Extracto
Antecedentes
extensa interés
El resveratrol, un compuesto de origen natural phytopolyphenol, ha atraído en los últimos años debido a sus diversas características farmacológicas. Aunque resveratrol posee propiedades quimiopreventivos contra varios tipos de cáncer, los mecanismos moleculares por los cuales se inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis no han sido claramente comprendida. El presente estudio se llevó a cabo para examinar si la vía PI3K /AKT /FOXO media los efectos biológicos de resveratrol.
Metodología /Principales conclusiones
El resveratrol inhibe la fosforilación de PI3K, AKT y mTOR. Resveratrol, inhibidores de PI3K (LY294002 y wortmanina) y inhibidor de AKT inducida por sí solo ligeramente la apoptosis en células LNCaP. Estos inhibidores de mejorar aún más el potencial de inducción de apoptosis de resveratrol. La sobreexpresión de tipo salvaje PTEN induce la apoptosis ligeramente. tipo salvaje PTEN y PTEN-G129E aumento de la apoptosis resveratrol inducida, mientras que PTEN-G129R no tuvo ningún efecto sobre los efectos proapoptóticos de resveratrol. Además, el potencial de inducción de apoptosis de resveratrol fue reforzada por AKT negativo dominante, e inhibida por la de tipo salvaje AKT y AKT constitutivamente activa. Resveratrol no tiene ningún efecto sobre la expresión de genes FKHR, FKHRL1 y AFX. La inhibición de la fosforilación FOXO por el resveratrol resultó en su translocación nuclear, de unión a ADN y la actividad transcripcional. La inhibición de la vía PI3K /AKT FOXO inducida por la actividad transcripcional que resulta en la inducción de Bim, TRAIL, p27
/KIP1, DR4 y DR5, y la inhibición de la ciclina D1. Del mismo modo, FOXO resveratrol inducida por la actividad transcripcional se mejoró aún más cuando la activación de la vía /AKT PI3K estaba bloqueado. La sobreexpresión de la fosforilación de las proteínas mutantes deficientes FOXO (FoxO1-TM, FOXO3A-TM y foxo4-TM) FOXO inducida por la actividad transcripcional, que se vio reforzada por el resveratrol. La inhibición de los factores de transcripción FoxO por shRNA bloqueó la regulación positiva de resveratrol inducida de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/KIP1 y la apoptosis y la inhibición de la ciclina D1 por el resveratrol.
Conclusión /Importancia
Estos datos sugieren que los factores de transcripción FoxO median efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos de resveratrol, en parte debido a la activación de la vía de la apoptosis extrínseca
Visto:. Chen Q, S Ganapathy, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) El resveratrol induce la detención del crecimiento y la apoptosis a través de la activación de factores de transcripción FoxO en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10.1371 /journal.pone.0015288
Editor: Irina Lebedeva, Enzo vida Biosciences, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de septiembre de 2010; Aceptado: 4 de noviembre de 2010; Publicado: December 14, 2010
Derechos de Autor © 2010 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El proyecto fue apoyado por una beca (NIH R01CA114469 a RKS) de los Institutos nacionales de Salud (www.nih.gov). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata, una de las neoplasias más frecuentes en el mundo occidental, surge mediante el desarrollo progresivo de una o más lesiones neoplásicas en pre adenocarcinoma, y posteriormente a la enfermedad metastásica [1]. Los avances recientes han identificado alteraciones genéticas clave que pueden iniciar la carcinogénesis de próstata, y aumentar la probabilidad de progresión del cáncer. células de cáncer de próstata son sólo moderadamente sensibles o incluso insensibles a los efectos citotóxicos de agentes quimioterapéuticos o radioterapia. Aumento de las concentraciones de los fármacos citotóxicos y mayores dosis de irradiación fallan para mejorar la respuesta a la terapia y que conduce a la resistencia a la apoptosis en células de cáncer de próstata. Por lo tanto, es imperativo para identificar agentes contra el cáncer que no son tóxicos y altamente eficaz en la inducción de apoptosis preferentemente en las células tumorales
.
