Extracto
Antecedentes
La adrenomedulina (AM) es altamente expresado en el cáncer de páncreas y estimula células de cáncer pancreático que conducen a un aumento del crecimiento tumoral y la metástasis. El presente estudio examina el papel de los receptores de AM específicas sobre el tumor y las células se asemejan al microambiente tumoral (pancreática humana estrelladas - HPSC, vena umbilical humana - células endoteliales HUVEC y pulmón de ratón - LMCE).
Métodos y resultados
AM receptores ADMR y CRLR estaban presentes en HPSC, HUVEC y MLECs mientras que las células PDAC poseían sólo receptores ADMR tal como se evaluó mediante RT-PCR y Western Blot. Todas las líneas celulares expresadas y secretadas AM como se indica por ELISA. El crecimiento de cada una de las líneas celulares fue estimulado por exógena AM y se inhibe por la AMA antagonista. AM también estimuló
in vitro
angiogénesis evaluada por la formación de polígonos de líneas de células endoteliales. siRNA mediada por silenciamiento de ADMR, pero no CRLR, redujeron el crecimiento basal de todas las células examinadas y la reducción de la formación de las células endoteliales polígono
in vitro
. ortotópico tumores desarrollados con células de cáncer de cojinete shADMR habían reducido drásticamente el volumen de tumor primario (& gt; 90%) y de pulmón y las metástasis de hígado en comparación con las células que llevan shControl. Para validar ADMR como una posible diana terapéutica, i
n vivo
se llevaron a cabo estudios utilizando nanoliposomas neutros para entregar sistémicamente siRNA humano a ADMR para silenciar las células cancerosas humanas y de ratón siRNA para silenciar ADMR células estromales tumorales de ratón. silenciamiento sistémico de ambos ADMR humanos y de ratón no tuvo efectos adversos obvios, pero el desarrollo de tumores muy reducido.
Conclusión
ADMR media los efectos estimulantes de la AM en las células cancerosas y en las células endoteliales y estrelladas dentro de la microambiente tumoral. Estos datos apoyan el desarrollo de ADMR como un tratamiento objetivo útil de cáncer de páncreas
Visto:. Ramachandran V, Arumugam T, R Langley, Hwang RF, Vivas-P Mejía, Sood AK, et al. (2009) El receptor ADMR media los efectos de adrenomedulina en células de cáncer pancreático y en las células del microambiente tumoral. PLoS ONE 4 (10): E7502. doi: 10.1371 /journal.pone.0007502
Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 4 de Junio, 2009; Aceptado el 15 de septiembre del 2009; Publicado: 22 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Ramachandran et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el NIH DK052067, el MD Anderson Core Support CA16672 subvención, el MD Anderson pancreáticos Programas especializados de Investigación de Excelencia CA101936 (SPORE) P20 subvención, y por la dotación de Lockton, y el apoyo de un proyecto de subvención de Desarrollo de Programas del Fondo de Investigación del cáncer de Ovario. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos y se ha estimado que en 2008 aproximadamente 37,680 estadounidenses fueron diagnosticados y 34.290 murieron a causa de esta enfermedad [1]. A pesar de los avances significativos están empezando a ser hecho en el manejo de la enfermedad, la tasa de supervivencia a 5 años no ha mejorado en los últimos 25 años [1]. La alta tasa de mortalidad se debe a la alta incidencia de la enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico inicial, el curso clínico agresivo y el fracaso de las terapias sistémicas [2]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejorar la comprensión de la biología molecular de la enfermedad que puede ser utilizado para desarrollar nuevas terapias para el cáncer pancreático.
