Extracto
Recientes estudios epidemiológicos que implican diferencias en la recurrencia del cáncer basado en regímenes anestésicos aumentar la posibilidad de que el receptor opioide mu (MOR) puede influir en la progresión del cáncer. Sobre la base de nuestras observaciones anteriores que la sobreexpresión de MOR en células humanas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se incrementó el crecimiento tumoral y la metástasis, este estudio examinó si MOR regula la señalización del receptor del factor de crecimiento epitelial y mesenquimal (EMT) en las células NSCLC humanos. Hemos utilizado siRNA, shRNA, inhibidores químicos y vectores de sobreexpresión en células H358 NSCLC humanos que estaban sin tratar o tratados con diversas concentraciones de DAMGO, morfina, fentanilo, EGF o IGF. a continuación, se realizaron ensayos de la función celular, inmunotransferencia y ensayos de inmunoprecipitación. Nuestros resultados indican MOR regula opioide y la señalización del receptor EGF inducida por el factor de crecimiento (Src, Gab-1, PI3K, Akt y STAT3 activación), que es crucial para la proliferación de células NSCLC consiguiente humano y la migración. Además, las células de NSCLC humanos tratados con opioides, factores de crecimiento o la sobreexpresión MOR exhibieron un aumento de caracol, barra y vimentina y disminuir ZO-1 y claudin-1 los niveles de proteína, los resultados de acuerdo con un fenotipo de EMT. Además, estos efectos se invirtieron con silenciamiento (shRNA) o la inhibición química de MOR, Src, Gab-1, PI3K, Akt y STAT3 (p & lt; 0,05). Nuestros datos sugieren un posible efecto directo de MOR en opioide y el factor de crecimiento de señalización y la consiguiente proliferación, la migración y la transición EMT durante la progresión del cáncer de pulmón. Tal efecto proporciona una explicación plausible de los hallazgos epidemiológicos
Visto:. Lennon FE, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, Poroyko VA, Salgia R, Moss J, et al. (2014) El receptor opioide Mu Promueve opiáceos y del factor de crecimiento inducido por la proliferación, migración y epitelial mesenquimal transición (EMT) en el cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10.1371 /journal.pone.0091577
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: 16 Septiembre, 2013; Aceptado: 13 Febrero 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Lennon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo fue provisto de fuentes institucionales y /o departamentales y Institutos nacionales de Salud conceder CTSA UL1 TR000430. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Metilnaltrexona fue desarrollado en la Universidad de Chicago y con licencia para Progenics Pharmaceuticals, posteriormente sub -licensed de Salix farmacéuticos. Dr. Moss fue un consultor pagado por Progenics farmacéuticos y actualmente es un consultor pagado por Salix farmacéuticos. Él recibe regalías a través de la Universidad de Chicago. No hay patente (s) o de las solicitudes de patentes relacionadas con las materias pertinentes a este artículo. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El papel de la anestesia y la analgesia en la recurrencia y la tasa de metástasis de tumores malignos recientemente ha recibido una considerable atención [1], [2], [3], [4]. Los estudios retrospectivos han demostrado una incidencia disminuida de recurrencia del cáncer después de la anestesia regional con dosis más bajas de opioides después de la cirugía de mama, de próstata, cáncer de colon y melanoma, aunque otros estudios no han podido detectar diferencias significativas [5], [6], [7] , [8]. Algunas hipótesis para explicar estas diferencias en las tasas de recurrencia incluyen efectos supresores inmunes y efectos directos sobre el crecimiento de células tumorales [9], [10], [11]. Nuestra investigación se ha centrado en el receptor opioide mu (MOR) y su papel en la regulación directamente cambios celulares que conducen al crecimiento del tumor y la metástasis [4], [12], [13].
