Extracto
La proteína quinasa CK2 es con frecuencia hasta reguladas en los cánceres humanos, aunque el mecanismo de activación de CK2 en el cáncer sigue siendo desconocido. En este estudio, hemos investigado el papel del gen sin intrones CK2α (
CSNK2A1P
, un pseudogen CK2α presunta) en la patogénesis de los cánceres humanos. Hemos encontrado pruebas de amplificación y sobreexpresión de la
CSNK2A1P
de genes en líneas no pequeñas de cáncer de pulmón de células y células de leucemia y el 25% de los tejidos de cáncer de pulmón estudiados. Los niveles de expresión de ARNm correlacionados con el número de copias del gen
CSNK2A1P
. También hemos identificado una nueva variante polimórfica (398T /C, I133T) del
CSNK2A1P
gen y mostró que el alelo 398T se amplifica selectivamente sobre el alelo 398C en 101 no pequeñas muestras de tejido de cáncer de pulmón de células en comparación con aquellos en 48 controles normales (
p = 0,013
& lt; 0,05). Se muestran por la expresión de la proteína CSNK2A1P primera vez en 293T transfectadas de riñón embrionario humano y el ratón fibroblastos embrionarios líneas de células NIH-3T3. Ambos alelos están transformando en estas líneas celulares, y el alelo 398T parece ser más transformadora que el alelo 398C. Por otra parte, el alelo 398T degrada proteína supresora de tumores PML manera más eficiente que el alelo 398C y le muestra relativamente más fuerte unión a la LMP. Desmontables de la
expresión génica CSNK2A1P
con siRNA se incrementó el nivel de proteína PML en células de cáncer de pulmón. Se presenta, por primera vez, que el
CSNK2A1P
gen funcional es un proto-oncogen en los cánceres humanos y su polimorfismo funcional parece degradar PML diferencialmente en las células cancerosas. Estos resultados son consistentes con un papel importante para el alelo 398T de la
CSNK2A1P Hoteles en la susceptibilidad al cáncer de pulmón humano
Visto:. Hung MS, Lin YC, Mao JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et al. (2010) El polimorfismo funcional del gen sin intrones CK2α juega un papel en el cáncer de pulmón oncogénicos. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10.1371 /journal.pone.0011418
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 17 de diciembre de 2009; Aceptado: 5 Junio 2010; Publicado: 2 Julio 2010
Derechos de Autor © 2010 Hung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos nacionales de la Salud (093708-01A3) y el Salón de Larry y Zygielbaum Memorial Trust, y el Kazan, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Lyons y la Fundación Farrise. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Algunos de los eventos somáticos implicados en el cáncer de pulmón han sido bien caracterizado, pero algunos de ellos siguen siendo desconocidos [2], [3]. CK2 proteína quinasa (anteriormente conocida como la caseína quinasa II) es una proteína serina /treonina quinasa que fosforila más de 300 proteínas [4]. Se degrada proteínas supresoras de tumores, tales como [5] PML y promueve la actividad y estabilidad de las proteínas oncogénicas tales como AKT [6]. Por ejemplo, CK2 promueve la degradación de PML y la actividad quinasa CK2 está inversamente correlacionada con los niveles de proteína de PML en el cáncer de pulmón humano [5]. Recientemente, la supervivencia de células de mieloma múltiple se demostró que depender de la alta actividad de la proteína quinasa CK2 [7]. CK2 también afecta a varias vías de señalización celular, incluyendo PI3K, NFkB, y vías de Wnt [8].