que anteriormente mostró que la adrenomedulina (AM) se expresa en off en el cáncer pancreático y tiene una fuerte función autocrina en esta enfermedad [3]. AM es un péptido de 52 aminoácidos aislado originalmente de feocromocitoma humano [4] que actúa como un péptido regulador multifuncional [5]. Un problema con AM como un objetivo para la terapia del cáncer es que AM tiene varias funciones fisiológicas cuya inhibición puede ser perjudicial. AM se expresa en las células de los islotes pancreáticos normales, con expresión predominante en las células F, que también contienen el polipéptido pancreático [6]. AM reduce la secreción de insulina en condiciones fisiológicas [6]. AM también tiene efectos importantes en la biología de células vasculares en los que regula el tono vascular y permeabilidad y promueve la vasodilatación [7] - [11]. AM es también una molécula angiogénica potente, sobre todo en la hipoxia, que induce AM [10]. Los efectos angiogénicos de AM probablemente están mediadas a través de la estimulación directa de la proliferación de células endoteliales [12] y la protección de las células endoteliales de la apoptosis [13]. señalización adrenomedulina es necesaria para el desarrollo vascular linfático murino [14]. Los ratones en los que AM se ha suprimido genéticamente desarrollar edema cutáneo y letalidad midgestational debido a un defecto en el crecimiento de vasos linfáticos y el defecto cardiovascular [15]. En el cáncer, AM parece tener un papel importante en la angiogénesis, así como un efecto adicional trófico directamente sobre las células del cáncer [16] - [18].
AM actúa como un ligando peptídico que activa los receptores en la superficie celular . células beta pancreáticas expresan receptores conocidos para responder a AM incluyendo el receptor de la adrenomedulina (ADMR, también conocida como L1-R) y la calcitonina-receptor-like-receptor (CRLR) [6], [19], [20]. Nuestro estudio anterior encontró que las células de cáncer de páncreas sólo expresan ADMR, mientras que ambos receptores están presentes en células que se encuentran dentro del microambiente del tumor, incluyendo células humanas pancreáticas estrelladas (hPSCs) y células endoteliales. Sin embargo, actualmente se desconocen las funciones de los receptores específicos en los efectos de la mañana del cáncer de páncreas, hPSCs y las células endoteliales.
El presente estudio examina los efectos de la AM en las células tumorales pancreáticas humanas, hPSCs y las células endoteliales e investiga la receptores implicados en estos efectos. Nos silenciados cada uno de los receptores de
in vitro usando
siRNA y encontramos que ADMR fue el principal responsable de los efectos biológicos de la mañana en cada uno de estos tipos de células. A continuación, examinó los efectos de silenciamiento ADMR en las células de cáncer de páncreas y observamos una importante reducción del crecimiento del tumor
in vivo
. Para analizar el potencial de ADMR como un objetivo de la terapia del cáncer, que luego evaluaron los efectos de silenciamiento ADMR tanto en células de ratón que componen el microambiente tumoral y en células de cáncer humano mediante el uso de nanoliposomas DOPC para entregar especies siRNAs específicos. Este silenciamiento sistémico de ADMR no tuvo efectos perjudiciales obvios en ratones sanos, pero el desarrollo de tumores muy reducido. Por lo tanto, ADMR debería ser un objetivo importante para el futuro desarrollo de terapias de moléculas pequeñas.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y péptidos AM
células BxPC3 cáncer de páncreas y de células HUVEC líneas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas MPanc96 fueron establecidos originalmente por el Dr. Timothy J. Eberlein (St. Louis, MO) [21]. MLECs son células endoteliales microvasculares de cultivos primarios obtenidos a partir de pulmones de ratones cuyos tejidos albergar una SV40 gran antígeno T sensible a la temperatura [22]. Cuando se cultivan a temperaturas permisivas (33 ° C), las líneas celulares muestran veces consistentes con las células endoteliales poseen un fenotipo angiogénico duplicar. La transferencia de estas células endoteliales a temperaturas no permisivas (37 ° C) dio como resultado la diferenciación celular y la inducción de un estado de reposo. MLECs se cultivaron en 10% de FBS en DMEM. BxPC3 células fueron cultivadas en 10% de SFB en medio RPMI, las células MPanc96 se cultivaron en FBS al 10% en medio DMEM y las células endoteliales humanas (HUVEC) se cultivaron en FBS al 15% en MEM. Todos los medios contenían 1% de antibiótico. Se aislaron las células estrelladas pancreáticas humanas (hPSCs) utilizando el método de extensión a partir de muestras de adenocarcinoma pancreático de pacientes sometidos a resección quirúrgica y se cultivaron en 15% de FBS en DMEM [3], [23]. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. También se utilizaron las líneas celulares BxPC3 y MPanc96 de forma estable que llevan vectores shControl o shADMR y el gen de la luciferasa desarrollado en un estudio anterior [3]. La adrenomedulina (AM 52) y el antagonista adrenomedulina (AMA (AM 22-52)) fueron adquiridos de Sigma, (St. Louis, MO).