Los datos epidemiológicos apoyan el concepto de que compuestos de origen natural en la dieta humana puede ser desprovisto de toxicidad y tienen una larga duradera efectos beneficiosos sobre la salud humana. Resveratrol se ha demostrado que presentan varias actividades quimioprotectores potenciales en modelos celulares y animales [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], incluyendo la inhibición de vía PI3K /AKT [2], [6], [8], [10]. Recientemente hemos demostrado que el resveratrol mejora el potencial terapéutico de TRAIL upregulating receptores de muerte (TRAIL /DR4 y TRAIL-R2 /DR5), así como la participación vía mitocondrial de la apoptosis [2], [3]. Deleción o mutación del PTEN ha sido la principal causa de AKT constitutivamente activa que conduce a la carcinogénesis de próstata en los seres humanos [11], [12]. Por lo tanto, el resveratrol puede ser candidato potencial a las células diana con PTEN eliminación o inactivación y la actividad AKT mejorada en el tejido de la próstata precancerosa.
señalización PI3K juega un papel fundamental en las vías de transducción de señales intracelulares que participan en la transformación celular, crecimiento celular, y tumorigénesis. La inactivación de los resultados de Akt en la desfosforilación y la activación de factores de transcripción FOXO, informó de mediar la detención del ciclo celular, reparación del ADN, y la apoptosis [13], [14]. Estos factores de transcripción, pertenecen a la 'O' subgrupo de /forkhead familia de factores de transcripción alas de hélice, representados principalmente por cuatro miembros FoxO1, FOXO3A, foxo4, y FOXO6 [15]. proteínas FOXO se conservan evolutivamente factores de transcripción implicados en diversos procesos celulares fundamentales, que funciona como punto final para los programas de transcripción implicados en la apoptosis, la respuesta al estrés y la longevidad [16], [17], [18], [19], [20]. La abrogación de la función FOXO se observa con frecuencia en el cáncer humano [17], [21], por lo tanto, los mecanismos de regulación de las proteínas FOXO están recibiendo cada vez más atención en la investigación del cáncer. Las proteínas FOXO integran entradas de regulación de una variedad de vías de señalización aguas arriba, lo más importante en respuesta al factor de crecimiento y el estrés de señalización [17], [21]. Recientemente, los factores FOXO se han establecido como supresores de tumores, la promoción de la transcripción de moléculas pro-apoptóticas como FasL y Bim cuando la vía PI3K /AKT está regulado por disminución debido al nutriente o la privación de suero y el estrés celular [22] [23], [24, ]. modelos triples ratón knockout demostraron las propiedades supresoras de tumores de Foxos, ya que los ratones que carecen de forma simultánea los principales miembros de la subfamilia de mamíferos FOXO, FoxO1, FOXO3a y foxo4, son propensos a desarrollar los hemangiomas y enfermedades linfoproliferativas [25]. Por el contrario, el individuo o la inactivación emparejada de FoxO1, FOXO3a o foxo4 dieron lugar a un fenotipo menos grave, apoyando la idea de la redundancia funcional de estos factores FOXO [25]. Además, la expresión forzada de FOXO se ha demostrado que inhibe la tumorigénesis en modelos de xenoinjerto en ratones desnudos [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Por lo tanto, la reactivación de FOXO basado en sus propiedades supresores de tumores se considera como una estrategia muy atractiva anti-cáncer. Dado que las proteínas se reportaron FOXO ser mediadores importantes de la apoptosis inducida por medicamentos contra el cáncer, que postula que la expresión FOXO o actividad transcripcional podría ser acontecimiento importante en la mediación de los efectos del resveratrol.
Los objetivos de nuestro estudio fueron examinar la efectos PI3K /AKT en la regulación de los factores de transcripción FoxO y sus productos génicos diana, y evaluar si la vía PI3K /AKT /FOXO regula los efectos antiproliferativos de resveratrol en las células del cáncer de próstata. Nuestros datos demuestran que la inhibición de la vía /AKT PI3K FOXO de unión al ADN y la actividad transcripcional mejorada, lo que resulta en la regulación de sus productos génicos (TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27
/KIP1 y ciclina D1). La inhibición de la vía PI3K /AKT o sobreexpresión de FKHR, FKHRL1 y AFX mejorada FOXO actividad transcripcional resveratrol inducida. En contraste, la inhibición de FKHR, FKHRL1 o AFX bloqueado expresión inducida por resveratrol de TRAIL, DR4, DR5, Bim y p27, y se inhibe la expresión de ciclina D1. Estos datos sugieren que el resveratrol induce la apoptosis y detención del crecimiento a través de la activación de factores de transcripción FOXO, y la inhibición de la vía /AKT PI3K activa los factores de transcripción y FOXO mejora aún más efectos antiproliferativos y proapoptóticos de resveratrol.
