Extracto
Los principales desafíos que enfrentamos en la terapia del cáncer con paclitaxel (PTX) son la resistencia a los medicamentos y los efectos secundarios severos. Se han realizado enormes esfuerzos para superar estos desafíos clínicos mediante la combinación de PTX con otros fármacos. En este estudio, se informó de los primeros datos preclínicos que el praziquantel (PZQ), un agente antiparasitario, podría mejorar en gran medida la eficacia contra el cáncer de PTX en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo líneas celulares PTX-resistentes. Basándose en el valor del índice de combinación, hemos demostrado que PZQ sinérgicamente reforzada en la inhibición del crecimiento celular inducida por PTX. El co-tratamiento de PZQ y PTX también indujo detención de la mitosis significativa y activa la cascada apoptótica. Por otra parte, PZQ combina con PTX resultó en una inhibición más pronunciada del crecimiento del tumor en comparación con cualquiera de los fármacos solo en un modelo de xenoinjerto de ratón. Tratamos de investigar los posibles mecanismos de esta eficacia sinérgica inducida por PZQ y PTX, y se encontró que el tratamiento conjunto de los dos fármacos podría disminuir notablemente la expresión del ligada al cromosoma X inhibidor de la proteína de la apoptosis (XIAP), una proteína anti-apoptótica . Nuestros datos demuestran además que se requiere baja regulación de XIAP para la interacción sinérgica entre PZQ y PTX. En conjunto, este estudio sugiere que la combinación de PTX PZQ y puede representar un nuevo y eficaz contra el cáncer estrategia para la optimización de la terapia PTX
Visto:. Wu ZH, Lu Mc, Hu LY, Li X (2012) praziquantel mejora sinergísticamente paclitaxel eficacia para inhibir el crecimiento de células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10.1371 /journal.pone.0051721
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Julio, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: December 12, 2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional para el Fomento de talentos de la ciencia básica, china (J1030626) (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm); El Proyecto clave de los programas provinciales de Fujian para la Ciencia y la Tecnología (2011Y0050); y la Fundación de Innovación Tecnológica de la Ciencia y la Tecnología Oficina de Xiamen, China (2011S0567). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Se convirtió en una nueva tendencia que convertir un antiguo medicamento para nuevos usos, especialmente para el tratamiento del cáncer, ya que esos viejos fármacos utilizados habitualmente pueden tener un talento oculto o un buen potencial en el tratamiento de cáncer. El hecho es que todo el estudio diagnóstico se ha hecho ya, lo que nos permite mover la droga en la clínica más rápidamente y reducir el costo para el desarrollo de drogas [1], [2]. El concepto de "nuevos usos para medicamentos" viejo proporciona una solución eficiente para volver a descubrir nuevos usos para medicamentos existentes con conocimiento de la farmacocinética y perfiles de seguridad. Algunos ejemplos exitosos de este tipo de desarrollo medicamento contra el cáncer se había informado anteriormente como talidomida [3], la vitamina C [4] - [6], los AINE (medicamentos antiinflamatorios no esteroides) [7] - [11]. Recientemente, se ha informado de que la artemisinina, un agente antiparasitario, y sus derivados, tenían profunda citotoxicidad contra las células cancerosas de diferentes tumores [12] - [16], proporcionando el impulso necesario para el desarrollo de fármacos anti-parásitos en medicamentos contra el cáncer. El praziquantel (PZQ), otro agente antiparasitario, se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de la esquistosomiasis diferente con buena eficacia [17], [18]. Curiosamente, se informó de que PZQ puede mejorar las respuestas inmunitarias humoral y celular del huésped contra las enfermedades [19], [20]. Sería interesante investigar si PZQ tiene actividad contra el cáncer que todavía no está claro hasta el momento.
