDI-IMS de las 14 muestras en el conjunto descubrimiento identificado 26 como moléculas altamente expresado en la próstata. Espectrometría de masas tándem (MS /MS) mostró que estas moléculas incluyen 14 fosfatidilinositoles (IP), 3 fosfatidiletanolaminas (PE) y 3 ácidos fosfatídicos (PAs). Entre los inhibidores de la proteasa, la expresión de PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) y PI (18: 0/20: 2) fueron significativamente más altos en el tejido canceroso que en epitelio benigno. Un algoritmo de biomarcadores para el cáncer de próstata se formuló mediante el análisis de los perfiles de expresión de los IP en el tejido canceroso y el epitelio benigno del descubrimiento establecer a través de mínimos cuadrados parciales ortogonales análisis discriminante (OPLS-DA). La sensibilidad y especificidad de este algoritmo para el diagnóstico del cáncer de próstata en las 24 muestras de conjunto de validación fueron 87,5 y 91,7%, respectivamente. En conclusión, HR-MALDI-IMS identificado varios inhibidores de la proteasa como más altamente expresado en el cáncer de próstata que el epitelio prostático benigno. Estas diferencias en los perfiles de expresión PI pueden servir como una herramienta de diagnóstico novedoso para el cáncer de próstata
Visto:. Goto T, N Terada, Inoue T, Nakayama K, Okada Y, Yoshikawa T, et al. (2014) El perfil de expresión de fosfatidilinositol en alta resolución espacial de imágenes de resolución espectrometría de masas como un biomarcador potencial para el cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (2): e90242. doi: 10.1371 /journal.pone.0090242
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: November 26, 2013; Aceptado: 27 de enero de 2014; Publicado: 28 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Goto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) a través del "Programa de Financiación de líder en el mundo innovador amp I +; D de Ciencia y Tecnología (primer programa)", iniciado por el Consejo de Ciencia y Tecnología política ( CSTP) (http://www.first-ms3d.jp/english/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más comunes y la principal causa principal de muerte por cáncer en los hombres [1]. Debido a su heterogeneidad clínica e histológica, sin embargo, no se han determinado los mecanismos que subyacen el desarrollo del cáncer de próstata. metabolismo de los lípidos pueden desempeñar un papel importante en la carcinogénesis humana al afectar numerosos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la proliferación, la diferenciación y la motilidad [2] - [4]. Los patrones de expresión de varios fosfolípidos se ha informado que difieren en cáncer de próstata y tejido benigno de la próstata [5]. FOSFATIDILINOSITOLES (IP), una clase importante de fosfolípidos, están implicados en la transducción de señales intracelulares [6], [7]. En particular, la vía de la PI3-quinasa, que regula muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo de los lípidos, es frecuentemente mutado o se activa en el cáncer de próstata [8], [9]. A diferencia de otros fosfolípidos, perfiles PI muestran patrones específicos en células de mamíferos, siendo afectada por varios aciltransferasas en la vía de la remodelación de la vía (Lands ') [10], [11]. Los perfiles de PI de los tejidos de cáncer de mama humano se ha demostrado que difieren de las de las glándulas mamarias normales [12]. Hasta la fecha, sin embargo, los perfiles de PI no han sido analizados en tejidos de cáncer de próstata.
desorción de matriz asistida por láser /ionización de imágenes espectrometría de masas (MALDI-IMS) es una nueva modalidad que facilita la adquisición de espectros de masas integral directamente desde muestras de tejido y proporciona mapas de densidad reconstruidas de iones detectados [13]. El cáncer de próstata, sin embargo, es multifocal y rodeado de epitelio prostático benigno o estroma, lo que hace difícil identificar lesiones específicas de cáncer por convencional MALDI-IMS. La resolución espacial de esta técnica se ha mejorado recientemente, a menos de 10 micras, lo que facilita un análisis detallado de dos dimensiones de fosfolípidos [12], [14] - [18]. Como la mayoría de las glándulas formas de cáncer de próstata y el diámetro de una sola glándula no es menor de 50 micras, el tono de alta resolución de matriz asistida por láser de desorción ionización /espectrometría de masas de imágenes 10 micras (HR-MALDI-IMS) es suficiente para visualizar con claridad lesiones de cáncer de próstata.