El nivel de expresión CK2α está estrechamente regulada en las células normales [9], y el aumento de nivel de CK2α y la actividad ha sido consistentemente observado en una variedad de cánceres humanos [10]. Por ejemplo, el alto nivel y /o la localización nuclear de CK2α es un marcador de mal pronóstico para los pacientes con leucemia mieloide aguda, cáncer de próstata, y cáncer de pulmón de células escamosas [10]. CK2α es la subunidad catalítica de la proteína quinasa CK2 y CK2α ha informado que ha de codificarse por el
CSNK2A1
gen en el cromosoma 20p13 [11]. El
CSNK2A1
gen puede servir como un oncogén y su expresión desregulada puede inducir tumores de mama y linfomas en ratones transgénicos [12], [13]. A pesar de que la actividad de la
CSNK2A1
gen se ha demostrado que estar elevada en los cánceres humanos, no hay evidencia genética o epigenética sólido disponible con respecto a la causa de la alta actividad de CK2α en las células del cáncer [10]. El gen sin intrones CK2α (también conocido como CK2α "pseudogene"),
CSNK2A1P
, se encuentra en el cromosoma 11p15.3 y su secuencia es altamente homóloga (identidad 99%) a la
CSNK2A1
cDNA secuencia [14]. Aunque el
CSNK2A1P
gen se expresa según los informes, en una línea celular de megacariocitos [15], su papel en el desarrollo de las células del cáncer sigue siendo desconocido. Por ello, investigó la amplificación y expresión de la
CSNK2A1P
gen en el cáncer de pulmón y líneas celulares de leucemia y tejidos de cáncer de pulmón.
Resultados
El exceso de expresión y amplificación de la
CSNK2A1P
gen en células de cáncer de pulmón y cáncer de los tejidos
nos hemos centrado en el
CSNK2A1P
gen debido a que inicialmente pareció que estaba mínimamente expresada en las células normales, pero se expresa predominantemente en varios tipos de líneas celulares de cáncer humano y tejidos tumorales, incluyendo la línea celular de leucemia de células T humanas Jurkat, que se conoce por su alta actividad CK2. Por semi-cuantitativos RT-PCR, se demostró que el
CSNK2A1P
gen también es sobreexpresado en tres líneas de NSCLC: H1299, H322 y A549, pero mínimamente expresados en las células normales y las dos líneas celulares de cáncer de pulmón H1650 y H460 (Fig. 1A). Por otra parte,
CSNK2A1P
mRNA se sobreexpresa en el tejido tumoral de pulmón de siete de cada 29 muestras (~ 25%) tumorales en comparación con tejidos de control emparejados (fig. 1B). Por otra parte, el análisis FISH en las mismas líneas celulares de cáncer humano proporcionó evidencia sólida de la amplificación de la
CSNK2A1P
gen localizado en el cromosoma 11p15.3 (Fig. 1D). Por ejemplo, cuatro copias de la
CSNK2A1P
gen se encontraron en la célula T línea celular de leucemia humana Jurkat, y tres copias en las líneas celulares de cáncer de pulmón H1299, A549 y H322. En contraste, los linfocitos normales y línea celular H460 tenían copias diploides de la
CSNK2A1P
gen (Fig. 1C y D). Es importante destacar que los niveles de expresión de ARNm correlacionados con el número de copias de la
CSNK2A1P
gen en estas líneas celulares de cáncer humano (n = 8; γ de Pearson = 0,9346;
p
= 0,0007) (Fig. 1 E ). Además, realizó semi-cuantitativos RT-PCR para evaluar la expresión del ARNm de la
CSNK2A1
genes con primers específicos. La sobreexpresión de la
CSNK2A1
gen se observó también en líneas celulares de cáncer de arriba (Fig. 1F), lo que sugiere que, además de la
CSNK2A1
gen, el
CSNK2A1P
gen también juega un papel importante en la patogénesis del cáncer de pulmón. La alineación de los cebadores utilizados para la semi-cuantitativos RT-PCR de la
CSNK2A1
y
genes CSNK2A1P
fueron mostrados en los datos adicionales (Fig. S1).
(A) semi-cuantitativos RT-PCR utilizando cebadores CSNK2A1P específicos muestra el nivel de expresión CSNK2A1P ARNm es consistente con el número de copias detectadas por FISH (3 para H1299, 4 de Jurkat, 3 para H322 y A549, 2 de WI-38 y CCL-211 ). (B) semi-cuantitativos RT-PCR utilizando cebadores específicos CSNK2A1P muestra el ARNm CSNK2A1P se sobreexpresa en siete (paciente 1 a 7) de los tumores 29 (~ 25%) de pulmón en comparación con el tejido normal adyacente emparejado. Paciente 8-14 representa muestras sin mRNA CSNK2A1P sobreexpresa. Otras 14 muestras con resultados similares no se muestran. (C) El
CSNK2A1P
gen se amplifica en la célula T línea celular de leucemia humana Jurkat, y en líneas celulares de cáncer de pulmón H1299, A549 y H322. (D) imágenes representativas de los resultados del estudio FISH en metafases de linfocitos normales, Jurkat, H322 y líneas de células A549. El
CSNK2A1P
gen fue marcado con Cy3 (en rojo). Cromosoma 11 sonda centímetro se marcó con FITC (en verde). (E) La correlación del número de copias y la expresión del ARNm de la
CSNK2A1P
gen se calculó el coeficiente de Pearson. (F) semi-cuantitativos RT-PCR utilizando cebadores específicos CSNK2A1 muestra el nivel de expresión de ARNm CSNK2A1 en líneas de células normales y cancerosas mencionadas anteriormente. Todos los semi-cuantitativos RT-PCR experimentos se repitieron tres veces con resultados similares.