estrategias terapéuticas eficaces para el cáncer de pulmón , la principal causa de mortalidad asociada al cáncer en todo el mundo, son extremadamente limitados ejemplificando la necesidad de un diagnóstico precoz y nuevas intervenciones terapéuticas [14], [15]. Hemos informado anteriormente de que el MOR está regulada positivamente en varios tipos de cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM) [12]. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de MOR en NSCLC humanos aumenta crecimiento del tumor primario y metástasis en modelos de xenoinjerto [13]. Sin embargo, los cambios celulares exactas regulados por MOR en el CPNM no están completamente definidos [4]. Para las células cancerosas para crecer y metastatizar, es necesario que haya una pérdida de adhesión célula-célula (que se caracteriza por una reducción de las proteínas de adhesión celular epitelial, incluyendo las proteínas de unión estrecha, ZO-1 y claudin-1), seguido de adquisición de características mesenquimales incluidos una pérdida de polarización baso-apical, la remodelación del citoesqueleto y el aumento de la motilidad celular (caracterizada por el aumento de las proteínas del citoesqueleto específicos (es decir, vimentina) y factores de transcripción (es decir, babosas y caracoles) [16], [17], [18], [19] . Este proceso oncogénico orquestada se conoce como transición epitelio mesénquima (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].
Crecimiento receptores de factores, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), a menudo se sobreexpresa y /o mutadas en NSCLC y regulan procesos oncogénicos, incluyendo proliferación de células tumorales, la migración y EMT transición [23], [24], [25], [26] , [27]. Varias terapias dirigidas al EGFR en CPNM existen incluyendo inhibidores de la tirosina quinasa (gefitinib, erlotinib) y anticuerpos monoclonales (cetuximab) [28], [29], [30], [31]. Sin embargo, la tasa de supervivencia global para el NSCLC sigue siendo baja [32], [33], [34]. Recientemente, Fujioka et al., Han demostrado que la morfina puede estimular las vías de señalización de EGFR, incluyendo la serina /treonina quinasas Akt y MAP quinasa en NSCLC que sugiere un papel para la inhibición MOR como una estrategia terapéutica potencial para el NSCLC [35].
Basado en el reciente interés de los efectos de la anestesia y la analgesia regímenes en la recurrencia y el potencial metastásico de diversos tipos de cáncer [1], [2], [3], [4], nuestros datos publicada anterior indicando el MOR es upregulated en pulmón tejido de pacientes con NSCLC [12], la sobreexpresión de MOR promueve el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos humanos de NSCLC de xenoinjertos [13], así como los datos de Fujioka et al., demostrando la regulación MOR de eventos de señalización inducida por EGF en NSCLC [35], este estudio investigó los efectos funcionales de MOR en los procesos oncogénicos fundamentales de opioide y el factor de crecimiento inducido por la migración de células de pulmón humano, la proliferación y la transición epitelio mesénquima (EMT) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Dado que hay muy poca información sobre los opioides y /o regulación MOR de la EMT y los mecanismos moleculares que integran proliferación de células cancerosas, la migración y la EMT Actualmente, este estudio investigó los mecanismos moleculares detallados de estos eventos que pueden tener utilidad clínica potencial.
