Extracto
Resveratrol (RV) es un componente natural de vino rojo y de uvas que se ha demostrado que es un agente quimiopreventivo contra el cáncer y potencial. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes contra el cáncer y efectos quimiopreventivos de RV se conocen por completo. Aquí nos muestran que el tratamiento de RV inhibe el crecimiento clonogénico de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en una forma dependiente de la dosis. Curiosamente, el efecto supresor de tumor de bajo RV dosis no se asoció con cambios significativos en la expresión de PARP escindida y se activa la caspasa-3, lo que sugiere que el tratamiento con dosis bajas de RV puede suprimir el crecimiento de células tumorales a través de un mecanismo de apoptosis independiente. Estudios posteriores revelan que el tratamiento de dosis baja RV induce un aumento significativo de la senescencia asociado a β-galactosidasa (SA-β-gal) y la tinción elevada expresión de p53 y p21 en células de NSCLC. Además, se muestra que la supresión inducida por RV del crecimiento de células de cáncer de pulmón está asociado con una disminución en la expresión de EF1A. Estos resultados sugieren que RV puede ejercer su contra el cáncer y los efectos quimiopreventivos través de la inducción de la senescencia prematura. Mecánica, senescencia prematura RV inducida correlaciona con un aumento de ADN de doble filamento se rompe (DSBs) y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células de cáncer de pulmón. La inhibición de la producción de ROS por N-acetilcisteína (NAC) atenúa DSBs de ADN RV inducida y la senescencia prematura. Además, se muestra que el tratamiento RV induce notablemente la expresión de NADPH oxidasa-5 (NOX5) tanto en A549 y células H460, lo que sugiere que RV puede aumentar la generación de ROS en células de cáncer de pulmón a través de la regulación positiva de la expresión NOX5. En conjunto, estos resultados demuestran que el tratamiento con dosis bajas de RV inhibe el crecimiento celular del cáncer de pulmón a través de un mecanismo previamente no apreciado, a saber, la inducción de la senescencia prematura a través de daño del ADN mediada por ROS
Visto:. Luo H, Yang A, Schulte BA , Wargovich MJ, Wang GY (2013) El resveratrol induce la senescencia prematura de las células del cáncer de pulmón a través de daño del ADN mediada por ROS. PLoS ONE 8 (3): E60065. doi: 10.1371 /journal.pone.0060065
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: noviembre 30, 2012; Aceptado: 20 Febrero 2013; Publicado: 22 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones NIH CA138313 y HL106451 (www.nih.gov). Este trabajo también fue apoyado en parte por una Sociedad del Cáncer Institucional de Becas de Investigación de América (# GRI-97-219-08). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que ningún interés en competencia existe
Introducción
el cáncer de pulmón es responsable de más muertes por cáncer en los Estados Unidos que la mortalidad combinada de cáncer colorrectal, de mama y de próstata [1]. Incluso con los nuevos enfoques terapéuticos avanzados, la tasa de supervivencia global a los 5 años es inferior al 16% y no ha cambiado apreciablemente durante muchas décadas [1], [2]. Este mal pronóstico hace hincapié en la necesidad urgente para el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento más eficaz de esta enfermedad mortal. Los productos naturales (PN) son ampliamente utilizados por los estadounidenses como los medicamentos complementarios y alternativos (CAM) para la prevención y tratamiento de diversas enfermedades humanas como el cáncer [3], [4]. El uso de NPs como agentes antitumorales para el tratamiento de cánceres humanos es una idea atractiva, ya que son fácilmente disponibles y exhiben poca o ninguna toxicidad [3], [5] - [7]. Resveratrol (RV) es uno de tales NPs y se ha demostrado que la exposición tanto contra el cáncer y los potenciales quimiopreventivos [3], [8] - [10]. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos que subyacen quimiopreventivos contra el cáncer y los efectos de la RV no se entienden completamente. El objetivo de este estudio fue definir el papel de la senescencia prematura en los efectos antitumorales de RV inducida en células de cáncer de pulmón.