amplificación alelo-específica de la
CSNK2A1P
gen en el cáncer de pulmón
Para determinar si existen mutaciones de
CSNK2A1P
en los cánceres de pulmón humano, la secuencia del marco de lectura abierto de la
CSNK2A1P
gen. Aunque no hemos encontrado ninguna mutación, descubrimos un nuevo polimorfismo dentro del dominio quinasa (398T /C, lo que lleva a los amino cambio I133T ácido, Fig. 2A) en 18 líneas celulares de cáncer (Tabla 1) y 101 muestras de tejido de cáncer de pulmón primario (Tabla 2). El cambio de aminoácidos específica se prevé que afectará a la función de la proteína cuando se usa el intolerante de tolerante método de clasificación (SIFT) [16]. Curiosamente, este polimorfismo parece estar distribuida de manera uniforme en el tejido normal, pero en los tumores, fue significativamente más frecuente en el alelo 398T (Figura 2C.) (Prueba de chi-cuadrado, p & lt; 0,05). Además, de los 56 tejidos de cáncer de pulmón heterocigotos examinados con respecto a este polimorfismo (Fig. 2D), 20 (35,7%) muestras mostraron amplificación en esta región, y en 18 (90%) de los 20 muestras, el alelo 398T fue selectivamente amplificado (Fig. 2E). Esta amplificación selectiva sugiere que el alelo 398T podría proporcionar una ventaja de crecimiento sobre el alelo 398C. A fin de validar los resultados de la secuenciación del ADN, se determinó la amplificación específica de alelo del alelo 398T de
CSNK2A1P gratis (que codifica la variante Ile133) en los tumores humanos utilizando un polimorfismo de nucleótido simple análisis cuantitativo (SNP), es decir, basado en TaqMan ensayo de discriminación alélica. Los datos de discriminación alélica es consistente con los datos de secuenciación (Fig. 2B). De las muestras de tumor de pulmón 101 mecanografiadas, 56 eran heterocigotos con respecto al polimorfismo 398C → T, y analizado estas 56 muestras para la amplificación específica de alelo de la 398C → T polimorfismo del
CSNK2A1P
por análisis TaqMan (Fig . 2B). Veinte muestras mostraron alélica desequilibrio entre los dos alelos, 2 muestras mostraron ganancia del alelo 398C (que codifica Thr133) y 18 muestras mostraron ganancia del alelo 398T (que codifica Ile133). Estos resultados muestran la amplificación específica de alelo estadísticamente significativa del alelo 398T (
P Hotel & lt; 0,05, prueba de chi-cuadrado), proporcionando evidencia adicional para el papel de este alelo en el cáncer de pulmón humano. Estos resultados nos llevó a investigar más profundamente en el papel de la variante
CSNK2A1P
formas en el desarrollo de tumores.