Métodos
Cultivo celular y reactivos
La célula humana NSCLC H358 se obtuvo de la ATCC (Walkersville, MD) y se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute medio completo (Cambrex, East Rutherford, NJ) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO2, 95% de aire, con pasajes 6-10 utilizados para la experimentación. A menos que se especifique lo contrario, los reactivos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). Los reactivos para electroforesis SDS-PAGE se adquirieron de Bio-Rad (Richmond, CA) y la membrana de transferencia Immobilon-P se adquirió de Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA). anticuerpo anti-MOR conejo se adquirió de GeneTex (San Antonio, TX). Conejo anti-EGFR, conejo anti-fosfo-EGFR (PY
845, Py
992, Py
1045, Py
1068), de conejo anti-Grb-2, de conejo anti-Gab-1 , conejo anti-fosfo-Gab-1 (pY
307, py
627), de conejo anti-Src, conejo anti-fosfo-Src (pY
416), de conejo anti-p85 de PI3 quinasa, conejo anti-p55 de PI3 quinasa, conejo anti-fosfo-p85 /p55 de PI3 quinasa (pY
458, py
199), de conejo anti-STAT3, conejo anti-fosfo-STAT3 (pY
705), conejo anticuerpos anti-Slug anti-vimentina, conejo anti-ZO-1, de conejo anti-claudin-1, de conejo anti-Snail y de conejo fueron adquiridos de Tecnologías de señalización celular (Danvers, MA). Ratón anticuerpo anti-β-actina fue comprado a Sigma (St. Louis, MO). anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante secundaria se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). bromuro de N-metilnaltrexona o metilnaltrexona se adquirió de Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). El inhibidor de PI3 quinasa LY294002, Akt inhibidor de X, la familia quinasa Src PP2 inhibidor y el inhibidor de STAT3 Stattic se adquirieron de EMD Biosciences (Billerica, MA).
Immunoblotting
inmunotransferencia se realizó como se nos han descrito previamente. materiales celulares a partir de células de NSCLC humanos tratados o no tratados se incubaron con tampón de lisis (HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl 20 mM
2, 1% de Triton X-100, 0,1% SDS, Na 0,4 mM
3Vo
4, 40, 50 M de ácido ocadaico, 0,2 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1:250 dilución de la mezcla de Calbiochem inhibidor de la proteasa 3). Las muestras fueron luego se ejecutan en SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 4-15%, se transfirió a membranas Immobilon ™, y desarrollado con anticuerpos primarios y secundarios específicos. La visualización de las bandas inmunorreactivas se consiguió usando quimioluminiscencia mejorada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). En algunos casos, las bandas inmunorreactivas se cuantificaron mediante densitometría asistida por ordenador.
pequeños ARN de interferencia transfección en células de NSCLC humanos
control estable y, o bien MOR, Gab-1, o Src siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se transfectaron en células H358, como hemos descrito previamente [12]. Las células (~ 40% confluentes) fueron suero de hambre durante 1 hora seguido por incubaron con siRNA durante 6 horas en medio libre de suero. a continuación, se añadió medio que contenía suero (10% de suero de concentración final) durante 42 horas. La inhibición de la expresión de la proteína se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia con anticuerpos específicos.
control estable y MOR pequeña horquilla de ARN transfección en células de NSCLC humano
control estable y MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) fueron transfectadas de forma estable en células H358 como hemos descrito anteriormente [12]. Las células (~ 40% confluentes) fueron suero de hambre durante 1 hora seguido por incubaron con shRNA durante 6 horas en medio libre de suero. a continuación, se añadió medio que contenía suero (10% de suero de concentración final) durante 42 horas y se añadió reactivo de selección de puromicina. La inhibición de la expresión de la proteína se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia con anti-anticuerpo MOR (GeneTex, San Antonio, TX).
Estable Control de Vectores y MOR1 La sobreexpresión en las células NSCLC humanos
etiquetada-Myc-DDK
ORF clon de Homo sapiens receptor opioide, mu 1 (OPRM1), variante de transcripción MOR-1 (OriGene Technologies Inc, MD) se amplificó usando la enzima Taq ADN polimerasa Platinum de alta fidelidad (Invitrogen, CA) y posteriormente se clonó en un pCR8 /GW /Topo entrada vector (Invitrogen, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se extrajo a partir de clones seleccionados por QIAquick plásmido Mini kit (Qiagen, CA). ORF integridad y fragmento de la orientación se confirmaron por secuenciación. A continuación, el producto de fusión MOR1-Myc se transfirió al vector pcDNA3.2 /V5 DEST (Invitrogen, CA) por reacción LR. La construcción resultante (pcDNA3.2-MOR1-Myc) se transfectó en células H358 utilizando Fugene HD ™ como el reactivo de transfección (Roche Applied Sciences) de acuerdo con el protocolo proporcionado por Roche como hemos descrito anteriormente. Las células (~ 40% confluentes) fueron suero de hambre durante 1 hora seguido de incubación con pcDNA3.2-MOR1-Myc durante 6 horas en medio libre de suero. a continuación, se añadió medio que contenía suero (10% de suero de concentración final) durante 42 horas y se añadió reactivo de selección neomicina. La sobreexpresión se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia con anti-anticuerpo MOR (GeneTex, San Antonio, TX).