En este estudio, matando a la actividad de PZQ en las células cancerosas se evaluó con diferentes ensayos. También se investigaron los efectos del tratamiento combinado con paclitaxel PZQ y el fármaco quimioterapéutico de uso común (PTX). PTX es un agente de estabilización de microtúbulos que puede promover la estabilización de los microtúbulos, dando como resultado la detención de las células en fase G2 /M del ciclo celular y conducen a la apoptosis [21], [22]. Como uno de los fármacos anticancerosos más comúnmente utilizados, PTX ha demostrado una gran eficacia contra una amplia gama de tumores malignos, incluidos los de mama, cabeza y cuello, ovario y no pequeñas de cáncer de pulmón de células, así como el sarcoma de Kaposi [23]. Sin embargo, la aparición de resistencia clínica y amplia gama de efectos secundarios graves siguen siendo problemas importantes con la terapia de PTX [24] - [26]. En consecuencia, numerosos estudios recientes se centraron en la terapia de PTX sinérgica con el objetivo de encontrar una solución eficaz para superar un problema PTX-resistentes y la reducción de la toxicidad inducida por PTX sin comprometer la eficacia de los medicamentos [27], [28].
A continuación, se informó de que PZQ podría mejorar sinérgicamente el efecto inhibidor del crecimiento de PTX en una variedad de líneas celulares de cáncer, incluyendo líneas celulares PTX-resistentes como DLD1 y H1299, aunque el tratamiento PZQ solo no ejercía citotoxicidad en estas células de cáncer. PZQ también podría mejorar en gran medida la detención mitótica inducida por PTX y la apoptosis. En otros estudios, se demostró que esta sinergia entre citotóxica PZQ y PTX involucrado baja regulación de XIAP. La capacidad de PZQ para potenciar los efectos anticancerosos de PTX se confirmó posteriormente en un modelo de xenoinjerto de ratón. Estos resultados proporcionan implicaciones importantes para la optimización de la terapia PTX. Combinando PZQ con PTX puede representar una novela y una estrategia eficaz contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
línea celular de cáncer de colon humano DLD-1, el cáncer de mama línea celular ZR-7530, las líneas celulares de cáncer de pulmón SPC-a-1 y a-2 LTEP se cultivaron en RPMI 1640. línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano H1299, línea celular de cáncer cervical HeLa y línea celular de cáncer de mama humano Bcap37 se mantuvieron en DMEM. Todos los medios se complementaron con 10% (v /v) de suero fetal bovino (Gibco, Carlsbad, CA), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Todas las líneas celulares se obtuvieron del Banco de Células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). Las líneas celulares que estaban libres de micoplasma cuando se probó mediante una prueba de micoplasma basado en la PCR [29], [30].
Reactivos y anticuerpos
El paclitaxel (PTX), roscovitina, el anticuerpo policlonal de conejo contra Bim, Puma, y el anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) contra β-actina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El praziquantel (PZQ) fue proporcionado amablemente por el Dr. Jun Lu (Nanjing Pharmaceutical fábrica co., LTD, Nanjing, China). MG132 era de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). El anticuerpo policlonal de conejo contra poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP; p89) y H3 fosfo-histona (Ser-10) (P-H3) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). El anticuerpo policlonal de conejo contra Noxa, bax, bak, caspasa-3, survivina, Bcl-2, Bcl-y X
L eran de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). El mAb de ratón contra XIAP fue de BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). De cabra anti-conejo de cabra y rábano picante anti-ratón de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se adquirieron en Pierce Biotechnology (Rockford, IL).
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó por 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro (MTT) ensayo de 5-difeniltetrazolio. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos se incubaron con fármacos indicados a 37 ° C durante diferentes períodos de tiempo. Entonces se retiró el medio de cultivo y se añadió medio que contenía MTT (0,5 mg /ml) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una 2-4 h adicional en un CO
2 incubadora a 37 ° C. Los cristales de formazán se disolvieron en 100% de DMSO y la absorbancia a 570 nm se midió utilizando un lector de microplacas. Cada muestra se midió por triplicado y se repitió tres veces. El porcentaje relativo de supervivencia se calculó dividiendo la absorbancia de las células tratadas por la del control en cada experimento. PTX y PZQ como agentes únicos y en combinación en las más altas concentraciones usadas en los experimentos descritos no interfieren con los reactivos de ensayo MTT en nuestros experimentos de control (datos no mostrados).
