Extracto
Antecedentes
palmitato, un ácido graso saturado (FA), se sabe que inducen toxicidad y muerte celular en diversos tipos de células. Resveratrol (RSV) es capaz de prevenir la patogénesis y /o desacelerar la progresión de una variedad de enfermedades. Varios
in vitro
y
in vivo
estudios también han demostrado un efecto protector del VRS en la acumulación de grasa inducida por el FAS. Además, retículo endoplasmático estrés (ER) recientemente se ha relacionado con las respuestas celulares adipogénicos. Para hacer frente a la hipótesis de que el efecto del VRS en la acumulación de grasa excesiva promovido por el FAS saturadas elevados podría estar parcialmente mediada por una reducción del estrés ER, se estudió la acción de RSV sobre el estrés ER inducida experimentalmente usando palmitato en varias líneas celulares de cáncer.
Principales conclusiones
nos muestran que, de forma inesperada, RSV promueve una amplificación de palmitato de toxicidad y muerte celular y que este mecanismo es probablemente debido a una perturbación de la acumulación de palmitato en la forma de triglicéridos y a una fluidez de la membrana menos importante variación. Además, disminuye el VRS especies de radicales de oxígeno generación (ROS) en las células tratadas-palmitato sino que conduce a la proteína-1 empalme X-box unión mejorada (XBP1) y la expresión de C /EBP proteínas homólogas (CHOP). Estos efectos moleculares son inducidos al mismo tiempo para la caspasa-3 de escisión, lo que sugiere que RSV promueve lipoapoptosis palmitato principalmente a través de un mecanismo dependiente de estrés ER. Por otra parte, la reversión lipotoxicidad inducida por ácido eicosapentaenoico (EPA) o por un receptor X del hígado (LXR) agonista refuerza la hipótesis de que la inhibición RSV-mediada de palmitato de canalización en piscinas de triglicéridos podría ser un factor clave en la agravación de la citotoxicidad inducida por palmitato.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que RSV ejerce su función citotóxica en las células cancerosas expuestas a un contexto FA saturada principalmente por la inhibición de la acumulación de triglicéridos, probablemente conduce a una acumulación palmitato intracelular que desencadena una mediada por lípidos la muerte celular. Además, esta muerte celular es promovido por el estrés ER a través de un proceso de apoptosis mediada por CHOP y puede representar una estrategia potencial contra el cáncer
Visto:. Rojas C, Pan-Castillo B, Valls C, G Pujadas, García-Vallve S, Arola L, et al. (2014) El resveratrol Mejora el estrés ER inducida por palmitato y apoptosis en células cancerosas. PLoS ONE 9 (12): e113929. doi: 10.1371 /journal.pone.0113929
Editor: Guillermo Velasco, Universidad Complutense, España |
Recibido: 14 Septiembre, 2012; Aceptó 3 de noviembre de 2014; Publicado: Diciembre 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Rojas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta práctica investigadora fue apoyada por las subvenciones del Ministerio de Educación y Ciencia del Gobierno español (AGL2008-00387 /ALI y AGL2011-25831 /ALI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los adipocitos tienen una capacidad única para almacenar el exceso de ácidos grasos (FAS) en forma de triglicéridos en las gotas de lípidos, mientras que los tejidos no adiposos, tales como el hígado, tienen una capacidad limitada de almacenamiento de lípidos. Una sobrecarga de conjuntos combustibles inducir lipotoxicidad y la muerte celular en las células no adiposas, incluyendo los cardiomiocitos, las células beta y hepatocitos [1] - [4]. Las altas dosis de AF saturados, tales como palmitato, pueden causar daño celular e incluso la muerte celular, mientras que las concentraciones elevadas de oleato y linoleato, que son las AF insaturados, son mejor tolerados [1], [2]. Aunque los mecanismos subyacentes detalladas lipotoxicidad inducido por el formaldehído no son concluyentes, en general se acepta que las especies reactivas de oxígeno (ROS) y estrés del retículo endoplasmático (ER) son los principales mecanismos intracelulares implicadas [4] - [8].