(A) de amplificación alelo-específica del alelo 398T (TTT /C o TT /C) se encuentra en algunos no pequeñas muestras de tejido de cáncer de pulmón de células. El T por encima de la punta de flecha (398T nucleótidos, I133,) a la derecha es la indicación del gen de tipo salvaje. (B) La amplificación de
CSNK2A1P
alelos en los tumores de pulmón fue validado por análisis cuantitativo específico alelo polimorfismo (SNP). La relación entre los alelos 398T y 398C en tumores de pulmón heterocigotos se determinó por análisis TaqMan utilizando sondas específicas de alelo y se expresa como diferencias en los niveles de TC (ciclos) con los valores de Ct positivos o negativos que indican la amplificación de la 398T o 398C alelo, respectivamente. De 56 muestras mecanografiadas, 2 mostraron amplificación del alelo 398C mayor que 0,6 CTs (muestras T3-4) y 18 mostraron la amplificación del alelo 398T (muestras T5-23). Treinta y seis muestras no mostraron amplificación (representado por T1-2). controles normales muestras no mostraron amplificación (N1-3). Se muestran los medios normalizados y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. (C, D y E) de amplificación alelo-específica del alelo 398T aumenta significativamente en no pequeñas muestras de tejido de cáncer de pulmón de células. Normal: adultos ADN genómico humano normal. Tumor: no-pequeñas tejidos de cáncer de pulmón de células. * Indica p & lt;. 0.05 (prueba de Chi-cuadrado)
Diferencial transformar la actividad de los dos
CSNK2A1P
alelos
Para probar la importancia funcional del polimorfismo 398T → C en el
CSNK2A1P
génica, se clonó el
CSNK2A1
y
CSNK2A1P
genes en pcDNA 3.1 /myc-His vectorial y llevó a cabo una serie de ensayos de crecimiento celular usando células NIH3T3. En este estudio, estos vectores se transfectaron transitoriamente en células 293T y NIH3T3 y se utilizó análisis de Western para confirmar la expresión de la proteína de ambos alelos del
CSNK2A1P
gen (Fig. 3A). Los resultados muestran, por primera vez, que la expresión de
CSNK2A1P
puede producir sus proteínas.
(A) El
CSNK2A1
y
CSNK2A1P
genes se transfectaron transitoriamente en células 293T y NIH3T3 utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de acuerdo con el protocolo del fabricante. 72 horas después de la transfección, las células se cosecha y se extrajeron las proteínas celulares totales. Se utilizó el análisis de transferencia de Western para confirmar la expresión de proteínas en ambos alelos del
CSNK2A1P
gen. etiqueta de anticuerpos anti-Myc se utilizó para detectar las proteínas de fusión etiqueta CSNK2A1P-Myc. ensayo de formación (B) Colonia. La transfección de
CSNK2A1P
de genes en células NIH3T3 resultados en el crecimiento dependiente de anclaje mejorado, en comparación con el control de vector vacío. Los números de colonias de células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 y son mucho más altos que los de las células NIH3T3-EV. (C) Ensayo de agar blando. transfección estable de
CSNK2A1P
genes en células NIH3T3 resultado en el crecimiento independiente de anclaje mejorada. Tanto las células NIH3T3-CSNK2A1 y NIH3T3-CSNK2A1P producidos significativamente más colonias que las células NIH3T3-EV hicieron (* p & lt; 0.05, t-test). De los dos alelos del
CSNK2A1P
gen, el alelo 398T formó más colonias que el alelo 398C hizo (** p & lt; 0.05, t-test). la formación de colonias relativa en ambas líneas celulares se expresa como porcentaje normalizado a grupo de control transfectadas con vector vacío-y muestra como bar ± desviación estándar en tres experimentos independientes. ensayo (D) de quinasa de la CSNK2A1 expresada y proteínas CSNK2A1P en las células NIH3T3. Las proteínas expresadas fueron inmuno-precipitaron con se llevó a cabo el ensayo de anticuerpos de etiquetas y quinasa anti-Myc. Tanto el NIH3T3-CSNK2A1 y células NIH3T3-CSNK2A1P tenían actividades significativamente más altas de la quinasa de las células NIH3T3-EV hicieron (* P & lt; 0.05, t-test). De los dos alelos del
CSNK2A1P
gen, las células 398T de los alelos tenían significativamente más alta actividad de la quinasa que el alelo 398C hizo (** p & lt; 0.05, t-test). actividad de la quinasa relativa se expresa como porcentaje normalizado a grupo de control transfectadas con vector vacío-y muestra como bar ± desviación estándar en tres experimentos independientes. EV: vector vacío. Wt: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T) guía empresas
En el ensayo de formación de colonias, la transfección de
CSNK2A1P
genes en NIH3T3 (NIH3T3-CSNK2A1P) células resultados en el anclaje mejorado. crecimiento dependiente, en comparación con el control de vector vacío (NIH3T3-EV). Además, hemos generado células NIH3T3 con CSNK2A1 (NIH3T3-CSNK2A1) como control positivo. Los números de colonias de células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 y eran mucho más altos que los de las células NIH3T3-EV (Fig. 3B). La transfección de la
CSNK2A1P
génica en células NIH3T3 también dio lugar a crecimiento independiente de anclaje mejorada. Cuando se compararon los resultados de agar blando ensayo de formación de colonia, se encontró que la transfección estable de
CSNK2A1P
genes en las células NIH3T3 se tradujo en un incremento del crecimiento independiente de anclaje (Figura 3C). Tanto el NIH3T3-CSNK2A1 y células NIH3T3-CSNK2A1P producen más colonias de las células NIH3T3-EV hicieron. En comparación con las células NIH3T3-EV, las células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 y producen colonias que fueron en su mayoría más grande y tenía formas repartidas-out. Cuando los dos alelos del
CSNK2A1P
genes se compararon, se encontró que el alelo 398T forma más colonias que el alelo 398C hizo. Un ensayo de quinasa de las proteínas expresadas también se llevó a cabo (Figura 3D). El producto del gen 398T tiene una actividad de quinasa más alto que el producto del gen 398C hace. Los resultados del ensayo de quinasa son consistentes con la formación de colonias en agar blando y datos.