La senescencia celular es un estado de la detención del ciclo celular permanente que puede ser desencadenada por una variedad de problemas incluyendo daño en el ADN, acortamiento de los telómeros y el estrés oxidativo [11] - [13]. Las dos categorías principales de la senescencia celular son senescencia replicativa y la senescencia prematura inducida por el estrés (SIPS). senescencia replicativa fue descrita por primera vez por Hayflick y Moorhead en fibroblastos humanos después de las células se sometieron a una reproducción extensa como consecuencia de pases de cultivo de serie [14]. Posteriormente, se encontró que las células también pueden someterse a SIPS en respuesta a agentes que dañan el ADN, tales como agentes quimioterapéuticos ionizante la radiación y el cáncer [11] - [13], [15]. Las células que sufren SIPS son morfológicamente indistinguibles de las células replicativamente senescentes y exhiben muchas de las características atribuidas a la senescencia replicativa, tales como el aumento de la senescencia asociados β-galactosidasa (SA-β-gal) la actividad y el aumento de p53 y p21 expresión [11] - [13] , [15] - [17]. Aunque acortamiento de los telómeros se cree que es la principal causa de la senescencia replicativa, senescencia prematura puede ocurrir en un mecanismo independiente de acortamiento de los telómeros y telomerase- [18], [19]. La senescencia limita la duración de la vida y la capacidad proliferativa de las células, por lo tanto, la inducción de la senescencia es considerado como un importante mecanismo de prevención del cáncer [20] - [22]. Más importante aún, la evidencia emergente ha demostrado que la senescencia inducida por el tratamiento es un mecanismo fundamental a través del cual muchos agentes anticancerosos inhiben el crecimiento de células tumorales [11], [12], [23]. Curiosamente, se ha demostrado que la senescencia inducida por el tratamiento se puede conseguir a dosis mucho más bajas de quimioterapia que las requeridas para inducir la apoptosis, lo que indica que altas dosis de agente contra el cáncer pueden causar apoptosis mientras que los tratamientos de bajo nivel inducen principalmente la senescencia en células de cáncer [12] . En comparación con las estrategias tradicionales de inducción de la apoptosis, este enfoque de baja dosis puede reducir significativamente los efectos secundarios de la terapia contra el cáncer y mejorar así la calidad de vida de pacientes con cáncer. Por lo tanto, es importante entender si baja dosis de RV puede suprimir el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la inducción de la senescencia prematura.
RV es un compuesto polifenólico natural, no tóxico que se encuentra en abundancia en las uvas, vinos tintos, moras y otros comestibles plantas. Los ensayos clínicos recientes han indicado que la RV se tolera bien y relativamente seguro para el uso en seres humanos [5] - [7]. RV se ha demostrado que inhibe la proliferación de una variedad de células cancerosas a través de la inactivación de las diversas vías de supervivencia celular, incluyendo la vía de la PI3-kinase /AKT [24]. RV también se ha demostrado que presentan actividad potencial quimiopreventivo en varios modelos de tumores inducidos por carcinógenos como el de mama, intestino, hígado, esófago y colon [3], [25], [26]. Por otra parte, se ha informado de que el tratamiento RV inhibe el crecimiento del cáncer de páncreas y mejora los efectos anticancerígenos de gemcitabina posiblemente a través de la supresión de la activación de NF-КB y abajo de la regulación de la expresión de ciclina D1, COX-2, ICAM-1, MMP-9 y survivina en los tejidos tumorales [27]. Aunque los estudios anteriores han indicado que la RV, a dosis altas, puede inhibir la proliferación de células cancerosas mediante la inducción de la apoptosis [28] - [31], un reto importante para el uso de esta leva es que la concentración de RV requerida para inducir la apoptosis en las las células tumorales
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es demasiado grande para lograr
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en un entorno clínico [5] - [7], [32]. Dado que la inducción de la senescencia requiere una concentración mucho más baja de agentes contra el cáncer y por lo tanto produce menos efectos secundarios no deseados [12], tratamos de investigar si el tratamiento con dosis bajas de RV podría inhibir el crecimiento de células cancerosas mediante la inducción de la senescencia prematura. En el presente estudio, mostramos que el tratamiento de dosis baja RV conduce a un aumento significativo de la senescencia asociado a β-galactosidasa (SA-β-gal) tinción y la expresión de p53 y p21 elevada en células de NSCLC, lo que sugiere que el efecto contra el cáncer de RV es en gran parte atribuible a la inducción de la senescencia en células de cáncer de pulmón. Estudios mecanicistas revelan que la senescencia inducida por RV se asocia con un aumento de DSBs de ADN y la producción de ROS en células de cáncer de pulmón. Además, nuestros datos también muestran que la inhibición de la producción de ROS por NAC atenúa DSBs de ADN RV inducida y la senescencia prematura. En conjunto, estos resultados demuestran que el tratamiento con dosis bajas de RV causa senescencia prematura en células de cáncer de pulmón a través de daño en el ADN mediada por ROS, que ponen de manifiesto una importante contribución de la inducción de la senescencia de los efectos anticancerígenos de RV.
