Extracto
receptor de andrógenos (AR) está involucrado en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata. Sin embargo, los mecanismos por los cuales esto ocurre aún no se entienden. En informes anteriores, ovoalbúmina de pollo factor de aguas arriba promotor de transcripción II (COUP-TF II) se ha sugerido que desempeñar un papel en el desarrollo de cánceres. En el presente estudio, hemos explorado un papel putativo de COUP-TF II en cánceres de próstata mediante la investigación de su efecto sobre la proliferación celular y la diafonía entre COUP-TF II y AR. La sobreexpresión de II da como resultado la inhibición de la proliferación dependiente de andrógenos de las células de cáncer de próstata COUP-TF. Otros estudios muestran que COUP-TF II funciona como un corepressor de AR. Reprime transactivación AR en los promotores diana que contiene el elemento de respuesta a andrógenos (ARE) de una manera dependiente de la dosis. Además, COUP-TF II interacciona físicamente con AR
in vitro
y
in vivo.
Se une tanto el dominio de unión a ADN (DBD) y el dominio de unión al ligando (LBD) de AR e interrumpe la interacción de terminales N /C de AR. Por otra parte, GOLPE-TF II compite con coactivadores como ARA70, SRC-1, y GRIP1 para modular la transactivación de AR, así como la inhibición de la captación de AR a su promotor diana ARE-que contiene. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que GOLPE-TF II es una novela corepressor de AR, y proporcionan una penetración en el papel de COUP-TF II en cánceres de próstata
Visto:. Canción CH, Lee HJ, Parque E , Lee K (2012) el pollo ovoalbúmina aguas arriba del promotor-factor de transcripción II regula negativamente la transactivación del receptor de andrógenos en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (11): e49026. doi: 10.1371 /journal.pone.0049026
Editor: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 11 Junio, 2012; Aceptado: 3 de octubre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa básico de Investigación de la Ciencia a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2012 hasta 0085). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
lo normal crecimiento, la diferenciación y la función de la glándula de la próstata están regulados en gran medida por los andrógenos, que actúan a través del receptor de andrógenos (AR) [1], [2]. La inhibición de la actividad de AR por cualquier medio, incluyendo la castración y el tratamiento anti-andrógeno, puede impedir o suprimir todas las fases de desarrollo de próstata [3]. función de AR puede ser modulada por vías intracelulares de señalización, factores de transcripción, proteínas del ciclo celular, y otros factores, que modifican la actividad transcripcional AR o proporcionar medios para la diafonía entre andrógenos y otras señales [4]. Los andrógenos y AR también juegan un papel integral en el crecimiento de tumores de próstata [5], [6]. La progresión del cáncer de próstata se produce a través de la alternancia del eje normal de andrógenos por la desregulación de la actividad de AR a través de cascadas de transducción de señales, alteraciones en la expresión AR coregulator, y las mutaciones en AR [7].
AR, un ligando factor de transcripción dependiente, regula la expresión de genes diana cuando se activa por los andrógenos [1]. AR consiste en tres dominios funcionales distintos: el dominio N-terminal de activación, el dominio de unión a ADN-medio, y el dominio de unión a ligando C-terminal [8]. El N-terminal se ha demostrado que interactúan directamente con el C-terminal de una manera dependiente de ligando, que se requiere para el potencial transcripcional completa de AR [9]. Antes de andrógenos exposición, AR se une a un complejo chaperona multi-proteína en su estado inactivo. Andrógenos unión induce un cambio conformacional en la AR que se traduce en la disociación del complejo chaperona, la dimerización, y la translocación en el núcleo, la unión de ese modo a AREs en las regiones reguladoras de genes diana [9] - [11]. actividad transcripcional AR es modulada por proteínas correguladoras. El homodímero unido AR-ARE recluta coactivadores, como p160 y p300 /CBP, que las interacciones de puentes con la maquinaria general de transcripción y modificar las histonas, efectuando así la activación de la expresión de genes [12] - [16]. Por el contrario, corepressors pueden reclutar la histona deacetilasa (HDAC) para el complejo de AR, manteniendo de ese modo la estructura de la cromatina [17], [18]. También pueden inhibir la interacción funcional de los factores de transcripción generales con el promotor [16].