el ER es el principal sitio en la célula para el plegamiento de proteínas y el tráfico, y muchas funciones celulares dependen de este compartimiento. La falta de capacidad de adaptación de la sala de emergencia se define como el estrés ER, y células presentan diferentes respuestas adaptativas para aliviar esta situación. La respuesta de la proteína desplegada (UPR) es la respuesta adaptativa al estrés ER primaria y se cruza con muchos diferentes vías inflamatorias y de señalización de estrés [9], [10]. El seguimiento de la luz del RE y señalización a través de las ramas canónicas de la UPR están mediados por las siguientes proteínas asociadas a la membrana tres Er: (a) PERK (PKR-como factor de iniciación eucariota 2a quinasa); (B) IRE1 (enzima que requiere inositol 1); y (c) ATF6 (factor activador de la transcripción-6). Cuando el estrés ER no se resuelve, la célula es funcionalmente comprometida y puede sufrir apoptosis. En la actualidad, varias vías han estado implicados directamente en la sala de emergencias de la apoptosis inducida por el estrés. Por ejemplo, el factor de transcripción C /proteína homóloga EBP (CHOP) es inducida por el estrés ER en el nivel transcripcional, que sensibiliza las células a la apoptosis por la baja regulación de linfoma de células B 2 (Bcl-2) y la activación de GADD34 y ERO1α [11], [12]. estrés ER también activa IRE1 y PERK, que se han implicado en la activación de la pro-apoptótica de c-Jun NH
2-quinasa terminal (JNK) [13], [14].
Varios informes han estudiado la relación entre los efectos del resveratrol (VSR) (en sus resultados de protección o citotóxicos) y el estrés ER factores como nuevas dianas moleculares relacionados sobre la acción de los polifenoles [15] - [18]. Además, muchos
in vitro
y
in vivo
estudios también han demostrado un efecto protector de RSV y otros polifenoles sobre la acumulación de grasa en el hígado inducida por el FAS saturado o una dieta alta en grasas [19] - [22]. Aparte de estos efectos protectores, RSV es capaz de inhibir la iniciación del tumor, promoción y progresión en una variedad de sistemas de cultivos celulares y modelos animales por mecanismos que incluyen la detención del ciclo celular, la inhibición de las vías de la quinasa y la activación de la apoptosis [23] - [26].
Curiosamente, alteraciones metabólicas, que se caracteriza por un aumento de la glucólisis y la lipogénesis, son una característica de las células del cáncer [27], [28]. Por lo tanto, la proliferación de células cancerosas presentes activamente no sólo cambios cuantitativos en
de novo
la biosíntesis de lípidos, sino también modificaciones en la composición de la membrana lipídica, que afecta a la fluidez de membrana, transducción de señales y la expresión de genes [29], [30]. Una amplia variedad de cánceres presentan cambios en la composición de los lípidos de membrana, que se caracteriza principalmente por AG saturados y monoinsaturados acumulación FA. Esta acumulación parece ser menos debido a un aumento de la captación de conjuntos combustibles saturados y monoinsaturados SAF que a la síntesis endógena exacerbada de AF [31], [32].
Además, saturados y no saturados AF difieren significativamente en su contribución a lipotoxicidad. Estudios anteriores con cultivos de células primarias y líneas celulares de cáncer han sugerido que la lipotoxicidad de la acumulación de cadena larga AF es específico para las AF saturadas. Esta selectividad se ha atribuido a la generación de especies de lípidos proapoptótico específicas o moléculas de señalización en respuesta a las AF insaturados saturados pero no [33]. La naturaleza de estas señales puede variar de unos tipos de células, sino que incluye la generación de ROS,
de novo
ceramida síntesis, la generación de óxido nítrico, la disminución de la fosfatidilinositol-3-quinasa, y los principales efectos en la estructura y la función mitocondrial. AF de cadena larga también pueden suprimir factores apoptóticos anti, tales como Bcl-2 [33].
Para probar la hipótesis de que el deterioro RSV de la acumulación de grasa excesiva inducida por el FAS saturados elevadas podría ser parcialmente mediado por una reducción de la respuesta de estrés ER, nos inducida experimentalmente estrés ER usando palmitato en varias líneas celulares de cáncer con o sin RSV. Inesperadamente, los niveles de RSV sub-tóxicos (25 M) no rescató a células de ER-estrés y lipoapoptosis inducida por palmitato. En contraste, se obtuvieron los siguientes: (a) una apoptosis mediada por RSV sólo en presencia de la FA saturada, y (b) una fuerte promoción de la lipotoxicidad por el incremento concomitante en la cantidad FA. Nos caracteriza este efecto RSV a nivel molecular y encontramos que la estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1) papel (insaturación enriquecimiento) está probablemente relacionado con este "fenotipo" celular, pero el almacenamiento, principalmente palmitato en las piscinas de triglicéridos parece estar implicado críticamente en el mayor sensibilidad de las células cancerosas a la lipotoxicidad palmitato inducida. Estos resultados revelan un mecanismo citotóxico RSV relativamente desconocido que podría ser aprovechada para orientar la promoción de la apoptosis en las células transformadas.