Congelado muestras de tejidos embebidos en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) se conservan en muchos laboratorios clínicos y se utilizan con frecuencia en la investigación del cáncer. Como resultado de problema de contaminación, sin embargo, las muestras congeladas frescas sin compuesto OCT se han utilizado en la investigación IMS lipídica [19], [20]. El uso de las muestras almacenadas sin compuesto OCT es limitada, debido a la formación de cristales de hielo y dificultad para hacer las secciones de tejido.
En este estudio, hemos establecido un sistema en situ usando HR-MALDI-IMS para analizar la expresión de fosfolípidos patrones de muestras de tejido de próstata incrustados en compuesto OCT. Este método identificó varios fosfolípidos como más altamente expresado en el cáncer de próstata que en el epitelio benigno adyacente. Por lo tanto, nos centramos en el perfil de expresión de los inhibidores de la proteasa y se evaluó su potencial para distinguir el cáncer de próstata benigna del epitelio. A nuestro entender, este estudio es el primero en usar HR-MALDI-IMS para investigar los patrones de expresión de fosfolípidos en muestras de tejido de la próstata incrustados en compuesto OCT, y para identificar con éxito las diferencias en los perfiles de expresión PI en el cáncer de próstata.
Materiales Métodos y
Ética declaración
Todos los experimentos con animales de laboratorio se realizaron de conformidad con las Directrices para la Experimentación animal de la Universidad de Kyoto. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Kyoto (Número de Permiso: 13331).
Se se obtuvo el consentimiento informado materiales clínicos después de escrito utilizado, de acuerdo con los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional de hospital de la Universidad de Kyoto.
Preparación de muestras de tejido de compuesto OCT incrustados
Hemos establecido con anterioridad un novedoso modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata humano, llamado KUCaP-2 [21]. Se utilizaron estos tejidos de xenoinjerto para determinar las condiciones apropiadas para el sistema-MALDI-IMS recursos humanos para analizar muestras de tejido de próstata humano incrustado en compuesto OCT. tumores de xenoinjertos se dividieron en dos piezas, con un todo integrado en compuesto OCT (Tissue-Tek®; Sakura Finetek, Torrance, CA, EE.UU.), sin tratamiento de sacarosa para evitar la influencia de la fijación, y el otro congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para evitar la degradación de biomoléculas. Ambas muestras fueron almacenadas a -80 ° C.
Se cosecharon La cohorte de pacientes consistió en 38 pacientes japoneses con cáncer de próstata clínicamente localizado sometidos a prostatectomía radical en el Hospital de la Universidad de Kyoto, de 2005 a 2008. próstata cortes de tejido 5 mm de espesor inmediatamente después de la retirada y se incluyeron en compuesto OCT, sin tratamiento sacarosa y se congelaron a -80 ° C. Todos los bloques congelados produjeron secciones que contienen tejido de cáncer y el epitelio benigno.