Los ovoalbúmina de pollo aguas arriba factores de transcripción-promotor (GOLPE-TFS) son miembros huérfanos de la superfamilia de receptores nucleares que activan o reprimen gen la transcripción mediante la unión directamente secuencia de ADN [19]. Hay tres miembros de la familia COUP-TF humano: COUP-TF I (NR2F1), COUP-TF II (NR2F2), y la proteína relacionada con el ErbA 2 (NR2F6) [20]. COUP-TF I y II proteínas COUP-TF son 95% homólogas y evolutivamente conservados en el dominio de unión a ADN, así como el dominio de unión a ligando, que difieren principalmente en el extremo N-terminal (revisado en [19]). COUP-TF I está más altamente expresado en los tejidos neuronales de los sistemas nerviosos central y periférico, mientras que el golpe-TF II está más altamente expresado en el desarrollo de órganos como el pulmón, riñón, páncreas y próstata [20], [21]. proteína relacionada con ErbA 2 es menos conservadas y se sabe poco sobre su expresión y la función [22].
COUP-TF interactúa con otros receptores nucleares, incluyendo receptores de estrógenos (ER), el receptor de retinoide X (RXR) , receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR), y el receptor de la vitamina D (VDR) [23] - [27]. En general, COUP-TF inhibe la actividad transcripcional de otros receptores nucleares al competir por sus sitios de unión de ADN o por heterodimerización con el receptor nuclear socio heterodímero receptor retinoide X clase II, impidiendo de este modo la expresión del gen [28]. Además, como receptor de la hormona tiroidea y del receptor de ácido retinoico, sin ligando unido a ADN COUP-TF I reprime la expresión génica por un dominio de silenciamiento activo dentro del dominio de unión a ligando que recluta corepressors (es decir, NCoR y SMRT), un proceso llamado represión activa [29]. Finalmente, COUP-TF también puede reprimir la transcripción mediante la unión directa al dominio de unión a ligando de receptores de hormonas nucleares (transrepresión; [30], [31]). En informes anteriores, COUP-TF se relaciona con el desarrollo de diversas cáncer, incluyendo el cáncer de mama [24], [32] - [34], cáncer de pulmón, y la progresión del cáncer adrenal [35] - [37].
en el presente estudio, hemos demostrado que COUP-TF II reprime la transactivación de AR en células de cáncer de próstata, lo que resulta en la inhibición del crecimiento celular dependiente de andrógenos. COUP-TF II se une directamente AR, la prevención de la interacción del terminal N /C de la AR. Además, COUP-TF II inhibe el reclutamiento inducida por ligando de AR con el promotor de PSA y compite con coactivadores AR para modular la transactivación AR. En conjunto, nuestros resultados sugieren COUP-TF II como un corepressor AR potente y proporcionan una penetración en el papel de COUP-TF II en cánceres de próstata.
Materiales y Métodos
Reactivos
Los anticuerpos para AR (sc-815), PSA (sc-7638), HA (sc-7392), GFP (sc-9996), y α-tubulina (sc-5286) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc . y el anticuerpo para la AR (PG-21, 06 a 680) se obtuvo a partir de EMD Millipore Corporation. Anticuerpo para COUP-TF II (PP-H7147-00), que no reconoce COUP-TF I [19], se adquirió de Perseo Proteómica Inc. radiomarcados timidina ([metil-
3H] -timidina, actividad específica 80 Ci /mmol) se obtuvo de Perkin Elmer Life Science. Un Trichostation se adquirió de Sigma-Aldrich Co., y butilato de sodio y nicotinamida (NIC) se adquirieron de Calbiochem.