Resultados
RSV induce estrés ER en las células HepG2
La figura 1 muestra que las células HepG2 expuestas a concentraciones crecientes de RSV (que van de 5 a 100 mM) para diferentes duraciones (4, 8 y 24 h) tienen alteraciones en la homeostasis ER, por consiguiente, la presentación de mecanismos de estrés ER activos. Se evaluó el efecto detallada sobre X-box proteína de unión al 1 empalme (XBP1) y CHOP expresión (figura 1A y 1B). El aumento máximo en el empalme XBP1 (casi todo el XBP1 en forma empalmada) y en la expresión de CHOP (modificar 51,29 ± 4,81 veces; p & lt; 0,001) fue a una concentración RSV 100 mM y un 24 h de incubación. Aunque el estrés ER en 24 h es evidente, hay una falta de correlación con la viabilidad celular, lo que sugiere que aunque la celda está cerca de fallar debido a un mal funcionamiento ER, sigue siendo viable; la disminución de la viabilidad aparece después de 24 h de tratamiento RSV (figura 1C) con un valor de ~ 40% a las 28 h (p & lt; 0,001). Tenga en cuenta que la concentración de RSV seleccionado (25 M) utilizada en otros experimentos no fue capaz de inducir estrés ER significativa en cualquier punto de tiempo.
células HepG2 se expusieron a vehículo (0 M) o concentraciones crecientes de RSV (5, 10 , 25, 50 y 100 mM) y se recogieron en puntos de tiempo específicos (8, 4 y 24 h). A) RSV ejerce una activación tiempo y dependiente de la concentración de empalme XBP1 (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 pb de amplificación). imagen representativa de tres B de RSV independiente experimentos) ejerce un tiempo y dependiente de la concentración activación de la expresión CHOP. C) RSV disminuye la viabilidad HepG2 a dosis más altas y tiempos de incubación. La viabilidad se evaluó usando un ensayo de MTT. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas respecto al control (vehículo) fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni test post hoc: *** p & lt; 0,001 y * p & lt; 0,05
RSV exacerba palmitato inducida. la muerte celular en las células HepG2
muerte celular
palmitato inducida (expresado como una disminución de la viabilidad celular) se evaluó mediante un ensayo de MTT en las células HepG2. También se evaluó el efecto sobre las células RSV-palmitato tratada. Como se muestra en la figura 2A, el aumento de las concentraciones de palmitato (que van desde 0,2 mM a 1 mM) causada un tiempo-(4, 8 y 24 h) y una disminución dependiente de la dosis de la viabilidad celular. Cuando las células tratadas con palmitato fueron co-incubaron con concentraciones crecientes de RSV (que van desde 25 mM a 100 mM), una disminución adicional en la viabilidad HepG2 se observó. Este efecto fue más evidente a los 50 M (~ 60% de disminución máxima de la viabilidad celular; p & lt; 0,001) y 100 M (~ 80% de disminución máxima de la viabilidad celular; p & lt; 0,001) Tratamientos de RSV en 24 h de co-incubación (figura 2B-D). Debido a la falta de un efecto aditivo de la concentración de 25 mM RSV sobre la muerte celular inducida por palmitato-(~ 20% de disminución máxima de la viabilidad celular; ns), se seleccionó esta concentración para estudiar adicionalmente el efecto de RSV sobre el estrés ER y su relación con la acumulación de grasa inducida por el FAS elevados.