ELISA para AM
AM se detectó en condicionada medios de HPSC, HUVEC y MLECs usando un ELISA comercial. Para la recogida de los medios condicionados, líneas de células fueron cultivadas a 80% de confluencia y se lavaron con PBS y después se cultivaron durante 24 horas en sus respectivos medios libres de suero. Se recogieron los medios y se concentró usando dispositivos Centricon YM-3 de filtro (Millipore Corporation, Chicago, IL). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el reactivo Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Competitivo ELISA se llevó a cabo a continuación, utilizando un kit de detección de AM (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA; cat#EK-010-01) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. medios libres de suero concentrado respectivos sirvieron como valores de DO de control de control de reactivo y se restaron de los de todas las otras muestras. Los cálculos de concentración AM utilizan la curva estándar incluida en el kit y se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
transfección transitoria de siARN
silenciamiento de ADMR y CRLR se logró en HPSC, HUVEC y MLECs (2 × 10
4 células) usando transfección transitoria de siRNAs. Humanas y de ratón siRNAs contra el control de cada uno, y ADMR CRLR (siRNAs ID#4611, 46184, 42272, Ambion Inc. Austin, TX y por encargo del ratón siRNAs ID#Control - 1.129.089, 1.129.090; ADMR - 1129085, 1129086; CRLR - 1129087, 1129088 de Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) se transfectaron a una concentración final de 5 nM por pocillo en placas de 96 pocillos. También se analizaron los efectos de siADMR sobre las células cancerosas MPanc96. siRNA transfección se llevó a cabo con el reactivo de transfección Hiperfect (Qiagen, Valencia, CA) según el protocolo del fabricante.
Western Blot
células
MPanc96, HPSC, HUVEC y LMCE se transfectaron transitoriamente con el control de siRNA o se prepararon siRNAs contra ADMR o CRLR y después de 72 horas, los lisados celulares y las concentraciones de proteína se midieron por el reactivo BioRad. La proteína (50 mg) se cargó en 10% de geles de SDS-PAGE y transferencia Western se realizó utilizando un anticuerpo primario contra ADMR (Cat#LS-A4048 MBL International Corporation, Woburn, MA) a una dilución 1: 1000 y el uso de un anticuerpo primario contra CRLR (cat#sc-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una dilución 1: 100. La misma transferencia se volvieron a sondar para β-actina (1:200 dilución; cat#A2066 Sigma, St. Louis, MO)., Que sirvió como control de carga
RT-PCR
ARN total fue extraído de HPSC, HUVEC y las células MLEC con o sin siRNA transfección y de páncreas de ratón. DNasa se utiliza para eliminar el ADN genómico contaminante después de la purificación de ARN. La integridad del ARN se confirmó mediante la ejecución en un gel de desnaturalización, y observando claras bandas de ARNr 28S y 18S. Un control transcrito no inversa se llevó a cabo para asegurar que no ADN genómico se amplificó. RT-PCR se realizó con los cebadores AM /ADMR /CRLR humanos y de ratón para determinar su expresión y niveles de silenciamiento. La transcripción inversa fue seguido por 35 ciclos de PCR estándar (desnaturalización 1 min a 94 ° C, recocido 1 min a 63 ° C, y la extensión 1 min a 72 ° C). Cebadores diseñados para el consumo humano AM (Banco de Genes: NM_001124) fueron: 5'CGG hacia adelante GAT CCA TGA AGC TGG TTT CCG TC 3 'y revertir, 5' CGG AAT TCC AGA TAA AAG TGG GGA GC 3 '. Cebadores diseñados para ADMR humana (Banco de Genes: NM_007264) fueron: hacia adelante 5 'CAT CGC GGA CCT GGG CAT TGT 3' y revertir, 5 'TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3'. Cebadores diseñados para CRLR humana (Banco de Genes: NM_005795) fueron: reenviar 5'TGC TCT GTG AAG GCA TTT AC 3 'y revertir, 5' CAG AAT TGC TTG AAC CTC TC 3 '. Cebadores diseñados para AM ratón (Banco de Genes: NM_009627) fueron: hacia adelante 5 'CCA GGG CAG CAA TTC CCG 3' y revertir, 5 'TAT CCT CTA AAA GAG TCT GG 3'. Cebadores diseñados para ADMR ratón (Banco de Genes: NM_007412) fueron: hacia adelante 5 'CCG TTA AAC AAC TCC GGA 3' y revertir, 5 'TTA GCT GGC TAC AGA ATT GCA 3'. Cebadores diseñados para CRLR ratón (Banco de Genes: NM_018782) fueron: hacia adelante 5 'TGG CTT TTC CCA CTC TGA T 3' y revertir, 5 'TCA CAT CAC TAG ATC ATA CGT 3'. 18S cebadores sirvieron como control de carga para las reacciones de RT-PCR. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1,5% y se visualizaron con bromuro de etidio.