Los plásmidos y construcción
Los plásmidos de expresión de mamíferos AR ratón (pcDNA3-AR ), pcDNA3-ARA70, pcDNA3-p300, pSG5HA GRIP1, y pCR3.1 SRC-1, y MMTV-Luc y PSA-Luc plásmidos indicadores se han descrito anteriormente [38]. El pPBARE × 7-tk-Luc se construyó insertando los ocho copias de elemento de respuesta del receptor de andrógenos (ARE) del gen de probasina ratón (PB). Etiquetada con HA ratón COUP-TF II se construyó mediante la inserción de
Msl
I /
Xho
fragmento digerido pCR3.1-I de ratón COUP-TF II en
Eco
RV /
Xho
digerido con HA epítopo de etiquetado vector pcDNA3 (pcDNA3HA). GFP-COUP-TF II y II de longitud completa GST-COUP-TF se subclonaron mediante la inserción de
Eco RI
/
Xho
fragmento digerido con pcDNA3HA desde el golpe de estado TF-II en
Xma
digerido con vector pEGFP-C1 y
Eco RI
/
Xho
digerido con pGEX4T-1 vector, respectivamente. GST-golpe-TF II de longitud completa y mutantes de deleción, AF1, DBD + bisagra (DBDH), y ΔAF1 regiones, se construyeron mediante la auto-ligación de
Sma
I /
I- Xho
,
Sph
I /
I- Xho
, y
Eco RI
/
Sma
I-digerido fragmento de GST-COUP-TF II de longitud completa , respectivamente. Los plásmidos de expresión de mamíferos VP-AR1-660 y GAL-AR624-919 y el reportero construir 5xGAL4-Luc3 (originalmente del Dr. Donald McDonnell) fueron amablemente proporcionados por el doctor como regalos Elizabeth M. Wilson (Universidad de Carolina del Norte) [39 ].
Preparación de adenovirus recombinante
Para la expresión ectópica del ratón COUP-TF II, se utilizó un sistema de administración de adenovirus [40]. Brevemente, el ADNc COUP-TF II se clonó en pAdTrack-CMV vector lanzadera. La recombinación homóloga se realizó mediante la transformación de células competentes BJ5138 con Adeasy-pAdTrack-CMV-COUP-TF II, junto con vector adenoviral portador del gen. Se seleccionaron los virus recombinantes, se amplifica en las células HEK 293 y se purificaron por centrifugación de densidad de cloruro de cesio. Los títulos virales se midieron usando Adeno-X título rápido (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante.
Cultivo de células y transfección transitoria Ensayo
COS-7 y PPC-1 Las células se mantuvieron en Dulbecco medio esencial mínimo (DMEM) (Life Technologies, Inc.) suplementado con 10% de FBS y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. células LNCaP (American Type Culture Collection) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Life Technologies Inc.) suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina, y 2 mM L-glutamina.
Vigésima cuatro horas antes de la transfección, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con la cantidad indicada de plásmidos de expresión, un constructo indicador y el plásmido pCMVß expresión de lacZ de control utilizando el SuperFect (Qiagen) o el reactivo de transfección Lipo2000 (Invitrogen). Las cantidades totales de los vectores de expresión se mantuvieron constantes mediante la adición de cantidades apropiadas de los vector empobrecido. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene 10% de suero tratado con carbón vegetal y, o bien DHT o vehículo. Las células se recogieron 24 h después de la adición de la hormona, y las actividades de luciferasa y ß-galactosidasa se ensayaron como se describe anteriormente [41]. Los niveles de actividad de la luciferasa se normalizaron a la expresión de lacZ.
RT-PCR y QRT-PCR
ARN total fue extraído de la próstata con solución de reactivo Tri (Molecular Research Center, Inc.) . Para RT-PCR, 1 g de ARN total fue transcrito de forma inversa y amplificado por PCR con cebadores COUP-TF II-específicos, que amplifican un fragmento de 650 pb que abarca ORF. El análisis cuantitativo de la expresión del gen PSA en células LNCaP infectadas con AdGFP o AdCOUP-TF II se evaluó mediante qRT-PCR con cebadores PSA específica, que amplifican una región de 517 pb que abarca el ORF, utilizando un kit SYBR Green PCR y un Rotor-Gene RG3000 sistema de PCR en tiempo real (Corbett Research). Como control interno, las reacciones de PCR se realizaron usando cebadores de β-actina específica, que amplifican una región 362 pb que abarca el exón 4. El oligonucleótido secuencias fueron los siguientes: hacia adelante 5'-AAGCTGTACAGAGAGGCAGGA-3 'y 5'-revertir AGAGCTTTCCGAACCGTGTT- 3 'para COUP-TF II; adelante 5'-GGCCAGGTATTTCAGGTCAG-3 'y revertir 5'-CCACGATGGTGTCCTTGATC-3' para PSA; y hacia adelante 5'GAGACCTTCAACACCCCAGCC 3 'y revertir 5'CCGTCAGGCAGCTCATAGCTC -3' de β-actina.