polimorfismo funcional de los
CSNK2A1P
genes en la degradación de la proteína supresora de tumores PML
Para determinar el posible mecanismo por el que el alelo 398T se amplifica preferentemente en muestras de cáncer de pulmón, se estudiaron los efectos de los dos alelos de la
CSNK2A1P
gen de la proteína PML supresor de tumor. El
CSNK2A1P
genes se transfectaron de forma estable en líneas celulares NIH3T3 y NSCLC H1650. Western blot mostró un nivel de proteína PML reducida en las células transfectadas con los
CSNK2A1P
genes. El alelo CSNK2A1P 398T, similar a la de tipo salvaje CSNK2A1, disminución de los niveles de proteína de PML más que el alelo 398C hizo (Fig. 4A). En segundo lugar, a fin de determinar si la vida media de la LMP es diferencialmente regulada por los dos alelos. Estas dos líneas celulares transfectadas con el
CSNK2A1P
gen fueron tratadas con cicloheximida durante 0, 2 y 6 horas, y se examinaron los niveles de proteína PML endógenas. El alelo 398T disminuye la vida media de PML más eficazmente que el alelo 398C hizo (Fig. 4B). En tercer lugar, se utilizó co-inmunoprecipitación para mostrar la directa y preferencial de unión entre la proteína y la proteína PML 398T (Fig. 4C).
(A) La proteína PML disminuye en líneas celulares estables NIH3T3 y H1650 que se transfectaron por el
CSNK2A1
y
CSNK2A1P
genes. También se muestran la proteína CSNK2A1 endógeno y proteínas CSNK2A1 y CSNK2A1P sobreexpresados. (B) La degradación de la proteína PML es más prominente en líneas celulares estables NIH3T3 transfectadas con CSNK2A1 y CSNK2A1P (I133). H: horas después del tratamiento con cicloheximida. Las células 293T (C) fueron co-transfectadas con PML-V5 y CSNK2A1 o CSNK2A1P construcciones Myc-etiquetados. CSNK2A1 y CSNK2A1P (I133) muestran una unión más fuerte a la proteína PML en ensayos de inmunoprecipitación recíprocos. EV: vector vacío. Wt: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (D) La expresión de la
CSNK2A1P
gen disminuye en la línea celular de cáncer de pulmón H1299 después de la transfección con el
CSNK2A1P
gen siRNA. No hay disminución en la expresión de la
CSNK2A1
y
CSNK2B
se observaron los genes. (E) Los CK2α nivel de proteínas y disminuye el nivel de proteína PML aumentos en la línea celular de cáncer de pulmón H1299 después de la transfección con el
CSNK2A1P
gen siRNA. N: control negativo siRNA. CSNK2A1P:
CSNK2A1P
siRNA. Las densidades de la banda se normalizan para el grupo transfectadas siRNA negativa usando actina como control interno. Todos los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares.