Resultados
RV inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón en una manera dependiente de la dosis
estudios previos han indicado que las dosis más altas de tratamiento de RV pueden inhibir la proliferación de células tumorales mediante la inducción de la apoptosis [28] - [31], pero una reto importante para esta estrategia apoptosis que causan es que la concentración requerida para inducir la apoptosis en las células tumorales
in vitro
no es accesible
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[5] - [7], [32]. Por lo tanto, es importante para determinar si el tratamiento de dosis baja RV afecta el crecimiento de las células tumorales. Con este fin, se trataron las células de cáncer de pulmón A549 y H460 con diferentes dosis bajas de RV (0-50 mM) para examinar si el tratamiento de RV tiene ningún impacto en la formación de colonias de células de NSCLC. ensayos de supervivencia clonogénicos demostraron que incluso tan baja como 10 mM de tratamiento RV puede suprimir significativamente la actividad de formación de colonias de las células A549 y H460 (Figs. 1A, 1B y 1C). Los datos también muestran que la supresión inducida por RV de la formación de colonias se correlaciona bien con las concentraciones de RV, lo que sugiere que el tratamiento RV inhibe el crecimiento clonogénico de células de NSCLC en una forma dependiente de la dosis.
ensayos de supervivencia clonogénicos (A) muestran que el número de colonias de células derivadas de cáncer disminuye con dosis RV. (B) Los resultados de los ensayos clonogénicos se normalizaron para la supervivencia clonogénico de las células A549 de control y se expresan como% de control. (C) Los resultados de los ensayos clonogénicos se normalizaron para la supervivencia clonogénico de control de células H460 y se expresan como% de control. **,
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RV dosis baja inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de un mecanismo de apoptosis independiente de
A pesar de que ha sido muestran que las dosis más altas (100 a 200 m) de tratamiento RV pueden inducir apoptosis en células tumorales [28] - [31], no se sabía si baja RV dosis suprime el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la inducción de la apoptosis. Debido a que activan la caspasa-3 y PARP escindidos son medidas bien documentados de la apoptosis [33], [34], se investigó si el tratamiento de baja dosis de RV tiene ningún efecto sobre la expresión de PARP se activa la caspasa-3 y se escindió en células A549 y H460. Como se muestra en la Figura 2, los datos de transferencia Western revelaron que el tratamiento RV baja dosis no causó ningún cambio significativo en la expresión de PARP escindida y activan la caspasa-3 en células H460 A549 o. Por el contrario, la camptotecina tratamiento (CPT) resultó en un aumento pronunciado en PARP escindida y se activa la caspasa-3 de expresión tanto en las células A549 y H460 (Figs. 2A y 2B). Estos resultados sugieren fuertemente que la baja dosis RV inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de un mecanismo de apoptosis independiente.
se realizaron (a) ensayos de Western blot para determinar la expresión de PARP activada la caspasa-3 y se escindió en células A549. Actina se utilizó como control de carga. Se llevaron a cabo (B) ensayos de Western blot para determinar la expresión de la caspasa-3 activada y PARP escindida en las células H460. Actina se utilizó como control de carga.