La evaluación histológica y revestimiento de matriz de muestras de tejido de la próstata
Después de la separación máxima de compuesto OCT, las muestras de tejido fueron cryosectioned en un criostato (CM1850 ; Leica, Wetzler, Alemania) a -20 ° C. Criosecciones 5 m de espesor fueron montadas en portaobjetos de vidrio (capa MAS; Matsunami, Osaka, Japón) para hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. Todos los portaobjetos se evaluaron por un solo patólogo (S. S.) para determinar la morfología del tejido y como guía para el análisis de HR-MALDI-IMS. de serie de secciones adicionales a 10 micras fueron montadas en indio y estaño recubierta con óxido (ITO) portaobjetos de vidrio (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y se utilizan para el análisis MALDI-HR-IMS. Compuesto OCT-incorporado y muestras de xenoinjerto congelados frescos fueron montadas en la misma diapositiva, mientras que cada muestra de tejido de la próstata clínico de aproximadamente 7,5 × 7,5 mm se montó en una sola diapositiva. Cada sección se revistió con hemihidratos 9-aminoacridina (9-AA) (Acros Organics, Geel, Bélgica), que sirvieron como matriz para MALDI-MS. Cada diapositiva se ancló en el equipo de deposición al vacío (SVC-700TM /700-2; Sanyu Electron, Tokio, Japón) y se recubre con una capa de matriz 9-AA obtenido por sublimación a 220 ° C. El tiempo requerido para el proceso de deposición de vapor era 8 min; No se evaluó el espesor de la capa 9-AA depositado en la diapositiva. Las secciones evaluadas por HR-MALDI-IMS también se tiñeron con H & amp; E y evaluados por el patólogo. Para H & amp; E tinción después del análisis HR-MALDI-IMS, 9-AA fue retirado de los portaobjetos sumergiéndolos en metanol durante 30 s
HR-MALDI-IMS y MS /MS análisis
HR-MALDI-IMS se realizó en un espectrómetro de masas de imágenes microscópicas de alta resolución (RK27-4050C; Shimadzu, Kyoto, Japón, el modelo prototipo de iMScope) equipado con un 355-nm Nd: YAG. datos de espectrometría de masas se adquirieron en modo negativo en el rango de masas de m /z 500 hasta 1000 utilizando un método de calibración externa con masa poder de resolución 10.000 a m /z 1000. Una región de interés (ROI), aproximadamente 2000 × 2000 micras de tamaño y que contiene el tejido de cáncer, el epitelio benigno y estroma, se determinó al azar de la vista microscópica de cada portaobjetos y los espectros de masas se obtuvieron con una resolución espacial de 10 m. El retorno de la inversión fue ratificado por la muestra de espesor 10 micras teñidas con H & amp; E después de la medición HR-madli-IMS. El mismo instrumento se utilizó para la espectrometría de masas en tándem (MS /MS) análisis; la composición de ácidos grasos de los lípidos y la clase de los picos observados se basa en los patrones espectrales de los picos de iones de los productos. La base de datos Metaboloma Humano (http://www.hmdb.ca/) y la Naturaleza lipidómica Gateway (http://www.lipidmaps.org/) fueron utilizados para el posicionamiento. De las 38 muestras, 14 fueron seleccionados al azar como un conjunto descubrimiento y utilizar para identificar moléculas altamente expresado en los tejidos de la próstata y expresados diferencialmente en el cáncer de próstata y el epitelio benigno. Las otras 24 muestras fueron utilizados como un conjunto de validación y de los perfiles de expresión de las moléculas identificadas se analizaron estadísticamente y se evaluó su utilidad como marcadores moleculares para el diagnóstico del cáncer de próstata.
Procesamiento de datos y análisis estadístico de HR-MALDI resultados IMS
Uso SIMtools de software (software de la casa; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón), los perfiles de masas se normalizaron con respecto al total de la corriente de iones para eliminar las variaciones en la eficiencia de ionización, y se utilizan para todos proyección de imagen y estadística análisis. Ion imágenes se visualizaron utilizando el software BIOMAP (Novartis, Basilea, Suiza). Mann-Whitney (M-W) U pruebas se utilizaron para comparar entre los factores de tejido fresco congelado y tejido embebido PTU o entre el cáncer y el epitelio benigno. Para evaluar los perfiles de expresión de IP, los datos normalizados fueron importados en el software 13.0.3 SIMCA (Umetrics AB, Umea, Suecia). Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para el análisis multivariado se utilizó sin supervisión y análisis discriminante (OPLS-DA) por mínimos cuadrados parciales ortogonales para el análisis multivariado supervisada. modelos de PCA y OPLS-DA se representan como gráficos de puntuación (componente principal [PC1, PC2]), que mostrará cualquier agrupación intrínseca de las muestras en base a la variación espectral. En el análisis OPLS-DA, se seleccionaron los biomarcadores potenciales en base a la S-trama. La trama de la covarianza frente a la correlación en conjunción con los trazados de tendencia de variable resultó en una mejor visualización de los datos. Las variables que cambiaban más se representaron en la parte superior o inferior de la "S" en forma de diagrama, y los que no varió significativamente se representaron en el medio. El algoritmo para diferenciar el cáncer del epitelio benigno también fue establecido por OPLS-DA, con un punto de corte óptimo se define como 0,5. El poder predictivo del algoritmo también se ensayó usando el área bajo la curva característica operador receptor (ROC). La sensibilidad se define como la proporción de las regiones de cáncer reales correctamente identificados como tales, y la especificidad se define como la proporción de regiones reales epitelio benigno correctamente identificados como tales. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SIMCA 13.0.3 o SPSS versión 11.0, con p. & Lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo
Resultados
tejidos de cáncer de próstata incrustados en compuesto OCT son adecuados para HR-MALDI -IMS
para evaluar la idoneidad de las muestras de tejido de cáncer de próstata incrustados en compuesto OCT para HR-MALDI-IMS, se utilizó un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata humano (KUCaP-2). Los espectros de masas sin el oct tejidos tumorales mostró los mismos picos como los espectros de masas en la matriz 9-AA solos, lo que indica que la TCO no interfirió con el análisis MALDI-HR-IMS en el modo negativo (Figura 1A). Por otra parte, en el rango de masas de m /z 500-1000, casi no hubo diferencias significativas en los patrones espectrales de muestras compuestas incrustado PTU y muestras frescas congeladas (Figura 1 B, el cuadro S1). Estos resultados indican que los tejidos de cáncer de próstata embebidas en compuesto OCT son adecuados para los análisis de HR-MALDI-IMS en el modo negativo.