Cell CycleAnalysis
Para el análisis del contenido de ADN y del ciclo celular por citometría de flujo, se recogieron las células, se lavaron una vez con PBS, y se fijaron en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche. En el momento para citometría de flujo análisis, las células se lavaron con PBS y re-suspenden en solución de tinción (100 mg /ml de RNasa y 100 mg /ml de yoduro de propidio en PBS). Después las células se incubaron durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad, la distribución del ciclo celular se analizó mediante un flujo Coulter EPICS XL (Beckman Coulter, Miami, FL).
Western Blot Analysis
se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [31]. Brevemente, se recogieron y se lisaron en tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH = 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton-X 100, 1 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo, 10 mg /ml de leupeptina, 2 mg /ml de aprotinina células, mM NaF 10, Na 1 mM
3Vo
4, y la concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Las proteínas celulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se transfirieron a la membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). Las membranas se bloquearon con TBS-Tween 20 (0,5%) que contenía 5% de leche sin grasa para 2 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Después de tres lavados con TBS-Tween 20, las membranas se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo o cabra de rábano picante anti-ratón de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron con TBS Tween-20 de nuevo y desarrollados por un aumento de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL). β-actina se utilizó como control de carga. Los anticuerpos primarios se utilizaron a una dilución 1:1000, a excepción de anti-β-actina, que se utilizó a una dilución 1:5000. Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa anti-conejo o anti-ratón de rábano picante se usaron a una dilución de 1:5000.
DAPI
Después de tratamiento de drogas, las células cultivadas en placas de 6 pocillos eran se lavó con PBS y se fijaron con 3,7% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se incubaron con la solución de tinción (0,3% Triton X-100 y 1 mg /ml DAPI en PBS) durante 5 minutos evitar la luz a temperatura ambiente. Las células fueron examinadas por microscopía de fluorescencia (Nikon). Las células que tienen núcleos fragmentados y uniformemente condensados fueron considerados como células apoptóticas, y se expresó la apoptosis como porcentaje calculado a partir del número de células con morfología nuclear apoptótica dividido por el número total de células examinadas.
formación de colonias de ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a 1,5 x 10
3 células por pocillo y se expone a tratamiento farmacológico. Después de 10 días, las células se fijaron y se tiñeron con violeta cristal (0,5% de cristal violeta y 20% de metanol) durante 30 minutos. A continuación, las placas se lavaron con agua destilada y se fotografiaron. se contaron las colonias que contenían más de 50 células. Los valores para cada condición se expresan como un porcentaje respecto a los controles tratados con vehículo. Cada condición de ensayo se realizó en al menos tres experimentos independientes.
Inmunofluorescencia La tinción
Las células sobre los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 10 min, se lavaron con PBS, permeabilizaron con 0,2% de Triton-X100 en PBS durante 10 min y, a continuación, se bloqueó con 3% de albúmina de suero bovino en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió anti-fosfo-histona H3 (Ser-10) (P-H3) anticuerpo (dilución 1:100) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS que contenía 0,02% de Triton X-100 y 1,5% de BSA, los cubreobjetos se incubaron con Alexa Fluor 647 cabra conjugado con IgG anti-conejo (dilución 1:200) durante 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, las células se incubaron con 1 mg /ml DAPI en PBS durante 5 minutos antes de montarse en 90% de glicerol y se sellan con laca de uñas. Índice mitótico se expresó como un porcentaje de-células P-H3 positivos en relación con el número total de células examinadas.
plásmidos, la transfección de la célula y la interferencia de ARN
El plásmido XIAP que expresan pcDNA3- myc-XIAP fue un regalo del Dr. John C. Reed (el Instituto Burnham, la Jolla, EE.UU.) y el pcDNA3 vacío fue utilizado como control negativo. Transfección de células se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
Para desmontables XIAP, shRNA secuencia dirigida XIAP (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) se clonó en un vector lentiviral Lenti-Lox3.7 (pLL3 0.7). Una secuencia con ninguna parte correspondiente en el genoma humano (GATCATGTAGATACGCTCA) se utilizó como control. Para la producción de infecciosas lentivirus shRNA-expresando, 293 T células fueron transfectadas con vector lentiviral pLL3.7 junto con vectores de empaquetamiento pVSV-G, pRSV-Rev y RRE pMDL gag /pol. 48 h después de la transfección, se recogieron los medios de sobrenadante que contiene el virus, se pasan por un filtro de 0,45 micras, y se utiliza para las células infectadas después de la adición de 10 mg /ml polibreno.