RV induce senescencia prematura en células de cáncer de pulmón
Se ha propuesto que la inducción de la senescencia prematura es un mecanismo importante por el cual la radiación ionizante y muchos agentes quimioterapéuticos ejercen sus efectos contra el cáncer [11] - [13], [15], [17], [23]. Por lo tanto, tratamos de examinar si el tratamiento a dosis bajas RV induce la senescencia prematura en las células NSCLC. Debido a la mayor actividad SA-β-gal es un biomarcador bien establecido de la senescencia [16], se investigó si el tratamiento de dosis baja RV induce senescencia prematura en las células A549 y H460 por tinción SA-β-gal. Como se muestra en la Figura 3A, los resultados indican que el número de células senescentes positivos SA-β-gal se incrementa notablemente en RV-tratada frente a células A549 de control y H460. Por otra parte, el porcentaje de SA-β-gal células positivas aumenta con la dosis de RV, lo que sugiere que el tratamiento RV induce senescencia prematura en células de cáncer de pulmón en una manera dependiente de la dosis (Figs. 3B y 3C).
tinción (A) SA-β-gal se incrementó con dosis de RV en ambas células A549 (panel superior) y las células H460 (panel inferior). (B) El porcentaje de células senescentes positivos SA-β-gal en las células A549 tratadas con RV y control se presentan como media ± SEM. (C) El porcentaje de SA-β-gal células senescentes positivos en las células tratadas con RV y control H460 se presentan como media ± SEM. Se llevaron a cabo (d) ensayos de Western blot para determinar la expresión de p53, p21 y EF1A en células A549. Actina se utilizó como control de carga. Se llevaron a cabo (E) ensayos de Western blot para determinar la expresión de p53, p21 y EF1A en células H460. Actina se utilizó como control de carga. *,
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También examinaron los niveles de expresión de p53 y p21, dos moléculas importantes que intervienen en la regulación de la senescencia [12], [15], [17], [35], en las células NSCLC RV-tratada. de datos de transferencia de Western demostraron que los niveles de expresión de p53 y p21 fueron significativamente superiores en las células tratadas con RV, en comparación con el control y A549 células H460 (Figs. 3D y 3E). Estos resultados sugieren que la vía de p53-p21 está implicado en la senescencia prematura RV inducida en células de cáncer de pulmón. Curiosamente, nuestros datos también muestran que el tratamiento RV significativamente regula a la baja la expresión de EF1A en células A549 y H460 (Figs. 3D y 3E), lo que sugiere que EF1A puede desempeñar un papel importante en la regulación de la senescencia prematura RV-inducida en células de NSCLC.
RV tratamiento provoca daños en el ADN y aumenta la producción de ROS en células de cáncer de pulmón
Muchos agentes quimioterapéuticos y radiaciones destruyen las células tumorales a través de la inducción de daño en el ADN. Fosforilada H2AX (γH2AX) es un marcador robusto de ADN DSBs [36]. Para determinar si el daño del ADN contribuye a efectos anticancerígenos RV inducida, se realizaron ensayos de focos γH2AX para examinar si el tratamiento de RV hace que las DSB de ADN en células de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Figura 4, nuestros datos demuestran que el tratamiento con RV en un aumento significativo en la formación de focos γH2AX tanto en las células A549 y H460 (Figs. 4A, 4B y 4C). Como la formación de focos γH2AX es un sustituto importante de DSBs de ADN [36], estos resultados demuestran por primera vez que el efecto contra el cáncer de RV es atribuible al menos en parte al daño del ADN RV-inducida en células de NSCLC.