Resultados
la inhibición de la vía /AKT PI3K potencia la apoptosis inducida por el resveratrol en las células de cáncer de próstata
primero se examinaron los efectos de la inhibición farmacológica de AKT por LY294002, wortmanina o inhibidor de AKT en la apoptosis inducida por el resveratrol en las células LNCaP (Fig. 1A). apoptosis inducida resveratrol en las células LNCaP. Del mismo modo, LY294002, wortmanina o AKT inhibidor de la apoptosis inducida ligera pero significativamente. El tratamiento previo de las células LNCaP con LY294002, wortmanina o inhibidor de AKT mejora de forma significativa la apoptosis inducida por resveratrol a las 48 h. Estos datos sugieren que la inhibición de la actividad /AKT PI3K por farmacológica enfoque mejorado apoptosis inducida por resveratrol.
(A), las células LNCaP se trataron previamente con LY294002 (1 M), wortmanina (1 M) o el inhibidor de AKT (100 nM) durante 2 h, seguido por el tratamiento con resveratrol (20 M) durante 48 h. Al final del periodo de incubación, se recogieron las células y la apoptosis se midió por el ensayo TUNEL. Los datos representan la media ± SE. *,#Y ** = significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (B), las células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío, PTEN-WT, PTEN-G129E o PTEN-G129R. El medio de cultivo fue cambiado y las células fueron tratadas con o sin resveratrol (20 M) durante 48 h, y la apoptosis se midió por el ensayo TUNEL. Los datos representan la media ± SE. *, **,% Y $ = significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (C), las células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío, WT-AKT, CA-AKT o DN-AKT. El medio de cultivo fue cambiado y las células fueron tratadas con o sin resveratrol (20 M) durante 48 h, y la apoptosis se midió por el ensayo TUNEL. Los datos representan la media ± SE. *, **,#Y% = significativamente diferente del control respectivo (P & lt; 0,05). (D), los efectos del resveratrol sobre la expresión de PI3K, AKT y mTOR. células LNCaP se trataron con resveratrol (20 M) para varios puntos de tiempo. Se realizaron transferencias Western con anti-fosfo-PI3K, fosfo-AKT, anti-AKT y los anticuerpos fosfo-mTOR. ß-actina se utilizó como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos.
El gen PTEN supresor de tumores es muy a menudo inactivado en los cánceres de próstata humanos. La inactivación de PTEN puede causar la fosforilación constitutiva y la activación de AKT, lo que lleva a un crecimiento celular mejorado y la progresión del tumor. Dado que las células LNCaP expresan constitutivamente activa AKT, tratamos de examinar el papel de los /AKT PI3K en la apoptosis inducida por el resveratrol. células LNCaP fueron transfectadas con el vector vacío o plásmido que expresa de tipo salvaje PTEN, PTEN-G129E, o PTEN-G129R y se incubaron en presencia o ausencia de resveratrol (Fig. 1B). apoptosis inducida resveratrol en las células LNCaP transfectadas con el vector vacío. La transfección de células LNCaP con PTEN tipo salvaje mejora de forma significativa la apoptosis inducida por el resveratrol. La sobreexpresión de PTEN-G129E o PTEN-G129R en las células LNCaP significativamente el resveratrol inhibe la apoptosis inducida de las transfectadas con el tipo salvaje PTEN. Estos datos sugieren que la inhibición de la actividad de AKT por la sobreexpresión de PTEN mejora potencial inductor de apoptosis de resveratrol
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Desde la sobreexpresión de PTEN potencia la apoptosis inducida por resveratrol-, que la expresión de AKT regulada por tipo salvaje AKT (WT-AKT), constitutivamente activa AKT (CA-AKT) y AKT dominante negativo (DN-AKT). células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío, WT-AKT, CA-AKT o DN-AKT y tratados con o sin resveratrol (20 M). La transfección de células LNCaP con el vector vacío, WT-AKT o CA-AKT no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis (Fig. 1C). apoptosis inducida por resveratrol en las células transfectadas de vectores vacíos. La sobreexpresión de WT-AKT o CA-AKT en las células LNCaP inhibe la apoptosis inducida por el resveratrol. La sobreexpresión de DN-AKT apoptosis inducida significativamente solo. Curiosamente, la sobreexpresión de DN-AKT aumento de la apoptosis inducida por el resveratrol. En general, estos datos sugieren que la inhibición de la vía /AKT PI3K por medios genéticos y farmacológicos potenciar la apoptosis inducida por resveratrol en células de cáncer de próstata.