estudios de crecimiento de la célula
HPSC, HUVEC y MLECs (1000 células) se sembraron en placas de 96 pocillos en 0,5% de suero que contiene medios con o sin AM (0-200 nM) o AMA (1 M), que fueron actualizados diariamente, y los números de células se estimaron después de 48 horas para HPSC y células HUVEC y después de 96 horas para MLECs mediante ensayo de MTS. Para los estudios de siRNA, HPSC, HUVEC y MLECs (1000 células) se sembraron en placas de 96 pocillos y respectiva humanos y de ratón siCONTROL /siADMR /siCRLR se transfectaron y los números de células se estimaron después de 48 horas para células de HPSC y HUVEC y después de 96 horas para MLECs. El crecimiento celular se analizó utilizando el reactivo MTS añadió una hora antes de tomar la lectura espectrofotométrica de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI).
in vitro Ensayo de angiogénesis
HUVEC y MLEC (1 × 10
4) las células fueron sembradas en la superficie de la ECMatrix polimerizado preparado como se describe por el fabricante (Cat#ECM625; Chemicon Intl, Millipore Corp, Billerica, MA). Las células fueron tratadas con AM (200 nM) o AMA (1 UM) péptidos y después se evaluó la formación del tubo 6 horas bajo un microscopio de luz invertida (Olympus, Center Valley, PA). Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara refrigerada, dispositivo de carga acoplada (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) y el software SmartCapture (Científico Digital, Cambridge, Reino Unido). Las imágenes fueron tratados posteriormente con el software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Para cuantificar los acontecimientos angiogénicos, los patrones de crecimiento de las células en 10 campos al azar en 100 × magnificación se evaluó según las sugerencias del fabricante y calificó como: Las células individuales, bien separado -0; Las células migradas y alineados -1; Los tubos capilares visible, no brotación -2; Brotación de tubos capilares -3; polígonos cerrados formados - 4; y las estructuras de tipo malla complejos desarrollados -5
La tinción inmunohistoquímica -. CD31 /VEGF
4 micras sin teñir secciones de tejido de siCONTROL o siADMR ratones tratados se deparaffinized con xileno y rehidratada con etanol. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol y no específicas sitios de unión se bloquearon con solución de bloqueo de proteínas (5% de caballo normal y 1% de suero de cabra normal). El anticuerpo primario contra CD31 (1: 800 dilución; cat#01951A; BD Pharmingen, San Diego CA) /VEGF (1:100 dilución; cat#sc-152; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se añadió y se incubaron muestras la noche a 4 ° C. Se añadió anticuerpo secundario y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, los portaobjetos se revelaron con 3,3-diaminobencidina (DAB) de sustrato a contratinción con hematoxilina, se deshidrataron con etanol, se fijaron con xileno y se montaron. La inmunohistoquímica se analizó utilizando un microscopio de luz invertida (Olympus, Center Valley, PA). Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara refrigerada, dispositivo de carga acoplada (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) y el software SmartCapture (Científico Digital, Cambridge, Reino Unido). Las imágenes fueron tratados posteriormente con el software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Las láminas fueron cegados y analizados por IHC núcleo en el Dept. de Biología del Cáncer, UT MDACC.
nanoliposome DOPC acoplado siRNAs.