GST pull-down de ensayo
GST, dominio mutantes GST-AR, y GST -COUP-TF mutantes de deleción II se expresaron en
E. coli
células BL21 y aisladas con perlas de glutatión-Sepharose-4B (Pharmacia, Biotech AB). proteínas de fusión GST inmovilizados fueron incubadas con [
35S] metionina marcada con COUP-TF II o las proteínas de AR producidos por
in vitro
traducción usando el sistema de transcripción-traducción acoplado a TNT (Promega). Las reacciones de unión se llevaron a cabo en 250 l de GST-tampón de unión (20 mM Tris-HCl a pH 7,9, NaCl 250 mM, glicerol al 10%, NP-40, mM MgCl 5 mM de EDTA 0,05%
2, 0,5, DTT 1 mM, y 1,5% de BSA) durante la noche a 4 ° C. Las perlas se lavaron cinco veces con 1 ml de tampón de unión GST-. Las proteínas unidas se eluyeron mediante la adición de 20 l de tampón de muestra de SDS-PAGE, y se analizaron por SDS-PAGE y autorradiografía [41].
Para determinar interferir con la interacción que se produce entre DBD y LBD de AR por un golpe TF-II, se realizó ensayo de competición GST pull-down. LBD proteínas GST-AR inmovilizados se incubaron con [
35S] metionina proteínas AR AF1DBDh marcado producidos por
in vitro
traducción. Para el análisis de la competencia, 2, 5 y 10 veces el exceso de
in vitro proteínas II se añadió junto con las proteínas marcadas radiactivamente AR AF1DBDh.
Traducida COUP-TF
coimmunoprecipitation y Análisis de transferencia Western
En vivo
coimmunoprecipitation ensayo se realizó con células PPC-1 transfectadas con 5 g de AR y 5 g de GFP-COUP-TF II plásmidos de expresión. Las células transfectadas fueron tratadas con 10 nM de DHT o vehículo para 4 h después de la transfección y se recogieron con tampón RIPA lisis celular (50 mM Tris-HCl a pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 1 g /ml de aprotinina, 0,1 g /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina, PMSF 0,1 mM). lisado de células enteras (800 mg) se incubó con 20 l de proteína A /G más suspensión de perlas de agarosa (Santacruz) para excluir la unión no específica y luego se centrifugó. El sobrenadante se dividió en dos porciones iguales. Una parte se incubó con 2 g de anticuerpo anti-AR (sc-815) y el otro se incubó con 2 mg de anticuerpo anti-GFP (sc-9996) durante la noche a 4 ° C. Cada porción se incubó adicionalmente durante otras 4 h después de la adición de 20 l de proteína A /G más suspensión de perlas de agarosa (Santacruz). perlas de agarosa se lavaron cuatro veces cada uno con tampón RIPA a 4 ° C, y las proteínas unidas se separaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas en los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Protran transferencia (Schleicher y Schuell Bioscience), y se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-AR (sc-815) y anticuerpos anti-GFP (sc-9996). Las señales se detectan a continuación con un kit ECL (Amersham Pharmacia).
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayo
células LNCaP cultivadas en RPMI 1640 que contiene 10% de suero tratado con carbón vegetal estaban infectados, ya sea con AdCOUP -TF II o AdGFP, y las células se trataron con 10 nM de DHT o vehículo durante 6 h. Las células fueron de reticulado con 1% de formaldehído, y se procesa para chip de ensayo como se describe anteriormente [42]. Se utilizó anticuerpo anti-AR (PG-21) para la inmunoprecipitación. ADN y se inmunoprecipitaron de entrada-esquilada de ADN se sometieron a PCR utilizando un par de cebadores específicos (adelante: 5'-CATGTTCACATTAGTACACCTTGCC-3 'y revertir: 5'-TCTCAGATCCAGGC TTGCTTACTGTC-3'), que amplifica una región 315 pb que abarca el sitio de unión de AR de la región de promotor de PSA [43]. Como control negativo, las reacciones de PCR se realizaron usando un par de cebadores de actina (adelante: 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3 'y revertir: 5'-CCGTCAGGCA GCTCATAGCTC-3'), que amplifica una región de 362 pb que abarca el exón 4 de la β- gen de la actina.