NSCLC humano Ensayo de proliferación celular
La medición de
in vitro
el crecimiento celular en el CPNM se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. De control o siRNA pretrataron células H358 (5 × 10
3 células /pocillo) se incubaron con 0,2 ml de medio libre de suero que contiene vehículo (control), metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor de X (5 uM), la familia PP2 Src inhibidor de quinasa (100 nM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (10 uM) durante 72 horas a 37 ° C en 5% de aire CO2 /95% en cultivo de 96 pocillos platos. La
vitro
ensayo de proliferación celular se analizó en midiendo los aumentos en el número de células usando el ensayo de MTS CellTiter96 ™ (Promega, Madison, WI) y se leyó a 492 nm. Cada ensayo se estableció por triplicado y se repitió al menos cinco veces.
NSCLC humano Ensayo de Migración Celular
La medición de
in vitro
CPNM la migración celular se realizó como lo hemos hecho anteriormente descrito. Se utilizaron veinticuatro unidades transwell con tamaño de 8 M de poro (Millipore, Billerica, MA) para el seguimiento de
in vitro
la migración celular como hemos descrito anteriormente [12]. De control o siRNA pretrataron células H358 (5 × 10
3 células /pocillo) se incubaron con 0,2 ml de medio libre de suero que contiene vehículo (control), metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor X (5 M), la familia Src PP2 inhibidor de quinasa (100 nM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (10 uM) se sembraron en la cámara superior y se añadió medio con suero a la cámara inferior. Las células se dejaron migrar a través de los poros durante 18 horas. Las células de la cámara superior e inferior se cuantificaron utilizando el ensayo CellTiter96 ™ MTS (Promega, San Luis Obispo, CA) y se leyeron a 492 nm. migración% se definió como el#de células en la cámara inferior, dividido por el número de células, tanto en la cámara superior e inferior. Cada ensayo se estableció por triplicado y se repitió al menos cinco veces.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Para el análisis de datos, las muestras experimentales se compararon con los controles de la prueba t de Student para datos independientes. Para las comparaciones de múltiples grupos, se utilizaron un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y pruebas post hoc de comparaciones múltiples. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas cuando
P
valor era inferior a 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EE.UU.).