tejido recubierto Matrix se sometió a modo de iones negativos HR-MALDI-IMS. Una, dando como resultado un promedio de espectros de masas de cada región (panel superior, matriz; panel del medio, matriz de octubre +; panel inferior, tumor + matriz) en el rango de masas de m /z 500-2000. Los ejes x muestran m /z, y los ejes y muestran la intensidad de la señal de los espectros de masas. También se muestran las imágenes ópticas correspondientes. La barra de escala representa 200 micras. B, H & amp; E de imágenes (panel superior) y fresco congelado compuesto OCT incorporado (panel inferior) las muestras de tumor de xenoinjerto. La barra de escala representa 200 micras. Dando como resultado un promedio de espectros de masas de cada tejido tumoral de xenoinjertos (superior helado en fresco; inferior, compuesto OCT incrustado). En el rango de masas de m /z 500-1000
Veinte fosfolípidos fueron identificadas como altamente expresado en tejidos de próstata humanos
muestras de tejido de próstata humanos embebidos en compuesto OCT se analizaron por HR-MALDI-IMS en el modo negativo en el rango de masas de m /z 500 hasta 1000 (Figura 2A, B). Las características de los 38 pacientes incluidos se muestran en la Tabla 1. De las 38 muestras, 14 fueron utilizados en el conjunto de descubrimiento y 24 en el conjunto de validación. ROI que incluían tanto el cáncer y el epitelio benigno fueron seleccionados al azar en las muestras conjunto 14 de descubrimiento. Los 100 primeros picos de los espectros de masas se analizaron en cada muestra. Excluyendo matriz y los picos isotópicos, 26 picos se detectaron sistemáticamente en 12 o más de las 14 muestras (Tabla S2). Las imágenes de iones fueron claramente visualizados en el cáncer de próstata y el epitelio benigno usando HR-MALDI-IMS centrarse en estos 26 especies m /z (Figura 2C). análisis MS /MS podría identificar la estructura de estas moléculas mediante el análisis de los picos de sus iones precursores (Figura S1). De los 26 picos, 20 fueron identificados como fosfolípidos (Tabla S3), con 14 siendo lisofosfatidilinositol (LPI) y inhibidores de la proteasa (m /z 599,3, 809,5, 833,5, 835,5, 837,5, 857,5, 859,5, 861,5, 863,5, 883,5, 885,5, 887,5, 889,5, 909,5 y), tres son fosfatidiletanolaminas (PE: m /z 716,5, 742.5 y 744,5) y tres son ácidos fosfatídicos (PAs: m /z 673,4, 699,5, 701,5 y). Los ácidos grasos saturados observados contenidos en estos fosfolípidos eran C16: 0 y C18: 0, y el graso insaturado ácidos eran C18: 1, C18: 2, C20: 2, C20: 3, C20: 4, y C22:. 6
tejido recubierto Matrix fue evaluada por el modo de iones negativos HR-MALDI-IMS en el rango de masas de m /z 500-1000. A, H & amp; E manchado muestra de tejido de próstata humana que contienen áreas definidas de epitelio benigno (azul) y el cáncer de próstata (rojo). La barra de escala representa 200 micras. B, Las regiones de interés y que resulta masas promediados de epitelio benigno (panel superior) y el cáncer de próstata (panel inferior). El xey ejes muestra m /z y la intensidad de la señal normalizada de corriente iónica total, respectivamente. espectrometría de imagen C, misa que muestra la distribución de 26 m común especies /z.