(A) DSBs de ADN se determinaron por microscopía de inmunofluorescencia γH2AX como se ha descrito previamente (16). Se presentan imágenes de inmunofluorescencia representativas de γH2AX focos en células A549 y H460 RV-tratada. (B) El porcentaje de células positivas γH2AX focos en células A549 tratadas con RV se presentan como media ± SEM. (C) El porcentaje de células positivas γH2AX focos en células H460 tratadas con RV se presentan como media ± SEM. (D) Los niveles de ROS se midió mediante tinción con DCF-DA y citometría de flujo análisis a las 24 h después del tratamiento de RV. Los niveles de ROS en células A549 tratadas con RV se presentan como factor de cambio en comparación con los niveles en las células de control. (E) Los niveles de ROS en células H460 tratadas con RV se presentan como factor de cambio en comparación con los niveles en las células de control. *,
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Nosotros y otros han demostrado que las ROS juegan un papel fundamental en la mediación genotóxico inducido por el estrés daño en el ADN [37], [ ,,,0],38]. Por lo tanto, la hipótesis de que la RV puede causar RBC de ADN a través de una mayor producción de ROS en células de NSCLC. Para probar esta hipótesis, se investigó si el tratamiento RV tiene ningún impacto en la producción de ROS en células de cáncer de pulmón. DCF-DA tinción y el flujo de ensayos de citometría mostraron que los niveles de ROS se incrementaron notablemente en las células A549 y H460 RV-tratado en comparación con la de las células de control (Figs. 4D y 4E). Estos resultados sugieren que RV puede inducir células de cáncer de pulmón senescencia prematura a través de daño del ADN mediada por ROS.
NAC atenúa el daño del ADN inducido por RV y senescencia prematura de células de cáncer de pulmón
Aunque nuestros datos han demostrado que el daño del ADN RV inducida se asocia con un aumento de la producción de ROS en las células NSCLC (Fig. 4), que aún no se ha determinado si la inhibición de la producción de ROS utilizando antioxidantes pueden prevenir el daño del ADN inducido RV y senescencia prematura. Para este fin, las células con NAC preincubaron antes del tratamiento RV para determinar si NAC puede atenuar DSBs de ADN RV inducida por senescencia prematura y en células de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Figura 5A, nuestros datos demuestran que el pretratamiento con NAC inhibe significativamente la formación de focos γH2AX RV inducida en las células A549 y H460. Además, los resultados de tinción SA-β-gal demuestran que el porcentaje de células senescentes prematuros RV inducida se reduce sustancialmente en las células tratadas con NAC (Figs. 5D y 5E). En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la hipótesis de que RV induce células de cáncer de pulmón senescencia prematura a través de daño del ADN mediada por ROS.
(A) DSBs de ADN se determinaron por microscopía de inmunofluorescencia γH2AX como se ha descrito previamente (16). Se presentan imágenes de inmunofluorescencia representativas de γH2AX focos en células A549 y H460. (B) La inhibición de ROS por NAC (5 mM) disminuye RV (30 M) inducida γH2AX focos en células A549. (C) La inhibición de ROS por NAC (5 mM) disminuye RV (30 M) inducida γH2AX focos en células H460. (D) La inhibición de ROS por NAC atenúa la senescencia prematura RV-inducida en células A549. (E) La inhibición de ROS por NAC atenúa la senescencia prematura RV-inducida en células H460. **,
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RV induce la expresión NOX5 en células de cáncer de pulmón
A continuación, hemos tratado de determinar los mecanismos por el cual RV induce la generación de ROS en células de cáncer. Se informó de que el aumento de AMP cíclico intracelular (cAMP) pueden contribuir a la acumulación de ROS mitocondrial [39]. Curiosamente, un estudio reciente realizado por Park et al. ha demostrado que el tratamiento RV aumenta los niveles de cAMP en las células C2C12 de ratón [40]. Para determinar si RV altera los niveles de cAMP y, a su vez induce la generación de ROS en células de cáncer de pulmón, se han detectado niveles de cAMP en células A549 y H460 diferentes entre sí después del tratamiento de RV. Los resultados muestran que el tratamiento de la EIA RV no tiene ningún efecto significativo sobre los niveles de AMPc en las células A549 (Figura S1A). Más interesante, los datos demuestran que la RV inhibe los niveles de cAMP en células H460 (Figura S1B). Estos resultados sugieren que el AMPc puede no ser un jugador clave en la mediación de la generación de ROS RV inducida en células de cáncer de pulmón.