Para seguir haciendo frente a la cuestión de si el ARNm CSNK2A1P está completamente traducido y degrada la LMP en las células cancerosas, derribaron el
CSNK2A1P
de genes en líneas celulares de cáncer de pulmón H1299 con siRNA específicos para el
CSNK2A1P
gen. Elegimos la línea celular de cáncer de pulmón H1299 porque nuestro estudio (Figura 1 A y C) mostró que el
CSNK2A1P
gen se amplifica y se sobreexpresa en esta línea celular. El
CSNK2A1P
gen siRNA se produjo un descenso superior al 70% en la expresión de la
CSNK2A1P
gen y ninguna disminución en la expresión de la
CSNK2A1
y
CSNK2B
genes (Fig. 4D). De acuerdo con la disminución de la expresión de la
CSNK2A1P
gen, la proteína total CK2α disminuido y la proteína PML aumentó en las células tratadas con
CSNK2A1P
siRNAs comparación con los controles negativos siRNA transfectadas (Fig. 4E) .
Discusión
en este estudio, hemos proporcionado, hasta donde sabemos, la primera evidencia para mostrar que el
CSNK2A1P
gen funcional es un proto-oncogen en los cánceres humanos . Para apoyar nuestra hipótesis de que
CSNK2A1P
gen es un proto-oncogen funcional, en lugar de un "pseudogen", hemos realizado una amplia ADN, ARNm, proteínas y análisis de siRNA. Los resultados de este análisis proporcionan la primera evidencia de que el nivel de expresión de ARNm se correlaciona con el número de copias del
CSNK2A1P
gen en varias líneas celulares de cáncer humano. Por otra parte, siRNA derribo de la
CSNK2A1P
gen disminución del nivel total de proteínas CK2α en las células cancerosas, lo que indica que el
CSNK2A1P
gen se traduce íntegramente en las células cancerosas. Por lo tanto, la amplificación del gen
CSNK2A1P
puede jugar un papel oncogénico en estas líneas celulares de cáncer humano. Sobre la base de nuestros resultados, proponemos que pueden existir dos genes funcionales en la familia CK2α humano,
CSNK2A1
, que se localiza en el cromosoma 20p13, y
CSNK2A1P
, que se localiza en el cromosoma 11p15.3.
también encontramos un nuevo polimorfismo dentro del dominio quinasa (398T /C, lo que lleva a los amino ácidos I133T cambio, la figura 2a) en 101 tumores primarios. Este polimorfismo parece estar distribuido de manera uniforme en el tejido normal, pero en los tumores, es significativamente más frecuente en el alelo 398T (Tabla 2, Figura 2). El alelo 398T se amplificó selectivamente en dieciocho de los 101 tejidos de cáncer de pulmón, lo que sugiere que podría proporcionar una ventaja de crecimiento sobre el alelo 398C. La amplificación alelo 398C sólo se encontró en dos de los 101 tejidos de cáncer de pulmón, lo que sugiere que podría ser un evento aleatorio. Estos resultados genéticos intrigantes nos llevó a investigar más profundamente en el papel de la variante
CSNK2A1P
formas en el desarrollo de tumores. Si lo hace, cedido dos hallazgos importantes, en primer lugar, que el alelo 398T es más transformadora que el alelo 398C, y en segundo lugar, que el alelo 398T degrada la proteína PML supresor de tumores de manera más eficiente que el alelo 398C. Por ejemplo, el alelo 398T mostró actividad transformadora significativamente mayor tanto en la formación de colonias y los ensayos de agar blando que el alelo 398C (Fig. 3B y C). Los datos del ensayo de quinasa mostró que el producto del gen 398T tiene actividad quinasa más alto que el producto del gen 398C (Fig. 3D), lo que sugiere que el alelo 398T es un alelo más la transformación de que el alelo 398C. Además, estos datos también sugieren que la capacidad de transformación del alelo 398T de la
CSNK2A1P
pseudogen es similar a la de la normal de
CSNK2A1
producto del gen, por lo que el alelo más activa del pseudogene parece tener una actividad comparable a la normal
CSNK2A1
gen. Hasta la fecha, no hay evidencia genética o epigenética de la activación del gen CSNK2A1 en el cáncer humano. Así, nuestro estudio proporciona la primera evidencia de que el
CSNK2A1P
398T alelo, que es similar a la
CSNK2A1
gen, se amplifica en los tejidos de cáncer de pulmón humano.