Real-time PCR con transcripción inversa
el ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Primera línea de cDNA se sintetizó a partir del ARN total usando un cebador oligo-dT y Moloney murino de la transcriptasa inversa del virus de leucemia (Takara, Shiga, Japón). PCR en tiempo real se realizó en el Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) y verde SYBR (BIO-V, Xiamen, China) se utilizó como un reactivo de detección. El primer secuencias de XIAP y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron: XIAP (adelante: 5'-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 '; inversa: 5'-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3'), GAPDH (adelante: 5'-3-CCACCCATGGCAAATTCC '; inversa: 5'-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3'). Cada muestra se realizó por triplicado. El análisis de datos se realizó con el software de la serie Rotor-Gene 6000 1,7 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Las cantidades relativas de ARN se normalizaron a GAPDH ARNm.
Procedimientos de xenoinjertos y tratamiento
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Xiamen. Las células tumorales (DLD-1, 2 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos (BALB /c, 4-5 semanas de edad). Cuando el volumen del tumor alcanzó 25 a 35 mm
3, los animales se distribuye al azar a diferentes grupos de tratamiento (n = 6 en cada grupo). Los animales fueron inyectados por vía intraperitoneal con PZQ sola (100 mg /kg), PTX solo (30 mg /kg), o una combinación de PZQ (100 mg /kg) y PTX (30 mg /kg). PTX se disolvió en volúmenes iguales de Cremophor EL y etanol, y se diluyó adicionalmente con PBS antes de la inyección. PTX fue dado en los días 5, 9, y 13 después de la inyección de células tumorales. PZQ disuelto en aceite de maíz fue dado en los días 5, 7, 9, 11, y 13 después de la inyección de células tumorales. Para el tratamiento con un solo fármaco, vehículo fue dada en lugar de PZQ o PTX con el mismo horario. El tamaño del tumor se determinó mediante el uso de pinzas. El volumen del tumor (mm
3) se calculó por la fórmula: (a) x (b
2) × 0,5, donde a es la longitud del tumor y b es el ancho del tumor en milímetros
Análisis estadístico.
Los valores se expresan como media ± SEM. Para determinar las diferencias significativas en los datos,
se aplicó t
test de Student no pareada de dos colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0,05. interacciones con otros medicamentos fueron examinados para sinergismo o antagonismo mediante el análisis Mediana Dosis Efecto. (Calcusyn; Biosoft, Ferguson, MO)
Resultados
PZQ no ejerce ninguna citotoxicidad en las células tumorales
La citotoxicidad de PZQ en diversas células tumorales se examinó primero con líneas de células tumorales incluyendo las células de cáncer de pulmón (SPC-a-1, LTEP-a-2 y H1299), células de cáncer de mama (Bcap37 y ZR7530), células de carcinoma cervical (HeLa ) y las células de cáncer de colon (DLD-1). Sin embargo, PZQ induce ni la inhibición del crecimiento ni apoptosis incluso a concentraciones tan altas como 100 mM (Fig. S1), lo que indica que PZQ no ejerce ninguna citotoxicidad en las células tumorales.