inmunofluorescencia
El día antes de la transfección, PPC-1 se sembró en cubreobjetos recubiertos de gelatina. RFP-etiquetados AR y GFP-etiquetados COUP-TF II se transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo SuperFect (Qiagen). Después de 4 h, se añadió medio fresco a las células. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se alimentaron con medio fresco con 10 nM DHT o vehículo y se incubaron durante otras 4 h. Las células fueron lavadas tres veces con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 10 min. Las células fijadas se montaron en portaobjetos de vidrio y se observaron al microscopio confocal de barrido láser (LSM 5 PASCAL láser Microscopio de Barrido, Zeiss).
Incorporación de timidina
células LNCaP fueron cultivadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células por pocillo y se infectaron con cualquiera AdCOUP-TF II o AdGFP en 10% de medio de suero suministrado con carbón vegetal. Después de estar durante la noche, las células fueron tratadas con 10 nM de DHT durante 24 h y luego pulso marcado con [
3H] -timidina (10 Ci /ml, actividad específica 80 Ci /mmol, PerkinElmer Life Sciences, Norwalk, CT) para 4 h. Las células se recogieron sobre un filtro de microfibra de vidrio (Whatman, Inc., Florham Park, NJ) y se lavó intensamente con agua destilada. La incorporación de timidina en el ADN se mide contando los filtros con un contador de centelleo.
Soft Agar formación de colonias
células LNCaP fueron infectadas con cualquiera AdCOUP-TF II o AdGFP en 10% tratado con carbón vegetal suero suministrado por medio. Después de 24 h de infección, las células se tripsinizaron y se sembraron a 5 x 10
3 células en 0,35% de agar más de 0,7% capa de agar en placas de cultivo de seis pocillos. Fresh completa medio de crecimiento o medio con suero tratado con carbón vegetal contiene ausencia o presencia de 1 nM DHT se cambió cada 2 días durante 2 semanas. Se puntuaron las colonias más grandes que el diámetro de 300 mm.
Análisis estadístico
Un análisis estadístico se realizó mediante el uso de la prueba t de Student con el sistema de software PRISM para Windows. En todos los casos los valores de probabilidad (P) por debajo de 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
COUP-TF II La sobreexpresión reprime la proliferación de las células del cáncer de próstata
COUP-TF II es altamente expresado en los compartimentos mesenquimales de los órganos en desarrollo, incluyendo la próstata [20], [21]. Además, COUP-TF II se ha sugerido que desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer [24], [32], [33], [35] - [37]. Por lo tanto, inicialmente determinó la expresión de COUP-TFS en líneas celulares de cáncer de próstata y también un papel en la proliferación de células de cáncer de próstata. COUP-TF II fue altamente expresado en una línea celular de próstata normal, RWPE1, pero su expresión era apenas detectable o muy baja en las líneas celulares de cáncer de próstata, tanto dependiente de andrógenos y independiente de andrógenos (Figura 1A).