perfiles de expresión PI difieren en el cáncer de próstata y el epitelio benigno
Los fosfolípidos más detectados por HR-análisis MALDI-IMS en muestras de tejido de la próstata eran inhibidores de la proteasa. Por lo tanto, nos centramos en los perfiles de expresión PI en el cáncer de próstata y el epitelio benigno. Una comparación de la intensidad de la señal de estos 14 inhibidores de la proteasa en el cáncer y el epitelio benigno en las muestras de conjunto de descubrimiento demostró que la expresión de PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) y PI (18 : 0/20: 2) fue significativamente mayor en el cáncer que en epitelio benigno (Tabla 2). . Visualizaciones representativas de la distribución de estos inhibidores de la proteasa en el HR-MALDI-IMS análisis indicaron que sus niveles de expresión fueron igualmente mayor en cáncer que en el epitelio benigno (Figura 3)
H & amp; E manchadas y las imágenes de espectrometría de masas de muestras de los 5 casos en el conjunto de descubrimiento. H & amp; E imágenes teñidas muestran las áreas de epitelio benigno (azul) y el cáncer de próstata (rojo) definen. La barra de escala representa 200 micras. imágenes de espectrometría de masas muestran la distribución representativa de m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]), 887,5 (PI [18: 0/20: 3]) y 889,5 (PI [18: 0/20: 2 ]), que eran más altamente expresado en el cáncer que en el epitelio benigno en el conjunto descubrimiento.
Para evaluar las diferencias globales en los perfiles de expresión PI de cáncer de próstata y el epitelio benigno, análisis de componentes principales de el 14 inhibidores de la proteasa se realizó en las muestras de conjunto de descubrimiento. Las parcelas de puntuación PCA en PC1 (R
2 = 0,562) y PC2 (R
2 = 0,204) mostraron racimos poco claros en el tejido de cáncer y el epitelio benigno (R
2X: 0,903 [esperma] y Q
2: 0,624 [cum]; Figura 4A). Por el contrario, OPLS-DA distinguirse claramente del cáncer de próstata en el epitelio benigno (R
2X: 0,874 [esperma], R
2Y: 0,735 [esperma] y Q
2: 0.583 [esperma]; Figura 4B) . La validación de un análisis de mínimos cuadrados parciales discriminante (PLS-DA) fue sugestivo de un excelente modelo (Figura S2). Un OPLS S-trama en relación con la proporción de inhibidores de la proteasa en el cáncer y el epitelio benigno se muestra en la Figura 4C. La intensidad de señal de m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]) y 889,5 (PI [18: 0/20: 2]) se aislaron de la S-trama como variables que fuertemente distinguen entre el cáncer de próstata y epitelio benigno. El perfil de expresión de los 14 inhibidores de la proteasa por parte de la OPLS-DA se utilizó para establecer un algoritmo de diferenciación con precisión el cáncer del epitelio benigno (Tabla S4). Usando el algoritmo con el punto de corte óptimo se define como 0,5, la sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de cáncer fueron 85,7 y 92,9%, respectivamente.
A, parcela puntuación de PCA que muestra la discriminación entre el cáncer y el epitelio benigno en el conjunto de descubrimiento . B, gráfico de las puntuaciones OPLS-DA mostrando una clara discriminación entre el cáncer y el epitelio benigno en el conjunto descubrimiento. C, OPLS-DA-S corresponde a la parcela gráfica de las puntuaciones se muestra en (B). El número al lado de cada IP muestra su valor m /z. D, la curva ROC que muestra la capacidad del algoritmo de biomarcadores para distinguir el cáncer de próstata a partir de epitelio benigno en el conjunto de validación.