El gen PML translocación en la leucemia promielocítica aguda [17] y fue demostrado ser un gen supresor de tumor [18]; fue originalmente identificado en el punto de ruptura de t (17 15). La pérdida de PML se ha correlacionado con un mal resultado clínico en una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón, el apoyo a su función supresora de tumores [5], [19]. PML promueve la desfosforilación de pRb y regula el destino celular en el neocórtex en desarrollo [20]. CK2 regula la degradación mediada por ubiquitina de LMP en líneas celulares de cáncer de pulmón humano [5], [21]. Esta puede ser una de los posibles mecanismos por los que el alelo 398T se amplifica preferentemente en muestras de cáncer de pulmón. Este polimorfismo genético es probablemente un marcador útil para detectar la amplificación del gen sin intrones CK2, porque la amplificación monoallelic se cree que es responsable de la amplificación de genes en el cáncer [22]. Esta amplificación específica de alelo también implica que las células cancerosas pueden ser adictos a la oncogénico CK2α [23]. En resumen, la amplificación del alelo 398T de la
CSNK2A1P
gen puede contribuir, al menos en parte, a la patogénesis del cáncer de pulmón.
El
CSNK2A1P
gen es un pseudogen procesado encuentra en el cromosoma 11p15.3 y se supone que está formado por retrotransposition, y se caracteriza por la ausencia de intrones, la presencia de flanqueo dirige repeticiones, y el 3 'de poliadenilación de la cola [15]. Sin embargo, tiene un fuerte promotor aguas arriba del codón de iniciación (14, 15). La expresión del gen
CSNK2A1P
es potencialmente más estrechamente regulado que el
CSNK2A1
es. Por ejemplo, la región promotora del gen
CSNK2A1P
contiene dos cajas TATA y una caja CAAT, mientras que la secuencia aguas arriba de
CSNK2A1
muestra características de limpieza de genes, por ejemplo, alto contenido de GC, la presencia de varias cajas GC y la caja TATA falta (14, 15). Por otra parte, varios sitios de unión del factor de transcripción importante (por ejemplo, CEBP-, Gata-, y sitios de unión a Smad) se prevé dentro de la región 5 '(1 Kb) del codón de
CSNK2A1P
de partida, lo que sugiere que la
CSNK2A1P
gen puede ser potencialmente inducidos o reprimidos por varios reguladores maestros de las vías de desarrollo. La amplificación de la
CSNK2A1P
gen podría dar como resultado la sobreexpresión de la proteína CSNK2A1P en células de cáncer. También puede ser posible que el
CSNK2A1
gen es de alguna manera indirectamente regulada por la expresión de la
CSNK2A1P
gen. Se necesitan más estudios para descubrir el mecanismo a través del cual se regulan los
CSNK2A1P
y el
CSNK2A1
genes. Hasta ahora, alrededor de 10.000 pseudogenes procesados [24] se han caracterizado en el genoma humano, y algunos de estos genes se ha informado que se expresa en las células cancerosas. Por ejemplo, la oncogénica
CRIPTO3
pseudogen se expresa en el colon, de mama y de pulmón [25], el homólogo humano del virus de la vacuna H1 fosfatasa clon del gen 5 (
HVH-5
) es pseudogen expresa en líneas celulares de cáncer de mama [26], y el
Rac1
pseudogen se expresa en los tumores cerebrales [27]. Tomados en conjunto con nuestros resultados, esto sugiere un posible papel oncogénico de los presuntos pseudogenes en algunos cánceres humanos.
Este estudio tiene algunas limitaciones. Hemos demostrado la correlación entre los
CSNK2A1P
de genes y la estabilidad de la proteína PML en sólo dos líneas celulares de cáncer de pulmón in vitro. Se analizaron muestras de sólo 101 pacientes con cáncer de pulmón, 56 de los cuales eran heterocigotos con respecto a este polimorfismo y se podrían utilizar para el análisis. En futuros estudios, será importante incluir líneas celulares de cáncer adicionales y más tejidos de cáncer.