Resultados
Nuestros resultados en la Figura 1 indican que la inhibición de MOR MOR con el antagonista periférico MNTX atenúa EGF proliferación inducida (Figura 1-a) y la migración (figura 1-B) de las células H358 NSCLC humanos en una manera dependiente de la dosis. Estos datos sugieren un vínculo entre MOR y el EGFR en células H358. Para evaluar de manera mecánica el papel de MOR en la dinámica de EGFR inducida por EGF, se trataron las células con EGF H358 en diversos momentos y se inmunoprecipitaron del EGFR para determinar el potencial asociación MOR. La figura 2-A demuestra que EGF induce una formación de complejos entre el EGFR y MOR que culmina a 5 a 15 minutos después de la exposición EFG. En base a los resultados que un complejo MOR /EGFR puede ocurrir con la estimulación de EGF de las células H358, el próximo examinó si MOR puede regular la fosforilación de EGFR. Utilizando un panel de anticuerpos anti-fosfo-EGFR, la figura 2-B demuestra que el pretratamiento de células de NSCLC humano H358 con el antagonista MOR periférica MNTX no para atenuar la fosforilación de EGFR de tirosina inducida por EGF
Panel A:. H358 humano se analizaron las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) para metilnaltrexona (MNTX) inhibición de la proliferación mediada por EGF utilizando un ensayo de proliferación de MTS. Las células fueron crecimiento en presencia de 100 ng /ml de EGF y /o 0 a 250 nM durante 72 horas MNTX. MNTX Hay una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, indicado por un asterisco) entre el control y MNTX tratamiento (10, 50, 100, 250 nM) con n = 3 por condición y barras de error = desviación estándar. Vea la sección Métodos para más detalles experimentales. Panel B: Se analizaron las células H358 humano no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) de metilnaltrexona (MNTX) inhibición de la migración mediada por EGF utilizando un ensayo transwell (8 um de tamaño de poro). Las células se dejaron migrar en la presencia de 100 ng /ml de EGF y /o 0 a 250 nM durante 18 horas MNTX. Existe una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, indicado por un asterisco) entre el control y MNTX tratamiento (50, 100, 250 nM) con n = 3 por condición y barras de error = desviación estándar. Vea la sección Métodos para más detalles experimentales
Panel A:. H358 humano no pequeñas de cáncer de pulmón de células células (NSCLC) fueron tratados sin (control) o 100 ng /ml de EGF durante 5, 15, o 30 minutos. Los lisados celulares se obtuvieron y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-EGFR. Las inmunotransferencias se realizaron en lisados de células totales (izquierda) y material inmunoprecipitado (derecha) usando anti-MOR (a) y anti-EGFR (b) anticuerpos. El receptor opioide mu es reclutado al EGFR con la estimulación de EGF. Panel B: H358 humano no pequeñas de cáncer de pulmón de células células (NSCLC) se dejaron sin tratar (control) o se trataron con 100 nM MNTX solo, 10 ng /ml EGF durante 5, 15 o 30 minutos, o 100 nM MNTX y 10 ng /ml EGF durante 5, 15, o 30 minutos. Los lisados celulares se obtuvieron y a inmunotransferencia utilizando anti-Py
845 EGFR (a), anti-Py
992 EGFR (b), anti-Py
1045 EGFR (c), anti-Py
1068 EGFR (d), anti-EGFR (e) y anti-actina (e) anticuerpos. MNTX no inhibe la fosforilación de la tirosina de EGFR inducida por EGF.
A continuación examinó si MOR puede regular EGFR aguas abajo moléculas de señalización. Examinamos primero el adaptador de proteínas, la proteína unida al receptor del factor de crecimiento 2 (Grb-2), que contiene un dominio SH2 y dos dominios SH3 y se puede unir directamente el EGFR [36]. Los resultados de la figura 3-A demuestran, utilizando la inmunoprecipitación de EGFR y la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Grb-2, que induce EGF de EGFR Grb-2 formación del complejo /que está atenuada por el pretratamiento de las células H358 con MNTX. El reclutamiento de Grb-2 para el EGFR es importante para el reclutamiento de la membrana plasmática y la consiguiente fosforilación de la tirosina de la proteína de andamiaje, Grb2-asociado-proteína de unión 1 (Gab-1) [37]. Figura 3-B indica que la estimulación de las células H358 EGF induce la fosforilación de la tirosina de Gab-1 (Tyr307 y Tyr627) que culmina a ~ 5 minutos y se atenúa por la inhibición MOR con MNTX
Panel A:. H358 humano no cáncer de pulmón de células no pequeñas células (NSCLC) se dejaron sin tratar (control) o tratadas con 100 nM MNTX (1 hora antes de la incubación), 10 ng /ml de EGF durante 15 minutos, o 100 nM MNTX y 10 ng /ml de EGF. Los lisados celulares se obtuvieron y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-EGFR. Las inmunotransferencias se realizaron en lisados de células totales y material inmunoprecipitado usando anticuerpos anti-Grb-2 (a, c) y anti-EGFR (b, d) de anticuerpos. MNTX inhibe el reclutamiento inducida por EGF de Grb-2 para el EGFR. Panel B: H358 humano no pequeñas de cáncer de pulmón de células células (NSCLC) se dejaron sin tratar (control) o se trataron con 100 nM MNTX solo, 10 ng /ml EGF durante 5, 15 o 30 minutos, o 100 nM MNTX y 10 ng /ml EGF durante 5, 15, o 30 minutos. Se obtuvieron los lisados celulares y a inmunotransferencia utilizando anti-PY