Los NADPH oxidasas (NOXS) son una familia de enzimas transmembrana que generan superóxido y otros ROS [41] . Para entender mejor cómo RV induce la generación de ROS en las células cancerosas, se investigó si el tratamiento de RV tiene ningún efecto sobre la expresión de Nox1, Nox2, Nox3, Nox4 y NOX5 en las células NSCLC. resultados en tiempo real RT-PCR indican que Nox1, 2 y 5 se expresan abundantemente en las células A549 y H460, mientras que Nox 3 y 4 son apenas detectables en células de cáncer de pulmón (Figura S2). Sorprendentemente, nuestros datos revelan que el tratamiento RV aumenta selectivamente la expresión NOX5 tanto en las células A549 y H460 (Figs. 6A y 6C), lo que sugiere que la generación de ROS inducida por RV en las células cancerosas es probablemente atribuible a una mayor expresión NOX5. Teniendo en cuenta el importante papel de las enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) y tiorredoxina (TXN) en la modulación intracelular de ROS equilibrio [42], decidimos determinar si el tratamiento de RV afecta a la expresión de SOD y TXN en células de cáncer de pulmón. El tiempo real de PCR datos demuestran que el tratamiento RV sólo provoca un aumento modesto (menos de 2 veces) en la expresión SOD2 en células A549, pero no tiene efecto sobre la expresión de SOD1, SOD2 y TXN mRNAs en células H460 (Figs. 6B y 6D). En conjunto, estos datos sugieren que la RV puede inducir la generación de ROS en células de cáncer a través hasta la regulación de la expresión NOX5.
Las células (A) se trataron con 50 mM de RV o DMSO como control del vehículo. Veinticuatro horas después del tratamiento de RV, los niveles de expresión de Nox1, Nox2, y NOX5 ARNm se determinaron utilizando en tiempo real de RT-PCR. (B) Los niveles de expresión de SOD1, SOD2 y TXN en células A549 se determinaron por tiempo real RT-PCR. (C) Los niveles de expresión de Nox1, Nox2, y NOX5 en células H460 se presentan como el cambio veces (media ± SEM). (D) Se presentan los niveles de expresión de SOD1, SOD2 y TXN en células H460. **,
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Discusión
La senescencia celular es un estado de la detención del ciclo celular permanente que puede ser desencadenada por una variedad de tensiones incluyendo daño en el ADN, acortamiento de los telómeros y el estrés oxidativo. La senescencia limita la duración de la vida y la capacidad proliferativa de las células, por lo tanto, la inducción de la senescencia es considerado como un importante mecanismo de prevención del cáncer [20] - [22]. Más importante aún, la evidencia creciente ha demostrado que la senescencia inducida por el tratamiento es un mecanismo fundamental de la acción de muchos agentes quimioterapéuticos y la radioterapia [11], [12], [15], [17], [23]. Sin embargo, la contribución de la inducción de la senescencia de anticáncer de autocaravanas y efectos quimiopreventivos no ha sido bien dilucidado. Aquí nos proporcionan datos experimentales que demuestran que el tratamiento con dosis bajas de RV inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de un mecanismo de apoptosis independiente. Los resultados revelan que RV puede ejercer su contra el cáncer y las actividades quimiopreventivos a través de la inducción de senescencia en células de cáncer. De acuerdo con nuestras observaciones, Rusin et al. también informó de que el tratamiento RV induce senescencia fenotipo similar en células de cáncer [43]. Este es un hallazgo significativo, porque la inducción de la senescencia, a diferencia de la apoptosis, requiere mucha menor concentración de RV, lo que sugiere RV podría ser clínicamente útil. Por otra parte, estos estudios ponen de relieve la importancia de la inducción de la senescencia en la mediación de quimiopreventivo de autocaravanas y efectos contra el cáncer.