Para evaluar si este algoritmo podría ser utilizado en el diagnóstico de cáncer de próstata, los perfiles de expresión de inhibidores de la proteasa se evaluaron en las muestras de conjunto de validación. Una curva ROC calculada a partir de este algoritmo se muestra en la Figura 4D, con un área bajo la curva (AUC) de 0,964. El punto de corte de 0,5 tuvo una sensibilidad del 87,5% y una especificidad del 91,7% para distinguir el cáncer de próstata benigna del epitelio.
Discusión
Los lípidos constituyen diversas clases de moléculas con funciones críticas en la energía celular almacenamiento, estructura, y la señalización. El riesgo de cáncer de próstata ha demostrado aumentar cuando se elevan los ácidos grasos en plasma en particular, incluyendo el ácido mirístico, el ácido alfa-linolénico, ácidos eicosapentaenoico y [22], [23]. Muchos lípidos polares individuales [24] - [27] y las moléculas de colesterol-como [28], [29] se han asociado con el desarrollo de cáncer de próstata. Sin embargo, ha sido difícil evaluar estas moléculas directamente en el tejido de próstata, porque la mayoría de los procedimientos de análisis de lípidos, incluyendo MS convencionales, requieren la extracción de lípidos. Una herramienta emergente, MALDI-IMS, puede proporcionar "en la formación de imágenes in situ", sin destruir las estructuras histológicas de materiales biológicos, y las imágenes mapeadas se pueden comparar con las imágenes histológicas correspondientes [30] - [32].
Aunque compuesto OCT se utiliza comúnmente para enterrar y conservar muestras de tejido, las muestras completamente embebidos en compuesto OCT han sido considerados como inadecuados para la investigación IMS lipídica, porque la contaminación por octubre se detecta fácilmente mediante espectrometría de masas y reduce gravemente la detección de otros componentes [19 ], [20]. En este estudio, HR-MALDI-IMS usando 9-AA como una matriz mostró espectros consistente de muestras incrustadas compuesto OCT en un rango de masas de m /z 500 a 1000 en el modo negativo. El patrón espectral y la calidad de estas muestras embebidas-OCT se encontraron equivalentes a los de las muestras congeladas frescas. Este resultado puede ser importante, ya que las muestras congeladas se conservan en compuesto OCT en muchos laboratorios clínicos, lo que permite su uso para la investigación de lípidos mediante MALDI-IMS.
Nos mostró que la HR-MALDI-IMS tenía varias ventajas en comparación con los metodológicas estudios lipidomic convencionales en tejidos de cáncer. cáncer de próstata en etapa temprana es a menudo multifocal y rodeado por el epitelio de la próstata benigna y /o estroma, sin la formación de una masa tumoral. Por otra parte, ya que el cáncer de próstata forma glándulas y el diámetro de una sola glándula puede ser tan pequeño como 50 micras, IMS convencional, con una resolución mayor que 50 micras, se puede distinguir sólo aproximadamente entre los tejidos cancerosos y otros. Así, los estudios anteriores utilizando de menor resolución IMS no pudieron distinguir con precisión regiones específicas de cáncer de próstata a partir de epitelio benigno aunque produjeron potenciales candidatos [33] - [39]. De alta resolución IMS puede superar este inconveniente y puede ser útil para el análisis de tejidos heterogéneos, tales como los cánceres de próstata.