627 Gab-1 (a), anti-PY
307 Gab-1 (b) y anti-actina (c) anticuerpos. MNTX atenúa inducida por EGF Gab-1 fosforilación de la tirosina.
Desde la fosforilación de tirosina de Gab-1 por varias tirosina quinasas Src incluyendo promueve la unión a moléculas de señalización, incluyendo fosfatidilinositol 3-quinasas (PI3K) y que generan PIP3 activar los efectores incluyendo Akt y STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], el próximo examinó si la inhibición MOR también puede influir en Gab-1 vinculante /moléculas efectoras. La Figura 4-A muestra que, como Gab-1, EGF desafío de las células H358 induce la fosforilación de la tirosina de Src (Tyr416), el regulador PI3K alfa p85 subunidades y p55 (Tyr458 /Tyr199), y el factor de transcripción STAT3 (Tyr705), que pico en ~ 5 minutos y son atenuados por la inhibición MOR con MNTX de una manera estadísticamente significativa (Figura 4-B)
Panel a:. células H358 humano cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) se dejaron sin tratar (control ) o se trataron con 100 nM MNTX solo, 10 ng /ml EGF durante 5, 15 o 30 minutos, o 100 nM MNTX y 10 ng /ml EGF durante 5, 15, o 30 minutos. Se obtuvieron los lisados celulares y inmunotransferencia utilizando anti-fosfo-Src (PY
416) (a), anti-fosfo-p85 /p55 de PI3 quinasa (PY
458 /Py
199) (b, c) , anti-fosfo-STAT3 (pY
705) (d) y anti-actina (e) anticuerpos. Panel B: cuantificación gráfica de la inmunorreactividad de los experimentos realizados se describe en la figura 3-B y Panel A con la normalización a un total de proteína específica y n = 3 experimentos independientes por condición. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) de control. Las barras de error = desviación estándar.
A continuación examinó el mecanismo por el cual EGF y DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol] -enkephalin), un péptido opioide sintético con especificidad para MOR) inducir la proliferación y la migración. La Figura 5 ilustra que siRNA y /o la inhibición química de MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt y STAT3 disminuyen significativamente EGF y la proliferación inducida por DAMGO (Figura 5-A) y la migración (Figura 5-B).
Panel a: se analizaron las células H358 de cáncer no microcítico de pulmón de células humano (NSCLC) de EGF y la proliferación mediada por DAMGO usando un ensayo de proliferación MTS. células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar (control) o se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF) o 100 nM DAMGO durante 72 horas con o sin pretratamiento de las células con el antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor de X (5 uM), la familia Src inhibidor de quinasa PP2 (100 nM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Existe una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, indicado por un asterisco) entre los grupos control y de tratamiento con n = 3 experimentos independientes por condición y barras de error = desviación estándar. Vea la sección Métodos para más detalles experimentales. Panel B: Se analizaron las células H358 humano no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) de EGF y la migración mediada por DAMGO utilizando un ensayo transwell (8 um de tamaño de poro). células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar (control) o se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF) o 100 nM DAMGO durante 18 horas con o sin pretratamiento de las células con el antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor de X (5 uM), la familia Src inhibidor de quinasa PP2 (100 nM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Existe una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05, indicado por un asterisco) entre los grupos control y de tratamiento con n = 3 experimentos independientes por condición y barras de error = desviación estándar. Vea la sección Métodos para más detalles experimentales.