El Co-tratamiento de PZQ y PTX sinérgicamente inhibe tumor Cell Growth
a continuación evaluó si PZQ podría afectar a la sensibilidad de las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos, tales como paclitaxel (PTX) mediante el ensayo de MTT. Se encontró que PZQ mejorado en gran medida la inhibición del crecimiento por PTX en varias líneas de células tumorales incluyendo dos líneas de células PTX-resistentes, DLD-1 y H1299 (Fig. 1A, Fig. S2). Hicimos la mayoría de nuestras siguientes experimentos con estas dos líneas celulares de PTX-resistentes. Para obtener una mayor comprensión de este efecto de combinación, se realizaron estudios de dosis-respuesta como se muestra en la Fig. 1B. PZQ podría aumentar la sensibilidad de las células DLD-1 a PTX a diferentes concentraciones de PTX y PZQ. ensayo de formación de colonias también mostró que la combinación de PZQ y PTX suprime notablemente la formación de colonias en comparación con cualquiera de los tratamientos agente solo (Fig. 1C). Se utilizó el análisis Median Dosis Efecto para caracterizar interacciones entre PZQ y PTX en lo que se refiere a disminuir en la viabilidad celular. Combinación de valores de índice & lt; 1,0, derivado del efecto de un intervalo de concentraciones PZQ y PTX en DLD-1 y células H1299 líneas, se indica un efecto sinérgico entre PZQ y PTX
(A (Fig 1D.). ) La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT después de varias líneas celulares de cáncer se trataron con PZQ solo, PTX solos o combinados ambos fármacos a concentraciones y puntos de tiempo como se indica siguiente: HeLa, ZR7530, las células DLD-1 y H1299 se trataron con 20 mM PZQ solo, 10 nM PTX solo o combinado, tanto durante 48 h; Bcap37 y las células SPC-A-1 se trataron con 30 PZQ mu M, 5 nM PTX solo, o ambos durante 48 h; LTEP-A-2 células fueron tratadas con 30 mM PZQ solo, 5 nM PTX solo, o ambos para 60 h. (B) DLD-1 se trataron con las concentraciones indicadas de PTX en la ausencia o presencia de 20 o 40 PZQ mu M durante 48 h. La viabilidad celular se determinó entonces por el ensayo de MTT. (C) DLD-1 y H1299 células fueron tratadas con 20 mM PZQ solo, 10 nM PTX solo, o la combinación durante 10 días. Las colonias fueron teñidas con violeta cristal y se contaron. células DLD-1 y H1299 (D) se trataron con diversas concentraciones de PZQ y PTX en una proporción fija (2000:1) durante 48 h. Después se determinó la viabilidad celular en cada condición, se calculó el índice de combinación (IC) como se describe en "Materiales y Métodos". Valores de CI & lt; 1,0 sugieren una interacción sinérgica entre los dos fármacos. Todos los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes.
efecto de la combinación de PZQ y PTX sobre la apoptosis Inducción
Para confirmar aún más la potenciación de la muerte celular inducida por PTX PZQ, se analizaron los extractos celulares para la expresión de marcadores apoptóticos tales como poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión. La combinación dio como resultado un marcado escisión de PARP en una variedad de diferentes líneas celulares, mientras que la administración de PZQ o PTX por sí solo no (Fig. 2A), lo que indica una activación significativa de la cascada apoptótica por esta combinación. Por otra parte, el porcentaje de población sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 2B, en comparación con el tratamiento con cualquier agente solo, el co-tratamiento de PZQ con PTX aumentó notablemente la acumulación de células en la fase sub-G1. También confirmó estos resultados por tinción nuclear con DAPI, un ensayo de apoptosis de las células alternativo. El porcentaje de células con núcleos apoptóticos fue significativamente mayor en el grupo de combinación que en el grupo de tratamiento solo (datos no mostrados). A continuación examinó la contribución de las caspasas a la apoptosis inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX. Como se muestra en la Fig. 2C, la caspasa 3 y la activación de PARP la escisión fueron bloqueados por el amplio espectro inhibidor de caspasa zVAD-fmk. El tratamiento con zVAD-fmk también bloqueó en gran medida la apoptosis inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX (Fig. 2D). Estos resultados sugieren que la apoptosis celular inducida por el co-tratamiento de la PTX y PZQ dependía de la actividad de caspasa.