Hemos encontrado que la composición de los IP difería marcadamente en el cáncer de próstata y el epitelio benigno, lo que sugiere que las diferencias PI en los perfiles de expresión pueden ser el resultado de diferencias en las actividades de varios aciltransferasas. Estos cambios en los perfiles de expresión PI no sólo pueden afectar a la fluidez de membrana celular, sino también la actividad de la vía de señalización de PI3K [40] - [43]. Aunque el papel exacto de los IP específicos en la señalización de PI3K sigue siendo desconocida, se informó de los niveles de expresión de los IP que contienen ácidos grasos poliinsaturados que se correlacionan con los de PI3-fosfato [42]. Nuestro estudio es preliminar e incluyó un número relativamente limitado de muestras. Por lo tanto, queda por determinar si los cambios en los perfiles de expresión PI y actividades aciltransferasa están correlacionados y si están directamente relacionados con el desarrollo del cáncer de próstata
Varios inhibidores de la proteasa, incluyendo PI. (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) y PI (18: 0/20: 2) fueron identificados como posibles marcadores biológicos de las células de cáncer de próstata. Nos centramos especialmente en el cambio de distribución de este tipo de moléculas, y no en una sola IP, ya que la función de los IP es controlado por su amplia distribución. El análisis estadístico multivariante, tales como PCA o OPLS-DA, es considerado como una poderosa herramienta para la evaluación integral de los estados metabólicos complejos agrupando cada muestra, suponiendo espectros adquiridos como datos multivariable [44] - [46]. Nuestro algoritmo biomarcador de cáncer de próstata utilizando OPLS-DA fue capaz de distinguir las regiones de cáncer de próstata, incluso en el conjunto de validación, que indica que los perfiles de expresión de los IP en el análisis HR-MALDI-IMS son posibles biomarcadores para el diagnóstico de cáncer de próstata.
Los perfiles de expresión de los IP en los tejidos de cáncer no se correlacionaron con el valor preoperatorio de PSA, la puntuación de Gleason, o el estadio patológico (datos no mostrados). El número de pacientes fue pequeño y la mayoría de las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes con cánceres localizados y bien o moderadamente diferenciados. El algoritmo de clasificación debe ser verificada en una cohorte más amplia, incluyendo los controles normales y pacientes con enfermedad más agresiva. Por otra parte, las relaciones entre los perfiles de expresión PI y los resultados clínicos no se habían determinado.
Nuestros resultados muestran que la HR-MALDI-IMS puede ser una poderosa herramienta de descubrimiento de biomarcadores. El perfil de expresión de inhibidores de la proteasa puede ser un biomarcador candidato para el cáncer de próstata, aunque este hallazgo requiere la verificación en una cohorte de pacientes más grandes y correlación con los resultados clínicos. En general, nuestros resultados sugieren que el uso de HR-MALDI-IMS para identificar los cambios moleculares específicos de la enfermedad en muestras de tejido de la próstata mejorará la patología proceso de toma de decisiones críticas en el diagnóstico del cáncer de próstata.
Apoyo a la Información
Figura S1.
espectros MS /MS de las especies m /z comunes en este estudio. Los picos de iones de productos que corresponden a los grupos de cadena de acilo graso y grupos de cabeza polares se describen en la Tabla S3. El eje x muestra m /z. El eje y muestra la intensidad de señal de los espectros de masas. Abreviaturas: LPI, lisofosfatidilinositol. PA, ácido fosfatídico. PE, fosfatidiletanolamina. PI, fosfatidilinositol. Ins, inositol. SN1, de ácidos grasos en sn-1 posición. . SN2, el ácido graso en la posición sn-2
doi: 10.1371 /journal.pone.0090242.s001 gratis (PPTX)
figura S2.
de validación basado en un modelo PLS-DA calibrada por análisis de permutación. Los parámetros del modelo para la variación explicada (R
2) y la capacidad de predicción (Q
2) fueron significativas (R
2X [esperma] = 0,874; Q
2 [esperma] = 0,535) . Los valores de intersección de la I
2 y Q
2 líneas fueron 0,305 y -0,444, respectivamente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s002 gratis (DOCX) sobre Table S1 . la intensidad de la señal
normarized de corriente iónica total en los 50 primeros compuestos detectados en muestras compuestas embebido en OCT congelados y frescos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s003 gratis (DOCX) sobre Table S2.
especies de m /z comunes detectados entre las 100 mejores compuestos en al menos 12 pacientes en el conjunto de descubrimiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s004 gratis (DOCX) sobre Table S3.
Asignación de especies moleculares de lípidos en el modo de iones negativos MS /MS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s005 gratis (DOCX) sobre Table S4.
algoritmo de biomarcadores para el cáncer de próstata, establecido mediante el juego de descubrimiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s006 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Agradecemos Koichi Tanaka, Taka-Aki Sato, y Noriko Iwamoto en busca de ayuda en la realización de los experimentos HR-MALDI-IMS y Miyuki Ono para su excelente asistencia técnica.