Dado que se sabe muy poco acerca de la regulación MOR de la transformación del epitelio mesenquimal (EMT) y los mecanismos moleculares que integran proliferación de células cancerosas, la migración y la EMT, el próximo examinó si MOR1 sobreexpresión regula EMT cáncer de pulmón. En la Figura 6-A, B, se observó que MOR sobreexpresión en células H358 NSCLC humanos induce un cambio en la expresión de marcadores de EMT que es consistente con una transición epitelio mesénquima [19]. Desde el MOR es el principal receptor de ciertos opioides [4], [43], el próximo evaluó si los opiáceos pueden inducir EMT en células H358 NSCLC humanos. Figura 6-C indica que DAMGO, morfina y fentanilo todos inducen EMT en NSCLC de una manera dependiente de la dosis
Panel A:. Control (no transfectadas) (C), el control de vector estable (VC) y MOR1 sobreexpresan (O /e) se generaron líneas de células H358, lisados celulares obtenidos y inmunotransferencia con marcadores de EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) y anti-actina (g) anticuerpos. Un aumento de la vimentina, Snail y la expresión de Slug y una disminución en claudin-1 y ZO-1 expresión sugieren una transición epitelio mesénquima. Panel B: cuantificación gráfica de la inmunorreactividad de los experimentos realizados se describe en el Panel A con n = 3 experimentos independientes por condición. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) del control con barras de error = desviación estándar. Panel C: células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar, se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF), 100 nM DAMGO, la morfina o fentanilo o 100 factor de ng /ml de crecimiento tipo insulina (IGF) durante 96 horas, los lisados celulares obtenidos y inmunotransferencia con marcadores de EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) y anti-actina (g) anticuerpos. Una disminución de la vimentina, Snail y la expresión de Slug y un aumento en claudin-1 y ZO-1 expresión sugiere la inhibición de la transición epitelio mesénquima. Se generaron control shRNA o MOR shRNA H358 líneas celulares, lisados celulares obtenidos y a inmunotransferencia con marcadores de EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (D: Panel D ), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) y anti-actina g anticuerpos (). Un aumento de la vimentina, la expresión de Snail y Slug y una disminución en la claudina-1 y ZO-1 de expresión sugieren una transición epitelio mesénquima.
Teniendo en cuenta estas células NSCLC H358 humanos expresan niveles basales de MOR y responden a tratamiento con opioides, se examinó si el silenciamiento (shRNA) de MOR afectaría EMT opioide y el factor de crecimiento inducido. Figura 6-D indica MOR silenciamiento inhibe opioide y EGF cambios /IGF-inducida en la expresión de marcadores de EMT. Figura 7-A indica que H358 células crecen en colonias con bordes bien delimitados y fuertes adherencias célula-célula. Por el contrario, la morfina o células H358 de IGF-tratados muestran una pérdida de adherencias célula-célula y un cambio de cuboidal a un fenotipo alargado con varias proyecciones celulares visibles. Estos cambios son consistentes con una transición epitelial mesenquimal (EMT)
Panel A:. Células de NSCLC humanos H358 se dejaron sin tratar (control), se trató con 100 nm de morfina o 100 /ml de factor de crecimiento tipo insulina ng (IGF) para se obtuvieron 96 horas y las imágenes de campo claro (20 ×). H358 células crecen en colonias con bordes bien delimitados y fuertes adherencias célula-célula. Por el contrario, la morfina o células H358 de IGF-tratados muestran una pérdida de adherencias célula-célula y un cambio de cuboidal a un fenotipo alargado con varias proyecciones celulares visibles. Estos cambios son consistentes con una transición epitelial mesenquimal (EMT). Panel B: células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar, se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF), 100 nM DAMGO, la morfina o fentanilo o 100 factor de ng /ml de crecimiento tipo insulina (IGF) durante 96 horas con o sin tratamiento previo con el antagonista periférico MOR, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), la familia Src PP2 inhibidor de quinasa (100 nM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Los lisados celulares se obtienen entonces y a inmunotransferencia con marcadores de EMT anti-vimentina (a, c, e) o anti-claudin-1 (b, d, f) anticuerpos. Un aumento en la expresión de vimentina y una disminución en la claudina-1 de expresión sugieren una transición epitelio mesénquima.