Se ha bien establecido que la inducción de daño en el ADN es un mecanismo central a través del cual muchos agentes contra el cáncer, incluyendo radiación ionizante matar las células tumorales [13], [15], [38], [44]. De los diversos tipos de daño en el ADN, el ADN DSBs son los más citotóxico debido a su gran potencial de causar la muerte celular y /o la detención del ciclo celular. Por lo tanto, se pensaba que un aumento de la capacidad de reparación del daño en el ADN en las células tumorales a ser un importante contribuyente a la terapia de resistencia durante los tratamientos del cáncer [45]. Curiosamente, se ha demostrado que muchos agentes que dañan el ADN, como la radiación ionizante puede inducir daño en el DNA mediada por senescencia prematura en las células cancerosas, lo que sugiere que estos agentes terapéuticos pueden ejercer sus efectos contra el cáncer a través de daño en el DNA mediada por senescencia prematura [13], [ ,,,0],15]. Aunque nuestros datos han demostrado que la RV induce senescencia prematura en células de cáncer de pulmón en una forma dependiente de la dosis, que era en gran medida desconocido si el daño del ADN está implicada en la senescencia RV inducida en las células tumorales. Este estudio reveló que γH2AX focos, un sustituto importante del ADN DSBs, se incrementaron notablemente en células de NSCLC RV-tratado en comparación con las células de control. Estos datos sugieren que la senescencia prematura inducida por daño en el ADN puede contribuir a los efectos contra el cáncer de RV. De acuerdo con nuestras observaciones, se encontró que RV puede inducir roturas de ADN de plásmido en presencia de Cu (II) y en condiciones oxidantes [46]. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el tratamiento de dosis baja RV suprime el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la senescencia prematura inducida por daño en el ADN.
La activación de la vía de p53-p21 por daño en el ADN se ha demostrado que es un mecanismo crítico subyacente SIPS [12], [15], [17], [18]. Aquí mostramos que la senescencia prematura RV inducida se asocia con aumento de la expresión de p53 y p21 en células de NSCLC, lo que sugiere que la activación de la vía de p53-p21 pueden desempeñar un papel importante en la modulación de la senescencia RV inducida en células de cáncer de pulmón. Más importante aún, se encontró también que la senescencia inducida por RV se correlaciona bien con una disminución significativa en la expresión EF1A en células A549 y H460. Estos nuevos resultados demuestran, por primera vez, que la baja regulación de EF1A está implicada en la senescencia prematura RV inducida en células de cáncer de pulmón. Consistente con estas observaciones, un estudio reciente ha sugerido que la disminución de la expresión de EF1A es un biomarcador potencial de la senescencia prematura [47]. Sin embargo, se necesitan más estudios para definir el papel exacto de EF1A en la modulación de la senescencia prematura RV inducida en las células cancerosas.
Muchos agentes contra el cáncer y la radiación ionizante destruir las células tumorales en gran medida a través de la generación de ROS [48]. Por otra parte, el aumento de ROS puede desencadenar daño oxidativo del ADN y causar DSBs de ADN, lo que conduce a la senescencia prematura [37]. Para determinar el papel de ROS en la senescencia prematura RV inducida en células de cáncer de pulmón, se investigaron los niveles de ROS en A549 RV-H460 tratadas y células por medio de tinción de citometría de flujo y ensayos de DCF-DA. Los datos muestran que la senescencia inducida por RV se asocia con un aumento de la producción de ROS y DSBs de ADN en células de cáncer de pulmón, lo que sugiere que RV puede inducir senescencia prematura en células de cáncer de pulmón a través de los daños del ADN mediada por ROS. La contribución importante de ROS al daño del ADN inducido por RV y senescencia prematura fue confirmado por las observaciones de que la inhibición de la producción de ROS por NAC atenúa el daño del ADN RV inducida y la senescencia en células de NSCLC. Consistente con estas observaciones, un efecto pro-oxidante de RV también se observó en las células de leucemia U937 y se caracterizó por el agotamiento de GSH y un aumento en la producción de ROS [49]. Además, los estudios anteriores de Hadi y compañeros de trabajo también mostraron que RV podría aumentar la generación de ROS y el daño del ADN inducido por ROS en linfocitos periféricos humanos [50], [51]. En conjunto, estos resultados demuestran que la baja dosis RV inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón a través de la inducción de la senescencia a través de daño del ADN mediada por ROS.