Para los experimentos para probar la eficacia de los
in vivo
el enfoque terapéutico de ADMR en los tumores ortotópico en ratones, se prepararon liposomas neutros que contienen siRNAs como se describe anteriormente [24]. En pocas palabras, los oligonucleótidos siRNA (sin horquillas) a ADMR secuencias diana (siADMR humana (sentido - 5 'rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3'); ratón siRNA secuencia con sentido - 5 'rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3') o secuencias de control (control de los sentidos siRNA secuencia - 5 'UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3' ) (por encargo del gato oligos humanos y de ratón#humano siADMR - 1150080, 1150081; ratón siADMR - 1129085-H, 1129086-H; control - 1.129.089, 1.129.090 de Sigma-Aldrich (Proligo), St. Louis, MO) se mezclaron con 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, aL) en una proporción de 10:01 (w /w) DOPC /siRNA y se liofilizó. Inmediatamente antes de
la administración in vivo
, preparaciones liofilizadas se hidrataron en 0,9% de solución salina a una concentración de 10 g de siRNA por 200 l y se purificaron mediante la separación de siRNA libre de liposomas con unidades de filtro con un límite de exclusión por tamaño de 30.000 dalton (Millipore Corp, Billerica, MA).
la glucosa prueba de tolerancia.
Para tolerancia a la glucosa, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 1,5 mg de peso g de glucosa /cuerpo a las 9:00 am, después de un joven de 16 horas de ayuno. La glucosa en sangre se determinó a los tiempos indicados con muestras de sangre de la cola obtenidos mediante el glucómetro Ascensia CONTOUR la sangre (Bayer Cuidado de la Salud, Tarrytown, NY).
En vivo
estudios.
Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con las buenas prácticas animal definidas en los órganos de carácter nacional y /o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el comité correspondiente (IACUC - 09-04-08832). Se desarrollaron
modelo ortotópico tumor.
células MPanc96 y BxPC3 que llevan shADMR o shControl como se ha mencionado en una publicación anterior [3]. Estas células de cáncer de páncreas fueron modificados adicionalmente para expresar de forma estable el gen de luciferasa de luciérnaga por transfección lentivirus para facilitar
in vivo
seguimiento del desarrollo del tumor [25]. Estas células fueron cultivadas a 80% de confluencia, se recogieron por tripsinización, se lavaron dos veces en PBS, y se resuspendieron a una concentración final de 1 × 10
6 células /50 ul de células MPanc96 y 2 × 10
6 células /50 ul de células BxPC3 en PBS estéril y se inyecta en el páncreas de cuatro semanas de edad
atímicos desnudos
ratones (n = 5). El crecimiento del tumor fue evaluada por imágenes de bioluminiscencia al final de cuatro semanas.
modelos de metástasis hepáticas de pulmón y
. Se realizaron comparaciones entre pulmón y metástasis hepáticas en las células que llevan MPanc96 células shADMR o shControl utilizando modelos de metástasis bien establecidos. Las metástasis pulmonares se desarrollaron mediante inyección en la vena caudal de 1 × 10
6 células /100 ul (n = 9) y metástasis hepáticas mediante inyección esplénica de 1 × 10
6 células /50 ul (n = 7) a
atímicos desnudos
ratones y evaluados por imágenes de bioluminiscencia. Después de seis semanas, los ratones fueron sacrificados y los órganos se extirparon y se almacenaron en solución fijador de Bouin.
Entrega de nanoliposome DOPC junto siRNAs.
Para la evaluación de la toxicidad potencial, se llevaron a cabo experimentos nanoliposome entrega de DOPC junto siCONTROL o siADMR (ratón) en
ratones desnudos atímicos (10 ug por ip animales dos veces al semana durante cuatro semanas). El agua y la ingesta de alimentos, el peso corporal y los niveles de glucosa en sangre se midieron. Se sacrificaron los animales después de cuatro semanas, se aisló el páncreas y se extrajo el ARN total. RT-PCR se utilizó para evaluar el silenciamiento de ADMR, mientras 18S sirvió como control interno. ortotópico tumores se desarrollaron en
nude
ratones atímicos con células MPanc96 que lleva el gen de la luciferasa (1 × 10
6 células /50 ul de PBS estéril) y dos semanas más tarde, DOPC nanoliposome junto siCONTROL y siADMRs (humana y el ratón en combinación) se entregaron 10 ug por ip animales dos veces a la semana durante seis semanas. Imágenes de bioluminiscencia. Imágenes de bioluminiscencia se realizó utilizando un sistema de imagen criogénicamente enfriado acoplado a un ordenador de adquisición de datos que ejecuta el software LivingImage (Xenogen Corp., Alameda, CA). Antes de formación de imágenes, los animales fueron anestesiados en una cámara de acrílico con la mezcla de isofluorano /aire 1,5% y se inyectaron i.p. con 40 mg /ml de sal de luciferina de potasio en PBS a una dosis de 150 mg /kg de peso. Una imagen en escala de grises de los animales digital fue adquirido seguido de adquisición y superposición de una imagen en pseudocolor que representa la distribución espacial de los fotones detectados que salen de la luciferasa activa dentro del animal de. la intensidad de la señal se cuantificó como la suma de todos los fotones detectados en la región de interés por segundo. Después de la formación de imágenes del tumor final, los tejidos se retiraron y los animales fueron re-captación de imagen para visualizar y contar difusión de células cancerosas y metástasis. Los tejidos también se fijaron con formaldehído y la histología fue evaluado para verificar la exactitud de los datos de bioluminiscencia.