Resveratrol inhibe la fosforilación de PI3K y AKT
Desde PI3K /AKT vía inhibe la apoptosis inducida por resveratrol, tratamos de examinar los efectos del resveratrol sobre la fosforilación de PI3K y AKT (Fig. 1D). células LNCaP se trataron con resveratrol y la fosforilación de PI3K y AKT fue examinado por el análisis de transferencia de Western. Resveratrol inhibe la fosforilación de PI3K y AKT en una manera dependiente del tiempo. La fosforilación de estas quinasas se abolió a las 48 h. El resveratrol no tuvo ningún efecto sobre la expresión de AKT total.
Desde mTOR es un río abajo de AKT, el próximo tratado de examinar si el resveratrol también regula la fosforilación de mTOR. Como se muestra en la Fig. 1D, el resveratrol inhibe la fosforilación de mTOR. Estos datos sugieren que el resveratrol puede inhibir la fosforilación de ambas proteínas PI3K /AKT y mTOR, y por lo tanto desempeñar un papel importante en la mediación de los efectos anti-apoptóticos de resveratrol.
Resveratrol no tiene ningún efecto sobre la expresión de FKHR, FKHRL1 y AFX, pero inhibe la fosforilación de las proteínas FOXO
vía PI3K /AKT se ha demostrado que regulan la fosforilación de proteínas FOXO [33]. Por lo tanto, mide la expresión de genes FOXO por RT-PCR, y la fosforilación de proteínas FOXO por análisis de transferencia Western. Resveratrol no tuvo ningún efecto sobre la expresión de FKHR, FKHRL1 y AFX como se mide por RT-PCR (Fig. 2A). A continuación trató de examinar si el resveratrol regula la fosforilación de las proteínas FOXO. Como se muestra en la Fig. 2B, el resveratrol inhibe la fosforilación de FKHR, FKHRL1 y AFX. Estos datos sugieren que el resveratrol puede inhibir la fosforilación de las proteínas, que son FOXO aguas abajo de AKT y desfosforilación de FOXO por resveratrol puede dar lugar a su activación a través de la translocación nuclear.
(A), los efectos del resveratrol en la expresión de FKHR, FKHRL1 y AFX. células LNCaP se trataron con resveratrol (10 o 20 mM) para 6, 12 o 24 h. El ARN total se aisló y se realizó el análisis RT-PCR para medir la expresión de FKHR, FKHRL1 y AFX. (B), los efectos del resveratrol en la fosforilación de las proteínas FOXO. células LNCaP se trataron con resveratrol (20 M) para 0 a 48 h, y se realizaron los análisis de transferencia de Western para medir la expresión de fosfo-FKHR, fosfo-FKHRL1 y fósforo-AFX. ß-actina se utilizó como control de carga. (C), el resveratrol induce la translocación de FKHR para núcleo. células LNCaP fueron sembradas en portaobjetos con cámaras y transfectadas con GFP-FKHR o GFP-FKHR-TM (fosforilación deficiente mutante triple). El medio de cultivo fue cambiado y las células fueron tratadas con o sin resveratrol (20 M) durante 24 h. Las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con DAPI y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. el color verde = FKHR, color rojo = núcleo (para mayor claridad el color del núcleo se cambió de azul a rojo), colocalización amarillo = de FKHR para núcleo. (D), el panel izquierdo, las células LNCaP se trataron con resveratrol (20 mM) de varios puntos de tiempo (0-24 h). Se prepararon extractos nucleares y el experimento gelshift se realizó como se describe en Materiales y Métodos. Carril 1 = sonda única, carriles 2-9 muestras tratadas = resveratrol, carril 10 = sonda fría (50 ×) y calle 11 = sonda SP1 frío. Los datos son representativos de tres experimentos. Panel derecho, las células LNCaP se dejaron sin tratar o tratadas con resveratrol (20 mM) en presencia o ausencia de LY (1 M) o el inhibidor de AKT (100 nM) durante 24 h. Se prepararon extractos nucleares y el experimento gelshift se realizó como se describe en Materiales y Métodos. Carril 1 = sonda única, carril 2 = sonda fría (50 ×), carril 3 = SP1 frío, carril 4 = control, carril 5 = resveratrol, carril 6 = LY, carril inhibidor 7 = AKT, carril 8 = resveratrol, más LY, carril 9 = resveratrol + AKT inhibidor. Los datos son representativos de tres experimentos.