(A) Las líneas celulares indicadas se trataron como en Fig. 1A, y la apoptosis se examinó mediante análisis Western de la PARP escindida (CLE-PARP) nivel. células DLD-1 y H1299 (B) fueron tratados con 20 PZQ mu M solo, 10 nM PTX solo, o la combinación de 48 h. Entonces fracción sub-G1 se determinó mediante citometría de flujo. (C) DLD-1 células fueron tratadas con PZQ 20 M y 10 nM PTX en la ausencia o presencia de 20 mM inhibidor de caspasa zVAD-fmk durante 48 h, y la expresión de la caspasa 3 y cle-PARP fueron examinados por Western blot. (D) Después de células DLD-1 se trataron como en C, el porcentaje de células apoptóticas se determinó por tinción con DAPI. Todos los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes.
El Co-tratamiento de PZQ y PTX podría inducir la detención mitótica en las células tumorales
La citometría de flujo se utilizó para examinar los efectos de PZQ y PTX sobre la distribución del ciclo celular de las células tumorales. El co-tratamiento de PZQ y PTX aumentó de forma dependiente de la dosis G2 población /M en comparación con el tratamiento PTX solo en las células DLD-1 (Fig. 3A). Para aclarar el perfil de células G2 /M acumulados-inducidas por la combinación, se examinaron índice mitótico en las células DLD-1 tratados con PTX en la ausencia o presencia de PZQ. Como era de esperar, los tratamientos por separado PTX dosis-dependiente aumento del índice mitótico (Fig. 3B). PTX en combinación con PZQ condujo adicionalmente a un aumento en el índice mitótico (Fig. 3B). También se encontró que PZQ podría promover de manera espectacular aumento mediada por PTX en el nivel de expresión de fosforilados histona H3 (Ser-10) (P-H3), un marcador mitótico (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que PZQ mejorada detención mitótica inducida por PTX en las células tumorales.
células DLD-1 (A) se trataron con 10 nM o 20 nM PTX en la ausencia o presencia de 20 PZQ mu M durante 12 h, y el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Después de DLD-1 células se trataron como anteriormente, se determinó el índice mitótico como se describe en "Materiales y Métodos" (B), y nivel de expresión de H3 fosfo-histona (Ser-10) (P-H3) se monitorizó mediante Western blot ( DO). Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos separados.
Un experimento de curso de tiempo basado en citometría de flujo mostró que el aumento de la G2 /M población precedió a la de la población sub-G1 en las células DLD-1 tratados con la combinación de PZQ y PTX (Fig. 4A), lo que indica G2 persistente /M detención probablemente condujo a la apoptosis. A continuación, examinó si existía una correlación entre la detención de la mitosis y la apoptosis inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX. Un inhibidor de CDK, la roscovitina, se utilizó. Roscovitina podría inhibir selectivamente CDK1, CDK2 y CDK5 y la progresión del ciclo celular bloque impidiendo que las células entren en los S y M fases [32]. Como se muestra en la Fig. 4B, inhibió casi completamente la roscovitina la G2 /M detención inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX en las células DLD-1. El aumento en el índice mitótico como resultado de la co-tratamiento de PZQ y PTX también volvió al nivel de control después de la adición de la roscovitina (Fig. 4C), lo que indica que la roscovitina inhibe la detención mitótica inducida por esta combinación. Sorprendentemente, la roscovitina inhibe también PZQ-aumento de la apoptosis mediada por PTX casi por completo, tal como se determina por la población sub-G1 de apoptosis y el análisis Western de la PARP escindida (Fig. 4D y E). Se obtuvieron resultados similares con células H1299 (datos no mostrados). Estos datos sugieren que el aumento de la apoptosis inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX probablemente a la mayor detención mitótica inducida por este tratamiento conjunto.