(a) COUP-TF II expresión en líneas celulares de cáncer de próstata humano. los niveles de expresión de proteínas de COUP-TF II se determinaron mediante análisis de transferencia Western de proteínas totales utilizando anticuerpos anti-alfa-tubulina contra el golpe TF-II, anti-AR (sc-815), y. los niveles de expresión de ARNm de COUP-TF II se determinaron por RT-PCR de ARN totales. La expresión de la tubulina y β-actina se utilizó como control interno. (B) COUP-TF II inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata. ensayo de formación de colonias en agar suave se llevó a cabo con medio completo de crecimiento (panel izquierdo) o con medio que contenía suero tratado con carbón vegetal y se complementó con o sin 1 nM DHT (panel derecho). células LNCaP fueron infectadas con AdGFP o AdCOUP-TF II durante 24 h, y se procesaron para el ensayo de formación de colonias tal como se indica en "Materiales y Métodos". se puntuaron las colonias más grandes que el diámetro de 300 mm. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (C) COUP-TF II disminuye la tasa de síntesis de ADN en células de cáncer de próstata. células LNCaP fueron infectadas con AdGFP o AdCOUP-TF II en medio que contenía suero tratado con carbón vegetal y se suplementaron con o sin 1 nM DHT. entonces su tasa de síntesis de ADN fue analizado por [
3H] timidina incorporación de ensayo. Al menos tres experimentos independientes se combinaron y los valores representan la media ± SEM. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt;. 0.001
Debido a COUP-TF II se expresó en un nivel muy bajo en líneas celulares de cáncer de próstata, que postula que COUP-TF II podría inhibir la proliferación de células de cáncer de próstata. Para probar esta hipótesis, se infectaron células LNCaP dependientes de andrógenos con AdGFP o AdCOUP-TF II, y se verificaron tasa de proliferación celular mediante el ensayo de formación de colonias en agar blando. La sobreexpresión de COUP-TF II disminuyó significativamente el número de colonias, así como tamaño de las colonias de células LNCaP en medio de crecimiento completo (Figura 1B, panel izquierdo). a continuación, se investigó si COUP-TF II afecta a la proliferación dependiente de andrógenos de las células LNCaP. La sobreexpresión de COUP-TF II formación de colonias DHT-dependiente completamente inhibido de células LNCaP en un medio que contenía suero tratado con carbón vegetal (Figura 1B, panel derecho). La inhibición del crecimiento dependiente de andrógenos por un golpe TF-II se confirmó además en [
3H] timidina incorporación de ensayo. expresión COUP-TF II bloqueó completamente la síntesis de ADN inducida por andrógenos en células LNCaP (Figura 1C). Estos resultados sugieren que GOLPE-TF II inhibe el crecimiento andrógeno-dependientes de las células de cáncer de próstata.
COUP-TF II reprime AR transactivación
Desde el golpe TF-II sobreexpresión inhibe el dependiente de andrógenos el crecimiento de células de cáncer de próstata LNCaP, se determinó una posible interferencia entre COUP-TF II y AR, que es importante para el desarrollo de los cánceres de próstata. Para la prueba de una estrecha relación, que coexpresan COUP-TF II con AR en la línea celular de PPC-1, un derivado de la PC-3 y AR-negativos [44], y se accede a el efecto sobre el potencial de transactivación de AR. Como se muestra en la Figura 2A, COUP-TF II inhibe la transactivación dependiente de andrógenos AR en una forma dependiente de la dosis. COUP-TF también inhibió fuertemente la transactivación de AR, pero se expresó ni en la próstata del ratón (datos no mostrados), ni en líneas celulares de cáncer de próstata [20], [21].
(A) la inhibición dependiente de la dosis de AR transactivation de golpe-TFS. células PPC-1 se cotransfectaron con 350 ng de pPBARE × reportero 7-tk-Luc y 50 ng de plásmido de expresión de AR junto con el aumento de concentración (100, 250, y 500 ng) de COUP-TF I o COUP-TF II. Las células fueron tratadas con o sin 3 nM DHT durante 24 h. (B) mediada por la represión II COUP-TF de AR transactivación de AR-promotores diana naturales. células PPC-1 se transfectaron como en "A", con PSA-luc o reportero MMTV-luc. (C) COUP-TF represión de la transactivación de AR endógeno II-mediada. células LNCaP fueron transfectadas como en "A", sin el plásmido de expresión de AR. (D) La represión de la expresión de ARNm de PSA inducida por andrógenos por un golpe TF-II. células LNCaP fueron infectadas con AdGFP o AdCOUP TF-II. Después de 24 h de recuperación, las células fueron tratadas con 10 nM de DHT, y se cultivaron durante otras 24 h antes de la cosecha. Quantitative análisis RT-PCR se realizó utilizando cebadores específicos para PSA y β-actina. La expresión de ARNm de PSA relativa se normalizó mediante la expresión β-actina. Al menos tres experimentos independientes se combinaron y los valores representan la media ± SEM (A-D). **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001. (E) La represión de la expresión de la proteína PSA inducida por andrógenos por un golpe TF-II. células LNCaP fueron infectadas y se procesaron como en "D", y se cultivaron durante otras 48 h antes de la cosecha. El análisis de transferencia Western de proteínas totales se realizó utilizando anti-PSA, anti-AR (sc-815), anti-HA, y anti-α-tubulina. Los datos son representativos de tres experimentos independientes (izquierda). La expresión de la proteína PSA relativa se cuantificó mediante la normalización con la expresión de la tubulina (rignt).