Análisis estadístico
Todo
in vitro
en experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se llevó a cabo en tres o más ocasiones separadas. Los datos presentados son la media de los tres o más experimentos independientes ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias estadísticamente significativas entre los controles y las muestras tratadas se determinaron mediante la prueba t de dos colas de Student no pareada y se definieron como * p & lt; 0,05. Los resultados fueron comparados usando el software GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, http://www.graphpad.com).
Resultados
AM tiene efectos autocrinos en HPSC, células HUVEC y LMCE
Previamente observamos que AM sirve como un regulador autocrino de la proliferación, la supervivencia y la motilidad de las células de cáncer de páncreas [3]. Para determinar si AM también influyó HPSC, HUVEC y MLECs, se analizó en primer lugar si se expresan AM y sus receptores ADMR y CRLR medido por RT-PCR. Las tres líneas celulares expresaron AM, ADMR y CRLR (Fig. 1A). Además, se evaluó si estas células secretadas AM en los medios de cultivo de tejidos usando un ELISA. Todos estos tipos de células AM secretada (Fig. 1B), apoyando el papel de esta molécula como un regulador autocrino en múltiples tipos de células. Para examinar los efectos de la AM sobre la biología de estas células, exógena AM fue agregado a HPSC (Fig. 1C), HUVEC (Fig. 1D) y LMCE (Fig. 1E) las células y la proliferación se evaluó mediante el ensayo de MTS. Estudios anteriores indicaron que la concentración óptima de AM era 50 nM para HPSC y 200 nM para HUVEC y las células MLEC (datos no mostrados). La adición de AM a las concentraciones óptimas estimuló el crecimiento de hPSCs por 29 ± 1,8% (p & lt; 0,05), HUVECs por 25 ± 3,7% (p & lt; 0,05) y MLECs por 33 ± 4,5% (p & lt; 0,05). Además, la adición del antagonista AM, AMA (1 uM), redujo el crecimiento basal de hPSCs por 21 ± 5,3% (p & lt; 0,05), HUVECs por 21 ± 0,4% (p & lt; 0,05) y MLECs por 25 ± 5,1% ( p & lt; 0,05) más el apoyo a una función autocrina de AM en estas células. Para examinar más a fondo los efectos de la mañana y nos llevó a cabo
in vitro
ensayos de angiogénesis. AM estimuló la formación de polígono en HUVEC (Fig. 1F) y en MLECs (Fig. 1G) a las 6 horas en comparación con los cultivos control, y AMA bloquea los efectos mediados por la mañana de la formación de polígono.
(A) RT-PCR muestra la expresión de AM, ADMR, y CRLR en HPSC, HUVEC y MLECs. ensayo (B) ELISA que muestra la secreción de AM de HPSC, células HUVEC y LMCE. Se recogieron los medios libres de suero se bañan estas células y se concentraron y se ensayaron para la presencia de AM. Los niveles se calculan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (C) HPSC, (D) HUVEC, o (E) células MLEC (1000 células) se sembraron en placas de 96 pocillos y AM (50 nM para HPSC y 200 nM para HUVEC y MLEC) o AMA (1 uM) se añadieron a las placas diarias y los números de células se estimaron después de 48 horas para HPSC y células HUVEC y después de 96 horas para MLECs mediante ensayo de MTS. Cuando se compara con el grupo de control WT, AM estimuló la proliferación de los tres tipos de células. Asimismo, el tratamiento AMA inhibió la proliferación basal de todas las células. Los datos mostrados son medias +/- SEM (* p & lt; 0,05).
in vitro
ensayos de angiogénesis en se llevaron a cabo con HUVEC (F) y (G) células MLEC. Las células se sembraron en matriz CE junto con AM (200 nM) solo o en combinación con AMA (1 uM). Después de 6 horas se evaluó la formación del tubo microscópicamente como por las instrucciones del fabricante. Se muestra son micrografías representativas. AM estimulado constantemente células HUVEC y LMCE para formar tubos, mientras que la AMA revierte los efectos de la AM.