A continuación examinó posibles proteínas de transducción de señales que potencialmente podrían regular de opiáceos y el crecimiento EMT inducida por el factor. La figura 7-B indica el pretratamiento con el antagonista periférico MOR, metilnaltrexona (MNTX), el PP2 inhibidor de quinasa de la familia Src o el inhibidor de STAT3 Stattic revertir los opioides y de crecimiento cambios inducida por el factor de vimentina y claudin-1 de expresión. Además, la Figura 8 indica siRNA y /o la inhibición química de MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt y STAT3 inhibe dramáticamente EMT (como se determina por la inhibición de opioide y el crecimiento aumento inducida por el factor en la expresión de vimentina y disminución de claudin- 1 de expresión). Tanto MNTX y la naloxona inhibidor MOR atenuadas opioide y el crecimiento indicación EMT inducida por el factor de un efecto general de MOR antagonistas en este proceso (Figuras 7 y 8 y los datos de apoyo, Figura S1). En conjunto, nuestros datos sugieren MOR juega un papel central en los procesos de proliferación, la migración y la transición epitelio mesénquima solo y en combinación con opioides y factores de crecimiento
Panel A:. Representación gráfica de la expresión de vimentina% de control. células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar, se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF), 100 nM DAMGO, la morfina o fentanilo o 100 factor de ng /ml de crecimiento tipo insulina (IGF) durante 96 horas con o sin tratamiento previo de las células con el antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor X (5 M), la familia quinasa inhibidor PP2 Src (100 nM ) o el inhibidor de la STAT3 Stattic (10 uM). Los lisados celulares se obtienen entonces y a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-vimentina marcador de EMT. Los experimentos se repitieron por triplicado y las bandas inmunorreactivas se analizaron mediante densitometría asistida por ordenador. Hay una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05 indican con un asterisco (*)) entre los grupos de control y tratamiento con barras de error = desviación estándar. Un aumento en la expresión de vimentina es sugerente de una transición mesenquimal epitelial. Panel B: Representación gráfica del% de control claudina-1 de expresión. células de NSCLC humano H358 se dejaron sin tratar, se trataron con 100 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico (EGF), 100 nM DAMGO, la morfina o fentanilo o 100 factor de ng /ml de crecimiento tipo insulina (IGF) durante 96 horas con o sin tratamiento previo de las células con el antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 uM), Akt inhibidor X (5 M), la familia quinasa inhibidor PP2 Src (100 nM ) o el inhibidor de la STAT3 Stattic (10 uM). Los lisados celulares se obtienen entonces y a inmunotransferencia con el anticuerpo marcador EMT anti-claudin-1. Tres experimentos independientes por condición se llevaron a cabo y las bandas inmunorreactivas se analizaron mediante densitometría asistida por ordenador. Hay una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05 indican con un asterisco (*)) entre los grupos de control y tratamiento con barras de error = desviación estándar. Una disminución en la claudina-1 de expresión es sugerente de una transición epitelio mesénquima.
Discusión
NSCLC, que representa el ~ 80% de todos los cánceres de pulmón, es una enfermedad con una alta mortalidad y pocas opciones de tratamiento [44], [45]. Hemos informado anteriormente de que el MOR es upregulated en el tejido pulmonar de pacientes con NSCLC [12] y que la sobreexpresión de MOR promueve el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos de xenoinjerto de NSCLC humanos [13].