Nuestros resultados proporcionan evidencias genéticas para la activación del gen CK2α intrones en el cáncer humano. Aunque CK2 se conocía anteriormente a ser un jugador clave en el cáncer, su mecanismo de activación en el cáncer no se conoce [10], [28]. Debido a esta falta de conocimiento sobre el mecanismo de activación CK2 y su actividad constitutiva, CK2 se ha descuidado en su mayoría como un objetivo clave para fármacos contra el cáncer. Desde entonces se ha hecho un progreso significativo en las bases estructurales de la inhibición CK2, ahora es posible desarrollar inhibidores CK2 permeables a las células potentes y selectivos [29], [30]. La comprensión de la diferencia en las secuencias de los
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polimorfismos de genes puede permitirá diseñar pruebas diagnósticas específicas para el cáncer humano. Es importante destacar que nuestros resultados apoyan la idea de que la proteína quinasa CK2α es una diana atractiva para la terapéutica del cáncer, como los inhibidores de molécula pequeña [10], [31].
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
El cáncer humano (Jakurt, H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, Hela y H1650) y pulmonar normal (WI-38 y CCL-211 líneas celulares) se obtuvieron de la American Type Culture Collections (Manassas, VA). H290 y las líneas celulares MS-1 se obtuvieron de NIH (Frederick, MD). Las células se cultivaron en medio de crecimiento completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco para HeLa, A549 y CCL-211; de Eagle medio esencial mínimo de WI-38; medio de Roswell Park Memorial Institute para H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 y H1650) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 unidades /ml de penicilina y 10 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% CO2.
las muestras de tejido
tejidos tumorales frescos y tejidos normales adyacentes fueron obtenidas de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSLC) que fueron sometidos a resección quirúrgica del tumor primario. El estudio fue aprobado por la Universidad de California, San Francisco, junta de revisión institucional (CHR#H8714-11647-14). Se obtuvo consentimiento informado escrito de todos los participantes involucrados en nuestro estudio. Las muestras de tejido se mantuvieron a -180 ° C congelador de nitrógeno líquido antes de su uso, y el diagnóstico patológico definitivo se confirmó por un patólogo de la Universidad de California, San Francisco (UCSF), EE.UU.. sangre periférica forma de ADN genómico adulto normal se adquirió de BioChain (Hayward, CA).
De fluorescencia de hibridación in situ
La sonda de fluorescencia de hibridación in situ (FISH) para CSNK2A1P (RP11-567I13 , 11p15.3 cromosoma) se adquirió de BACPAC Recursos (Oakland, CA). El centrómero del cromosoma 11 se marcó mediante Vysis CEP 11 sonda SpectrumGreen ™ (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). metafase diapositivas se prepararon utilizando protocolos estándar de la instalación de la UCSF Patología Molecular Core. Todas las hibridaciones fueron realizadas por la instalación de la UCSF Patología Molecular Core. La sonda CSNK2A1P BAC fue marcado con Cy3 roja por traslado de cortes. mezcla de la sonda se preparó de acuerdo con el protocolo estándar
ADN y la secuencia de ADNc de análisis
ADN genómico o ARN total fue aislado de las líneas celulares y muestras de tejidos utilizando el DNeasy Blood & amp.; Kit de tejidos o el Kit RNeasy Mini (Qiagen Valencia, CA), respectivamente. El gen CSNK2A1P fue amplificado mediante PCR sus cebadores específicos de genes. Los cebadores directo e inverso utilizados para la PCR y la secuenciación fueron: 5'-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 'y 5'-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3', respectivamente. Los productos de PCR se purificaron en gel usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen Valencia, CA) y se secuenciaron posteriormente en MCLab (South San Francisco, CA).
Semi-cuantitativa con transcripción inversa-PCR (RT-PCR ) análisis
ARN total de líneas de células y tejidos se aisló utilizando un kit de extracción, y el ADN se eliminó mediante tratamiento en columna con DNasa (RNeasy Mini kit; Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Semicuantitativo RT-PCR se realizó mediante el uso de superíndice en un solo paso RT-PCR con el kit Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un paso RT-PCR se realizó utilizando pares de cebadores específicos CSNK2A1P-(adelante: 5'-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 'y revertir: 5'-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3'), imprimaciones-CSNK2A1 específica (adelante: 5'-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 'y retroceso: 5'-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3') y cebadores específicos CSNK2B (adelante: 5'-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 'y retroceso: 5'-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3'). Los productos de PCR fueron verificados por secuenciación directa del ADN. Gliceraldehído-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) se utilizó como control interno.