Los efectos de la AM en las células HPSC, HUVEC y LMCE están mediados a través del receptor ADMR
Hay dos posibles receptores que responden a AM, ADMR y CRLR. Hemos informado anteriormente de que las células de cáncer de páncreas humanos expresan exclusivamente ADMR mientras que las células HPSC y HUVEC expresan tanto receptores de AM [3]. En el presente estudio, se observó que MLECs también expresan ambos receptores. Para determinar la importancia relativa de estos receptores que los silenció independientemente en estas tres líneas celulares utilizando técnicas de siRNA. La transfección con siRNA redujo significativamente los niveles de cualquiera de ADMR o CRLR en HPSC (Fig. 2A), HUVEC (Fig. 2B) y MLECs (Fig. 2C) en comparación con el control de siRNAs. HPSC, HUVEC y MLECs silenciados con siRNA, ya sea para ADMR o CRLR fueron examinados en los ensayos de crecimiento donde se estima el número de células usando el método MTS. El silenciamiento de ADMR, pero no CRLR, redujo significativamente el crecimiento de todos estos tipos de células. El silenciamiento de ADMR redujo el crecimiento de HPSC por 21 ± 3,4% (p & lt; 0,05) (Fig. 2D), HUVECs por 24 ± 1,8% (p & lt; 0,05) (Fig. 2E) y MLECs por 26 ± 4,3% (p & lt; 0,05) (Fig. 2F). El silenciamiento de ADMR en HUVEC (Fig. 2G) y MLECs (Fig. 2H) suprimió completamente AM mediada la formación del tubo, mientras que el silenciamiento de CRLR la formación del tubo parcialmente reducida. Estos datos sugieren colectivamente que los efectos autocrinos de AM en las células HPSC, HUVEC y LMCE se mediada principalmente a través del receptor de ADMR aunque CRLR también puede tener algunos efectos.
(A) HPSC y (B) las células HUVEC fueron transitoriamente transfectadas con siRNAs humanos y células (C) MLEC fueron transfectadas con siRNAs de ratón (siCONTROL, siADMR, o siCRLR). Después se recogieron las células 72 horas y se extrajo la proteína o ARN. transferencia Western utilizando anticuerpos humanos muestra el grado de silenciamiento de ADMR humana y CRLR en HPSC y células HUVEC, y RT-PCR usando los cebadores de ratón muestra los efectos de ratón siADMR y siCRLR en MLECs. ß-actina sirvió como control de carga para el Western Blot y los cebadores 18S sirvieron como control de carga para la RT-PCR. geles de longitud completa se presentan en la Figura S1. Los efectos sobre la proliferación de ARNsi mediada por silenciamiento de los receptores se muestran en las células MLEC (D) HPSC, (E) HUVEC, y (F). Las células fueron transfectadas con sus respectivos siRNAs humanos o de ratón (siCONTROL, siADMR, o siCRLR) durante 24 horas a continuación, la proliferación se estimó por el ensayo de MTS Después de 48 horas adicionales para HPSC y células HUVEC y 96 horas para MLECs. El silenciamiento de ADMR pero no CRLR causó una reducción significativa de la proliferación de estas células. Los datos mostrados son medias +/- SEM (* p & lt; 0,05).
in vitro
Ensayo in angiogénesis con HUVEC (G) y (H) células MLEC. Las células se sembraron en placas de gel de matriz de 24 horas después de la transfección con sus respectivos siRNAs humanos o de ratón (siCONTROL, siADMR, o siCRLR). Las células se trataron luego con AM (200 nM) durante 6 horas y se examinaron microscópicamente. La extensión de la formación del tubo se evaluó según las instrucciones del fabricante. se muestran micrografías representativas. ADMR silenciar la formación del tubo completamente bloqueada, mientras que CRLR silenciar la formación del tubo sólo redujo parcialmente.