El resveratrol mejora la translocación de tipo salvaje y mutante FKHR al núcleo y mejora la interacción FOXO-ADN
A continuación examinó la translocación nuclear de FKHR por el resveratrol utilizando construcciones de tipo salvaje y mutantes de GFP-FKHR. células LNCaP fueron transfectadas con cualquiera de GFP-FKHR o GFP-FKHR-TM (triple mutante) y se trataron con resveratrol durante 24 h (Fig. 2C). La translocación de tipo salvaje y mutante deficiente fosforilación FKHR se observó por microscopía de fluorescencia. Resveratrol induce la translocación nuclear de tanto de tipo salvaje y mutante FKHR. Sin embargo, la translocación nuclear de FKHR-TM era mucho más alto que el tipo salvaje FKHR.
A continuación examinó la interacción FOXO-ADN mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) es una técnica de electroforesis de afinidad común usado para estudiar la interacción proteína-ADN. El tratamiento de células LNCaP con resveratrol resultó en interacción FOXO-DNA mejorada (Fig. 2D, panel izquierdo). La incubación de sonda fría con el extracto nuclear dio como resultado actividad de unión FOXO-DNA reducida. En comparación, la incubación de la sonda SP1 frío no específica no tuvo ningún efecto sobre la unión FOXO-DNA. La combinación de LY294002 o inhibidor de AKT con resveratrol mejora ligeramente la actividad de unión FOXO-DNA, que un único agente (Fig. 2D, panel derecho). En general, estos datos sugieren que el resveratrol puede mejorar FOXO translocación nuclear y la actividad de unión al ADN.
Inhibición de la vía PI3K /Akt y fosforilación mutantes deficientes de proteínas FOXO mejorar FOXO actividad transcripcional resveratrol inducida
a continuación examinó si la inhibición de la vía /AKT PI3K mejora FOXO resveratrol inducida por la actividad transcripcional en un ensayo de gen indicador de luciferasa que mide la función FOXO (Fig. 3A-C). Hemos dado un primer enfoque farmacológico para inhibir la actividad de PI3K /AKT mediante el uso de Wortmannina, LY-294002, y el inhibidor de AKT IV. Wortmanina, LY-294002, inhibidor de AKT IV y el resveratrol inducida por sí solo FOXO actividad transcripcional. Además, el tratamiento de combinación de wortmanina, LY-294002, o un inhibidor de AKT IV con resveratrol mejorar aún más la actividad FOXO. Estos datos sugieren que la inhibición de PI3K /AKT vía de actuar sinérgicamente con resveratrol para inducir FOXO actividad transcripcional.