(A) Después de LDN-1 células fueron co-tratados con 20 mM PZQ y 10 nm PTX para los puntos de tiempo indicados, el G2 /M y las fracciones sub-G1 se determinaron por citometría de flujo. las células (B) DLD-1 se trataron con una combinación de PZQ (20 M) y PTX (10 nM) con o sin 12,5 M roscovitina durante 12 h, y después del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. las células (C) DLD-1 se trataron como en (B), y se determinó el índice mitótico. Después de DLD-1 se trataron con una combinación de PZQ (20 M) y PTX (10 nM) en presencia o ausencia de 12,5 M roscovitina durante 48 h, la apoptosis se evaluó por citometría de flujo El análisis de la población sub-G1 (D) y El análisis de Western de nivel cle-PARP (E). Todos los valores se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes.
El Co-tratamiento de PZQ y PTX podría regular a la baja de proteína XIAP
Para evaluar el mecanismo subyacente de la citotoxicidad sinérgica entre PZQ y PTX, se evaluó los efectos de los dos agentes, ya sea solos o en combinación, en diversas proteínas reguladoras de la apoptosis en las células DLD-1. Como se muestra en la Fig. 5A, el tratamiento con PZQ o PTX por sí sola no alteró la expresión de XIAP. Sin embargo, la exposición de las células a la combinación de PZQ y PTX dio lugar a una notable disminución en el nivel de XIAP. No hay cambios significativos en la expresión de otras proteínas, tales como Bcl-X
L, sobreviviendo, Puma, Bim, Noxa, Bax y Bak, se observaron en las células expuestas a PTX solo, PZQ solo, o la combinación.
(a) DLD-1 células fueron tratadas con 20 PZQ mu M solo, 10 nM PTX solo, o la combinación de 24 h. Entonces la expresión de Bcl-XL, Bcl-2, survivina, XIAP, Bim, Puma, Noxa, Bax y Bak fueron controlados por Western blot. (B) Después de la exposición de las células DLD-1 a una combinación de PZQ 20 M y 10 nM PTX en presencia o ausencia de 20 mM zVAD-fmk durante 24 h, la expresión de XIAP se determinó mediante Western blot. Células H1299 (C) se trataron con 20 PZQ mu M solo, 10 nM PTX solo, o la combinación durante 24 h, después de lo cual la expresión de XIAP se examinó. (D) Después de células DLD-1 se trataron como en (A), se aisló el ARN total y XIAP mRNA se cuantificó por tiempo real de RT-PCR. Tras la normalización de GAPDH ARNm, los valores de expresión de ARNm de XIAP para cada condición fueron con respecto a las células de control tratadas con vehículo. las células (E) DLD-1 se trataron con una combinación de PZQ 20 M y 10 nM PTX en la ausencia o presencia de 10 mM MG132 durante 24 h, y luego la expresión de XIAP se monitorizó mediante inmunotransferencia de tipo Western. Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos separados.
Para determinar si los cambios en la expresión de XIAP eran dependientes de la activación de caspasa, las células tratadas DLD-1 con la combinación de fármacos en presencia o ausencia de la inhibidor de la caspasa zVAD- fMK. Como se muestra en la Fig. 5B, zVAD-fmk tuvo poco efecto en la baja regulación de XIAP inducida por la combinación de PZQ y PTX, lo que indica que los cambios en la expresión de XIAP eran caspasa-independiente. Baja regulación de XIAP también se observó en las células H1299 co-tratados con PZQ y PTX (Fig. 5C), lo que sugiere que la modulación de esta proteína puede no ser línea celular específica.
Se intentó identificar el mecanismo por el XIAP, que se había reducido regulado en respuesta a la co-tratamiento de PZQ y PTX. Para investigar si el co-tratamiento de PZQ y PTX podría regular la expresión de XIAP en el nivel transcripcional, se utilizó PCR con transcripción inversa. En comparación con el grupo control, el tratamiento combinado con PZQ y PTX no dio lugar a cambios significativos en los niveles de ARNm de XIAP (Fig. 5D).
Otra posible explicación para XIAP baja regulación podría ser la degradación de XIAP por el proteasoma. Para probar esta hipótesis, se trataron las células DLD-1 con la combinación de fármacos en presencia de un inhibidor del proteasoma, MG132. Represión de XIAP en células DLD-1 tratados con la combinación de PZQ y PTX fue casi completamente abolida por MG132 (Fig. 5E). Estos resultados indicaron que PZQ y PTX podrían inducir la degradación de XIAP través de la vía mediada por el proteosoma.