Es de destacar que no hay evidencia de que RV puede actuar como un eliminador de ROS en las células normales para proteger contra ionizante estrés oxidativo inducido por la radiación y la lesión de los tejidos [52], lo que sugiere que la RV puede tener efectos diferentes sobre la producción de ROS en normales frente a células cancerosas. Puesto que los sistemas redox aberrantes se observan con frecuencia en muchas células tumorales [48], [53], [54], es posible que RV puede suprimir selectivamente el crecimiento de células tumorales con poca o ninguna toxicidad para las células normales debido a su redox diferencial estado. De acuerdo con esta hipótesis, nuestros datos muestran que el tratamiento RV no tiene ningún efecto significativo sobre la expresión de SOD1, SOD2 y TXN en células H460 de cáncer de pulmón, aunque se informó de que RV podría inducir un aumento sustancial (más de 6 veces) en expresión SOD2 en las células normales [55]. Más importante, nuestros estudios demuestran por primera vez que RV aumenta selectivamente la expresión NOX5 en células de NSCLC, lo que sugiere que RV puede inducir la generación de ROS en células de cáncer a través de la regulación positiva de la expresión NOX5.
Materiales y Métodos
Reactivos
Resveratrol (Trans-3, 4 ', 5-trihydroxystilnene) y todos los otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y otros medios de cultivo se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Anticuerpo de conejo anti-p53 humana y el anticuerpo monoclonal EF1A conejo anti-humano se adquirieron de Cell Signaling (Danvers, MA). anticuerpo p21 monoclonal anti-humano de ratón se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology. anticuerpo β-actina monoclonal se adquirió de Sigma. Un kit de tinción asociada a la senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal) se adquirió de señalización celular. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-fosfo-histona H2AX (γH2AX) se adquirió de Millipore (Billerica, MA). reactivo TRIzol y sistema de síntesis de primera-soporte superíndice III se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Cíclica kit de AMP (cAMP) EIA se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).
Líneas celulares y
no pequeñas de cáncer de pulmón de células Humano (NSCLC) líneas celulares de cultivo
A549 y H460 fueron adquiridos de American Type Culture Collection. Las células A549 se cultivaron en medio DMEM que contiene 10% de FBS, 2 mM L-glutamina y 100 microgramos /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). células H460 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 10% de FBS, 2 mM L-glutamina y 100 microgramos /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen).
supervivencia clonogénico ensayo
ensayos clonogénicos eran realizado para determinar los efectos del tratamiento RV en la capacidad de formación de colonias de células de NSCLC. Brevemente, las células A549 y H460 de cáncer de pulmón fueron cultivadas a baja densidad en presencia de diferentes concentraciones de RV o DMSO como control del vehículo en placas de 60 mm durante 10 a 12 días para permitir que las colonias de células formación. Las colonias se fijaron y se tiñeron con violeta de cristal 0,5% (Sigma) en metanol durante 30 min. El número de colonias (≥ 50 células) se obtuvo usando una microscopía.
asociada a senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal) tinción
En la tinción in situ de SA-β-gal se realizó con un kit de tinción de senescencia β-galactosidasa (Señalización celular) como se describe anteriormente [56].
Western Blot análisis
células A549 y H460 fueron tratados con diferentes dosis de RV o DMSO como controlar. proteínas celulares totales se prepararon a 24 h post-tratamiento usando tampón de lisis celular (Cell Signaling) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteinasa (Sigma). Se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [56]. Brevemente, cincuenta microgramos de muestras de proteínas se resolvieron en 10% geles Mini-Protean TGX (Bio-Rad) y se transfirieron a 0,2 M membrana de PVDF (Millipore). Las transferencias se bloquearon con leche no grasa al 5% durante 1-2 horas a temperatura ambiente y después se sondearon con anticuerpos primarios y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de un extenso lavado con TBS-T, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario conjugado a HRP apropiado para 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando un sistema ECL Plus Western Blot Detección (GE Healthcare Life Science).
análisis microscópico de inmunofluorescencia de γH2AX focos
Las células fueron cultivadas en portaobjetos de cámara de 4 pocillos durante la noche y la siguiente día trató con RV o DMSO (control del vehículo). Al final de los tiempos de tratamientos deseados, las células fueron fijadas con helado de 4% de paraformaldehído durante 10 min y se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 /PBS en hielo durante 10 min.