(A), la inhibición farmacológica de la vía /AKT actividad mejorada FOXO resveratrol inducida por PI3K en células LNCaP. células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con 6X DBE-luciferasa y pRL-TK plásmidos para 24 h como se describió en otra parte. Después de la transfección, las células fueron pretratadas con wortmanina (10 M), LY-294002 (10 mM) o un inhibidor de AKT IV (1 M) durante 2 h, seguido de tratamiento con o sin resveratrol (20 M) durante 24 h. Las células se recogieron por luciérnaga /Renilla ensayos de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). los recuentos de luciferasa se normalizaron utilizando
Renilla
control de transfección de luciferasa. Los datos representan la media ± S.D. *, #, ** = Significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (B), la sobreexpresión de una mayor actividad FOXO resveratrol inducida dominante AKT negativo. células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con 6X DBE-luciferasa más plásmidos PRL-TK con WT-AKT, CA-AKT o DN-AKT durante 24 h. Después de la transfección, las células fueron pretratadas con resveratrol (20 M) durante 24 h. Las células se recogieron por luciérnaga /Renilla ensayos de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). los recuentos de luciferasa se normalizaron utilizando
Renilla
control de transfección de luciferasa. Los datos representan la media ± S.D. *,#Y ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (C), el Reglamento de la actividad FOXO resveratrol inducida por el tipo salvaje o mutante PTEN. células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con 6X DBE-luciferasa más plásmidos PRL-TK con PTEN-WT, PTEN-G129E o PTEN-G129R durante 24 h. Después de la transfección, las células fueron pretratadas con resveratrol (20 M) durante 24 h. Las células se recogieron por luciérnaga /Renilla ensayos de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). los recuentos de luciferasa se normalizaron utilizando
Renilla
control de transfección de luciferasa. Los datos representan la media ± S.D. *, & Amp ;, $ y ** = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (D), la fosforilación mutantes deficientes de FOXO mejorar FOXO actividad transcripcional inducida por resveratrol. células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío o construcciones que codifican FoxO1-TM, FOXO3a-TM, o foxo4-TM junto con 6X DBE-luciferasa y PRL-TK plásmidos para 24 h. Después de la transfección, se lavaron las células, se trató con resveratrol (20 M) durante 24 h, y se cosechan para la luciérnaga /Renilla ensayos de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase Assay Reporter (Promega). los recuentos de luciferasa se normalizaron utilizando
Renilla
control de transfección de luciferasa. Los datos representan la media ± S.D. * Y ** = significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05
A continuación examinó los efectos de la actividad de AKT en FOXO resveratrol inducida en las células LNCaP (Figura 3B.). La actividad de AKT estaba regulado por AKT tipo salvaje (WT-AKT), constitutivamente activa AKT (CA-AKT) y AKT dominante negativo (DN-AKT). células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con el vector vacío, WT-AKT, CA-AKT o DN-AKT y tratados con o sin resveratrol (20 M). La transfección de células LNCaP con el vector vacío, WT-AKT, o CA-AKT no tuvo efecto en la actividad transcripcional FOXO. En comparación, la transfección de las células con el DN-AKT inducida significativa actividad transcripcional FOXO. Resveratrol inducida FOXO actividad transcripcional en las células transfectadas con el vector vacío. La sobreexpresión de WT-AKT o CA-AKT en las células LNCaP inhibida FOXO actividad transcripcional inducida por el resveratrol. Curiosamente, la sobreexpresión de DN-AKT mejorada FOXO actividad transcripcional resveratrol inducida. En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición de la actividad de AKT enfoque genético mejora FOXO actividad transcripcional inducida por el resveratrol en las células de cáncer de próstata.
Dado que las células LNCaP expresa PTEN mutante que resulta en la activación constitutiva de AKT, hemos tratado de examinar el papel de PTEN en la actividad transcripcional FOXO resveratrol inducida (Fig. 3C). células LNCaP fueron transfectadas con el vector vacío o plásmido que expresa de tipo salvaje PTEN, PTEN-G129E, o PTEN-G129R y se trataron con o sin resveratrol. PTEN-WT ligeramente inducida FOXO actividad transcripcional. El resveratrol inducida FOXO actividad transcripcional en las células LNCaP transfectadas con el vector vacío. La transfección de células LNCaP con tipo salvaje PTEN o PTEN-G129E mejora de forma significativa FOXO actividad transcripcional inducida por el resveratrol. En comparación, la sobreexpresión de PTEN-G129R en las células LNCaP tenía actividad FOXO transcripcional similar a la de las células de vector tratado de resveratrol LNCaP /vacíos. Estos datos sugieren que la inhibición de la actividad de AKT por la sobreexpresión de PTEN mejora FOXO actividad transcripcional.