El silenciamiento de ADMR en las células de cáncer de páncreas reduce el crecimiento tumoral y la metástasis
in vivo
Para examinar los efectos de ADMR silenciamiento en las células cancerosas, se observó el crecimiento de los tumores ortotópico formados a partir de dos líneas celulares de cáncer de páncreas diferentes transfectadas con cualquiera de shADMR o shControl. Los volúmenes tumorales se midieron después de 4 semanas de imágenes de bioluminiscencia. El volumen del tumor se redujo en un 92 ± 0,5% en ADMR silenciados MPanc96 tumores en comparación con el control de tumores que llevan vector (P & lt; 0,05) (Fig 3A.). Del mismo modo, el volumen del tumor BxPC3 se redujo significativamente en un 83 ± 0,6% después de ADMR silenciamiento comparación con el control tumores (p & lt; 0,05) (Fig 3B.). En ambos casos, también hubo una reducción en la metástasis de pulmón y en el hígado y una reducción de la diseminación peritoneal. Sin embargo, debido a silenciamiento ADMR redujo el volumen del tumor; cualquier reducción en la metástasis puede haber sido debido a la reducción general en el volumen del tumor.
ortotópico tumores se desarrollaron con células establemente silenciados con shADMR y que expresan el gen de la luciferasa MPanc96 (A) o BxPC3 (B). Después de 4 semanas, el volumen del tumor se estimó por imágenes de bioluminiscencia y mostró una reducción significativa entre ADMR y shControl tumores que llevan vector de ambos tipos de células. Los datos mostrados son medias +/- SEM para 10 animales por grupo. (* P & lt; 0,05) también se proporcionan imágenes de bioluminiscencia de ratones representativos
El silenciamiento de ADMR en las células de cáncer de páncreas reducida metástasis
in vivo
Para evaluar directamente. el papel de ADMR en el pulmón cáncer de páncreas y metástasis hepáticas, que lleva a cabo estudios separados en
Tarjetas telefónicas ratones desnudos por la vena de la cola y la inyección esplénica, respectivamente. silenciamiento ADMR redujo la incidencia de metástasis de pulmón (ShControl - 67% Vs ShADMR - 22%) medida por imágenes de bioluminiscencia (Fig 4A.). Además, la presencia de metástasis detectable usando imágenes de bioluminiscencia se pospuso desde el 2
nd semanas en los animales control a 5
TH semanas en las células que llevan shADMR. pulmones extirpados después de la fijación en solución de Bouin mostraron una reducción en el número de focos metastásicos de pulmón como se muestra en la imagen representativa (Fig. 4C). Los efectos de ADMR silenciar en la metástasis de hígado fueron similares a los de la metástasis de pulmón. silenciamiento ADMR redujo la incidencia de la metástasis del hígado (ShControl - 100% Vs ShADMR - 43%) (Fig 4B.). La presencia de metástasis detectables se pospuso desde el 2
ª semana hasta que el 5
ª semana. Reducción en el número de focos metastásicos del hígado se muestra como una imagen representativa (Fig. 4D). Estos datos indican que la AM puede actuar como un inductor de la metástasis de células de cáncer pancreático y estos efectos de la AM en las células cancerosas están mediadas a través de la ADMR receptor.
MPanc96 se inyectaron las células que llevan gen de la luciferasa de forma estable transfectada con células shControl o shADMR en la vena caudal para medir la metástasis de pulmón y en el bazo para medir la metástasis de hígado. Los animales que lleven células ADMR silenciada mostraron una reducción en la incidencia de cáncer de pulmón (A) y metástasis hepáticas (B) según lo medido por imágenes de bioluminiscencia. Después de 6 semanas los ratones fueron sacrificados y los pulmones y el hígado también se extirparon y se examinaron groseramente e histológicamente. silenciamiento estable de ADMR redujo el número de focos metastásicos en los pulmones y el hígado en comparación con shControl. Representante imágenes muestran la reducción en el número de focos metastásicos en los pulmones (C) y (D) hígados.
I
n vivo
focalización de ADMR mediante la administración sistémica de siRNAs es altamente eficaz a reducir el crecimiento del tumor
Nuestros datos apoyan el papel de ADMR en los efectos de la AM en las células de cáncer de páncreas.