Con el fin de establecer la importancia de la represión mediada por AR II COUP-TF, examinamos COUP-TF II efecto sobre el Natural promotores AR-diana tales como MMTV y PSA. En las células PPC-1, co-expresión de COUP-TF II con AR reprimida transactivación de AR tanto en MMTV y promotores de PSA (Figura 2B). Por otra parte, el golpe TF-II también reprime la transactivación de AR endógenos en un mínimo AREx7 promotor ARE y promotor de PSA en las células LNCaP que expresan la mutación, pero funcional, AR (Figura 2C).
PSA es el mejor caracterizado de andrógenos gen de respuesta, así como un marcador tumoral específico de la próstata. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la COUP-TF II sobre la expresión de PSA endógeno en las células LNCaP AR-positivos, que fueron infectadas con COUP-TF II adenovirus que expresa (AdCOUP-TF II). Sobreexpresa COUP-TF II downregulated significativamente la expresión inducida por andrógenos de ARNm PSA endógeno (Figura 2D) y la proteína (Figura 2E), mientras que no tuvo efecto sobre la expresión de proteínas AR. En conjunto, estos resultados indican que COUP-TF II reprime la función de AR en células de cáncer de próstata, la inhibición de la expresión de AR endógeno PSA gen diana.
COUP-TF II interacciona físicamente con AR
in vitro
y
in vivo
GST desplegable ensayo se realizó con el fin de examinar si la represión por un golpe AR-TF II está mediada por la interacción directa proteína-proteína. Interacciones de AR con COUP-TF II, así como dominios AR responsable de la interacción, se investigaron el uso de diferentes mutantes de deleción AR fusionados a la proteína GST (Figura 3A, panel izquierdo). El
in vitro
traducida COUP-TF II interactuaron con GST-AR AF1DBDh, GST-AR DBDH, y GST-AR LBD, pero no con TAU GST-AR, lo que sugiere la participación de los dominios DBDH y LBD de AR en su interacción con COUP-TF II. dominios COUP-TF II responsables de su interacción con AR fueron luego investigadas usando proteína de fusión GST de COUP-TF II mutantes de deleción (Figura 3A, panel derecho). El
in vitro
traducidos AR interactuó con los mutantes de deleción del (COUP-TF II AF1, COUP-TF II DBDH y COUP-TF II ΔAF1) de longitud completa COUP-TF II y, lo que sugiere una interacción con múltiples AR dominios de COUP-TF II.
(A) La interacción directa entre COUP-TF II y AR. panel superior izquierdo, Representación esquemática de la AR de larga duración y sus diferentes mutantes de deleción del dominio utilizado en el ensayo de pull-down de GST. panel inferior izquierdo, COUP-TF II interactúa directamente con AR a través de la DBDH, y la región LBD de AR. [
35S] se le permitió metionina marcada con COUP-TF II para unirse con GST expresada en bacterias solo o con diferentes mutantes de deleción del dominio de AR (GST-AR AF1DBDh, TAU GST-AR, GST-AR DBDH, GST-AR LBD ). Las reacciones se llevaron a cabo con la cantidad equivalente de cada proteína como se determina por tinción con azul de Coomassie (datos no mostrados). El cinco por ciento de la proteína marcada utilizada en la reacción de unión se cargó como entrada. panel superior derecho, la representación esquemática de larga duración de sus mutantes de deleción COUP-TF II y. el panel inferior derecho, AR interactúa directamente con COUP-TF II. [
35S] metionina se dejó marcado con AR para enlazar con GST sola, la longitud total (GST-COUP-TF II F) o diferentes mutantes de deleción de COUP-TF II (GST-COUP-TF II AF1, GST COUP-TF II DBDH, y ΔAF1 GST-COUP-TF II). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. F: Integral de COUP-TF II; AF1DBDh: AF1 + + DBD bisagra; TAU: unidad de transactivación; DBDH: DBD + región bisagra. (B) COUP-TF II se coimmunoprecipitated con AR. células PPC-1 se transfectaron con AR y GFP fusionado COUP-TF II plásmidos de expresión y después se trataron con o sin 10 nM de DHT durante 24 h después de la transfección. Coimmunoprecipitations se llevaron a cabo con anti-AR (sc-815) o anticuerpo anti-GFP. Western blot análisis de materiales inmunoprecipitadas se realizaron utilizando anti-AR (sc-815) o anticuerpos anti-GFP. borrones de entrada se muestran para el nivel de expresión de cada proteína. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Examinar
in vivo
interacción entre COUP-TF II y AR, se realizó el ensayo con células coimmunoprecipitation PPC-1 que se cotransfectaron con AR y GFP-fundido COUP-TF II plásmidos de expresión. Inmunoprecipitaciones utilizando anticuerpo anti-AR o anti-GFP, seguida de Western blot de los complejos inmunoprecipitados de AR y COUP-TF II, revelaron que la AR y el golpe TF-II se coprecipitated eficiente (Figura 3B).