XIAP juega un papel importante en el sinérgica citotoxicidad de PZQ y PTX
A partir de los resultados anteriores, se investigó si la regulación por disminución de XIAP en realidad mediada la muerte celular inducida por la combinación de PZQ y PTX. Estamos transfectadas transitoriamente células DLD-1 con un plásmido que contiene epítopo de etiquetado XIAP (myc-XIAP) y un plásmido vacío que sirvió como control. La transfección se confirmó por Western blot (Fig. 6A). La sobreexpresión de XIAP en células DLD-1 significativamente atenuada PZQ-aumentada su citotoxicidad PTX-inducida, como se determina por análisis de la viabilidad celular y la población sub-G1 (Fig. 6B y C).
(A) de transferencia de Western mostró XIAP expresión en las células DLD-1 a las 24 h después de la transfección con pcDNA3-myc-XIAP o vector de control. (B) 24 h después de la transfección con pcDNA3-myc-XIAP y vector de control, las células DLD-1 se trataron con 20 PZQ mu M solo, 10 nM PTX solo o la combinación durante 48 h, y luego la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. (C) 24 h después de la transfección con pcDNA3-myc-XIAP y vector de control, las células DLD-1 se trataron con una combinación de PZQ 20 M y 10 nM PTX. A continuación, la fracción sub-G1 se determinó por citometría de flujo. las células (D) DLD-1 fueron infectadas con un lentivirus de control de codificación shRNA o XIAP shRNA durante 48 h, y la expresión de XIAP se analizaron por Western blot. (E) las células DLD-1 fueron infectadas con un lentivirus de control de codificación shRNA o XIAP shRNA durante 48 h, y después se trataron con 20 PZQ mu M solo, 10 nM PTX solo o la combinación de 48 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. Todos los valores se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes.
Para estudiar más a fondo el papel de XIAP en la sinergia entre PZQ y PTX, hemos utilizado mediada por lentivirus-ARN corto horquilla (shRNA) a desmontables XIAP en células DLD-1. Las células se recogieron a las 48 h después de la infección, y la expresión de XIAP se analizaron por Western blot. En comparación con DLD-1 células infectadas con el control de shRNA, las células infectadas con XIAP shRNA visualizan suprimidos de manera espectacular la expresión de XIAP (Fig. 6D). A continuación se evaluó el efecto de XIAP caída en la viabilidad celular. Como se muestra en la Fig. 6E, el bloqueo de la expresión de XIAP no tuvo efecto sobre la sensibilidad de las células DLD-1 para el tratamiento PZQ. Sin embargo, XIAP caída significativa sensibilizado células DLD-1 a la citotoxicidad inducida por PTX (Fig. 6E). Por otra parte, la citotoxicidad inducida por el co-tratamiento de PZQ y PTX también se ha mejorado en las células DLD-1-XIAP desmontables (Fig. 6E). Estos datos sugieren que XIAP juega un papel importante en la mediación de la citotoxicidad sinérgica provocada por el co-tratamiento de PZQ y PTX.
La combinación de PTX PZQ y suprime el crecimiento tumoral
in vivo
Para probar si el co-tratamiento de PZQ y PTX tiene ningún efecto sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, establecimos un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos con células DLD-1 PTX-resistentes. Inyectada por vía subcutánea células DLD-1 dieron lugar a tumores en ratones desnudos atímicos (Fig. 7A) en crecimiento exponencial. El tratamiento combinado con PZQ y PTX suprime en gran medida el crecimiento del tumor en relación con el tratamiento PTX solo, mientras que PZQ administra solo fue incapaz de inhibir el crecimiento del tumor en los ratones de xenoinjerto de soporte de DLD-1 (Fig. 7A y B). En comparación con el grupo de control, el tratamiento con PZQ y PTX combinación resultó en un & gt; 50% de reducción en el peso del tumor (Fig 7C.).