A continuación examinó si el resveratrol induce la activación transcripcional de FOXO en presencia o ausencia de FoxO1-TM, FOXO3a-TM, o FOXO4- TM (fosforilación deficiente mutante triple) (Fig. 3D). células LNCaP fueron transfectadas con p6xDBE-luciferasa constructo indicador en la presencia o ausencia de plásmidos que expresan FoxO1-TM, FOXO3a-TM, o foxo4-TM. Después de la transfección, las células fueron tratadas con resveratrol durante 24 h, y se midió la actividad de luciferasa. La transfección de células con plásmidos que expresan FoxO1-TM, FOXO3a-TM, o foxo4-TM inducida FOXO actividad transcripcional en comparación con el vector vacío (control). la actividad transcripcional FOXO resveratrol inducida se mejoró aún más en presencia de fosforilación mutantes deficientes de FoxO1, FOXO3a, y foxo4. Estos datos indican que la activación de la transcripción FOXO factores de mejora aún más la actividad transcripcional FOXO resveratrol inducida.
La inhibición de la vía /AKT PI3K regula Bim, p27
/Kip1, ciclina D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5
a continuación examinó el efecto de inhibir la vía PI3K /AKT en la expresión de Bim, p27
/Kip1, ciclina D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 y TRAIL-R2 /DR5. Estos genes son blancos directos de FOXO factor de transcripción. células LNCaP se trataron previamente con LY-294002 o un inhibidor de AKT IV seguido de tratamiento con resveratrol durante 24 h, y la expresión de Bim, p27, ciclina D1, TRAIL, DR4 y DR5 se midió por transferencia Western (Fig. 4). LY-294002 y AKT inhibidor IV indujo la expresión de Bim, p27
/Kip1, TRAIL, DR4 y DR5, e inhibió la expresión de ciclina D1. El tratamiento de las células con resveratrol mejora aún más los efectos de la LY-294002 o AKT inhibidor IV sobre la expresión de Bim, TRAIL, DR4 y DR5. Sin embargo, la combinación de LY-294002 o AKT inhibidor IV con resveratrol no tuvo ningún efecto adicional sobre la expresión de p27
/KIP1 y ciclina D1. Estos datos sugieren que la inhibición de la vía /AKT PI3K puede regular la expresión de Bim, p27
/Kip1, ciclina D1, TRAIL, DR4 y DR5, que son dianas transcripcionales de FOXO. Resverarol también puede regular la expresión de estos objetivos transcripcionales FOXO.
células LNCaP se trataron previamente con LY294002 (10 mM) o un inhibidor de AKT (AKT-I, 1 M) durante 2 h y se trataron con o sin resveratrol (20 M) durante 48 h. Se recogieron las células para medir la expresión de Bim, p27
/KIP1, ciclina D1, TRAIL, DR4 y DR5 mediante análisis de transferencia theWestern. β-actina se utilizó como control de carga.
inhibición de la expresión FOXO por shRNA inhibe los efectos antiproliferativos de resveratrol y bloqueó la caspasa 3-actividad resveratrol inducida por apoptosis y
Si resveratrol induce la apoptosis mediante la activación de factor de transcripción FOXO, la inhibición de las proteínas FOXO debería bloquear los efectos anti-proliferativos de resveratrol. células LNCaP fueron transfectadas con shRNA expresar FKHR, FKHRL1 o AFX y tratadas con resveratrol (Fig. 5). apoptosis inducida por resveratrol en LNCaP /FKHR revueltos, LNCaP /FKHRL1 revueltos y LNCaP /AFX revueltos células de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A). La inhibición de la FKHR, FKHRL1 o AFX por shRNA bloqueado efectos antiproliferativos de resveratrol. Estos datos sugieren que el resveratrol inhibe la viabilidad celular mediante la regulación de factores de transcripción FoxO.