COUP-TF II interfiere con la interacción N /C-terminal de AR
Tras la unión del ligando, AR se disocia de proteínas de choque térmico y se transloca en el núcleo, la unión de ese modo a sus promotores de genes diana como un homodímero que está formado por la interacción intermolecular de terminales N /C de dos AR moléculas. Debido a que algunos corepressors AR interfieren con los pasos involucrados en la activación de AR dependiente de andrógenos en consecuencia reprimir transactivación AR potencial [45], la capacidad de COUP-TF II para inhibir cualquiera de las etapas de activación AR, tales como la interacción y el terminal N /C translocación nuclear de AR, se investigó. células PPC-1 se transfectaron con VP-AR1-660 (que contiene los residuos 1-660 AR), GAL-AR624-919 (que contiene los residuos 624-919 AR), y cantidades crecientes de COUP-TF II plásmido de expresión, junto con una luciferasa gen informador regulado por el tándem elementos de respuesta Gal4-(5xGAL4-Luc3) [39]. Como se muestra en la Figura 4A, COUP-TF II inhibe la interacción de Gal4-AR624-919 con VP-AR1-660 en el sistema de dos híbridos de mamífero. Estos resultados sugieren que COUP-TF II inhibe la dimerización de AR a través de la unión N /C. Con el fin de determinar si COUP-TF II interfiere físicamente con la interacción que se produce entre el extremo N-terminal y C-terminal de AR, se realizó ensayo de competición GST pull-down utilizando GST-AR LBD,
in vitro
traducida [ ,,,0],
35S] metionina marcada con AR AF1DBDh, y
in vitro
traducida proteínas II COUP-TF. AR AF1DBDh ha demostrado interactuar con GST-AR LBD, y la interacción se interferida por COUP-TF II de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B).
(A) de mamíferos ensayo de dos híbridos. PPC-1 células fueron transfectadas con 5xGAL4-Luc3 junto con o sin VP-AR1-660, GAL-AR624-919, y el golpe TF-II plásmidos de expresión. Las células fueron tratadas con o sin 10 nM de DHT durante 24 h. Al menos tres experimentos independientes se combinaron y los valores representan la media ± SEM. ***, P & lt; 0,001. (B) GST ensayo de competición desplegable. LBD proteínas GST-AR inmovilizados se incubaron con [
35S] metionina proteínas AR AF1DBDh marcado producidos por
in vitro
traducción. Para el análisis de la competencia, de 5 a 10 veces el exceso de
in vitro
proteínas traducida COUP-TF II se añadió junto con las proteínas marcadas radiactivamente AR AF1DBDh. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. AF1DBDh: AF1 + + DBD región bisagra
II inducida COUP-TF Represión AR no estaba relacionada con la translocación nuclear de AR y HDAC Reclutamiento
El efecto de COUP-TF II. en la translocación nuclear de AR se evaluó mediante la coexpresión de RFP-etiquetados AR y GFP-etiquetados COUP-TF II en células COS-7. Cuando RFP-AR y GFP-COUP-TF II se coexpresan, proteína de AR se encuentra predominantemente en el citoplasma en ausencia de ligando, pero, la proteína de AR translocado al núcleo en presencia de 10 nM DHT (Figura 5A). Independientemente de DHT, COUP-TF II fue predecible situado en el núcleo. Por lo tanto, ni la proteína AR ni COUP-TF II fue mislocalized por su co-expresión. **, P & lt; 0,01;