(A), inhibición del factor de transcripción FoxO por shRNA bloques de efectos antiproliferativos de resveratrol. células LNCaP fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos que expresan FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX shRNA o respectivo control mezclado y se trataron con resveratrol (20 M) durante 48 h, y se midió la viabilidad celular. (B), la inhibición de FOXO factores de transcripción o ROS (especies reactivas de oxígeno) por NAC bloquea la apoptosis inducida por resveratrol-. células LNCaP fueron transfectadas con una mezcla de plásmidos que expresan FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA más AFX shRNA o control mezclado. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió y las células se pretrataron con NAC durante 2 h, y se trató con resveratrol (20 M) durante 48 h. Al final del período de incubación, la apoptosis se midió por el ensayo TUNEL. (C), la inhibición de FOXO factores de transcripción o ROS por NAC bloques resveratrol inducida por la actividad de caspasa-3. células LNCaP fueron transfectadas con una mezcla de plásmidos que expresan FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA más AFX shRNA o control mezclado. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió y las células se pretrataron con NAC durante 2 h, y se trató con resveratrol (20 M) durante 48 h. Al final del período de incubación, la actividad de la caspasa-3 se midió como por las instrucciones del fabricante.
A continuación trató de examinar si la inhibición de la expresión efecto FOXO caspasa 3-actividad y apoptosis resveratrol inducida (Fig . 5B y C). El resveratrol inducida por la actividad de caspasa-3 y la apoptosis en células LNCaP /revueltos. El tratamiento previo de LNCaP /células revueltos con NAC inhibió la actividad de resveratrol inducida por la caspasa-3 y la apoptosis. La inhibición de la expresión FOXO por shRNA resveratrol inhibe la actividad inducida por la caspasa-3 y la apoptosis. Curiosamente, el pretratamiento de LNCaP /células FOXO shRNA con NAC bloqueado actividad resveratrol inducida por la caspasa-3 y la apoptosis. Estos datos sugieren que el resveratrol inducida por la actividad de caspasa-3 y la apoptosis a través de la generación de ROS y la inhibición de FOXO (FKHR, FKHRL1 y AFX) inhibe la actividad de caspasa-3 y la apoptosis.
Reglamento de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 y ciclina D1 por los genes FOXO (FKHR, FKHRL1 y AFX) guía
factores de transcripción FoxO han demostrado que regulan los genes relacionados con el ciclo y la apoptosis de células [14], [34]. Dado que el resveratrol regula la expresión de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 y ciclina D1, hemos tratado de examinar si estos efectos del resveratrol están mediados por factores de transcripción FoxO que fueron inhibidas por shRNA (Fig. 6). El resveratrol indujo la expresión de Bim (Bim
EL, Bim
L y Bim
S), TRAIL, DR4, DR5 y p27
/Kip1, e inhibió la expresión de ciclina D1 en LNCaP /revueltos Células. La inhibición de la FKHR, FKHRL1 o AFX por shRNA atenuada resveratrol inducida por Bim, TRAIL, DR4, DR5 y p27
expresión /Kip1. En comparación, la inhibición de FKHR, FKHRL1 o AFX por shRNA atenuada ligeramente los efectos inhibidores de resveratrol sobre la expresión de ciclina D1. Estos datos sugieren que el resveratrol puede regular la apoptosis (Bim, TRAIL, DR4, DR5 y) y los genes relacionados con el ciclo celular (p27
/Kip1, y ciclina D1) a través de factores de transcripción FoxO. Curiosamente, la inducción de TRAIL y sus receptores DR4 y DR5 por resveratrol dará lugar a la activación de la vía extrínseca de la apoptosis.
(A), las células LNCaP fueron transfectadas con plásmidos que expresan FKHR shRNA o revueltos control. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió y las células se trataron con resveratrol (0-20 mM) durante 48 h. Al final del periodo de incubación, se recogieron las células para medir la expresión de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 y ciclina D1 por el análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. (B), las células LNCaP fueron transfectadas con plásmidos que expresan FKHRL1 shRNA o revueltos control. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió y las células se trataron con resveratrol (0-20 mM) durante 48 h. Al final del periodo de incubación, se recogieron las células para medir la expresión de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 y ciclina D1 por el análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. (C), las células LNCaP fueron transfectadas con plásmidos que expresan AFX shRNA o revueltos control. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió y las células se trataron con resveratrol (0-20 mM) durante 48 h.