muerte celular
palmitato inducida (expresada como el porcentaje de viabilidad celular) se evaluó mediante un ensayo de MTT en las células HepG2. También se evaluó el efecto sobre las células RSV-palmitato tratada. A) El aumento de las concentraciones de palmitato (que van desde 0,2 mM a 1 mM) causó un tiempo-(4, 8 y 24 h) y una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular. células palmitato tratados también eran co-incubaron con concentraciones crecientes de RSV como sigue: B) 25 M RSV; C) 50 M de RSV y D) 100 μMRSV. Se observó una disminución adicional en HepG2 viabilidad en comparación con los tratamientos con solo palmitato en la RSV 50 mM y 100 mM ensayos de RSV. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas respecto al control (vehículo) fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni test post hoc: *** p & lt; 0,001 y * p & lt; 0,05
RSV aumenta palmitato inducida. ER estrés en las células cancerosas
El aporte de estrés ER en la muerte celular inducida por palmitato fue investigada inicialmente utilizando empalme XBP1 como un marcador de estrés ER. La Figura 3A muestra que una concentración RSV sub-tóxico (25 M) indujo un aumento concomitante en el efecto palmitato de empalme XBP1. A fin de verificar los resultados, se estudiaron otros marcadores de estrés ER, como ATF4, ATF6 y CHOP. Curiosamente, el efecto RSV también se observó (Figura 3B) en CHOP (17,03 ± 0,01 vs. 8,91 ± 0,65; p & lt; 0,001; el cambio máximo veces era entre el RSV-tratadas y las muestras no tratadas) expresión y ATF4 (3,13 ± 0,35 vs. 1,7 ± 0,09; p & lt; 0,01; el cambio máximo veces era entre la de las muestras no tratadas RSV-tratada y). El efecto fue dependiente de palmitato, lo que indica que a pesar de que la misma concentración de polifenol estaba presente, el estímulo que promueve un aumento de los efectos moleculares para casi todos los marcadores de estrés ER estudiados fue la elevación FA.
células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con o sin 25 mM RSV durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) de empalme XBP1. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. B) ATF4, CHOP y los niveles de expresión de ARNm ATF6. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. Las células HeLa se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con o sin 25 mM RSV durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. C) La susceptibilidad de las células HeLa con el estrés ER-inducida por palmitato. XBP1 empalme. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. D) RSV exacerba empalme palmitato inducida en células HeLa. XBP1 empalme. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Una imagen representativos de tres experimentos independientes se muestra E) RSV amplifica la señalización mediada CHOP. CHOP los niveles de expresión de ARNm. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas respecto al control (vehículo) fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni test post hoc:. *** p & lt; 0,001 y ** p & lt; 0,01
ATF6 era el único estudiados marcador de estrés ER que parecía no estar afectada por el tratamiento. Sin embargo, se requiere ATF6 translocación al aparato de Golgi para su activación; Por lo tanto, es probable que su expresión no se ve afectada.
A nivel mundial, estos resultados sugieren que el VRS promovió cambios en varios mecanismos moleculares que se exacerbaron cuando la cantidad de palmitato aumentó.
Sorprendentemente, el mismo se obtuvo resultado experimental cuando otra línea celular de cáncer, las células HeLa, se utilizó (figuras 3C, 3D y 3E). Esto sugiere que este efecto no se limita a una línea celular de cáncer especificado.
RSV sensibiliza a las células HepG2 con palmitato la apoptosis inducida por
Para evaluar el efecto del RSV en lipoapoptosis palmitato, hemos desarrollado ensayos de Western Blot escindida de la caspasa-3. La proteína proapoptótico caspasa-3 se sintetiza como una proenzima inactiva (32 kDa) que se procesa en las células sometidas a la apoptosis por la auto-proteolisis y /o la escisión por otra proteasa aguas arriba. La forma procesada de la caspasa-3 se compone de gran tamaño (17 kDa) y pequeño (12 kDa) subunidades que se asocian para formar una enzima activa. La caspasa-3 activa proteolíticamente escinde y activa otras caspasas y objetivos relevantes en las células, tales como PARP y DFF [34].
La figura 4A muestra que los tratamientos palmitato solamente indujo un ligero aumento de la caspasa-3 la escisión en dosis más altas (0,75 y 1 mM). Cuando se añadió RSV, en lugar de reducir el nivel de apoptosis, se promovió el efecto lipoapoptotic de palmitato. Por lo tanto, RSV co-tratamiento indujo la siguiente: (a) el aumento de la caspasa-3 de escisión en comparación con la observada con palmitato solo; y (b) la reducción del umbral de concentración FA saturado requerido para provocar el efecto de apoptosis (es decir, 0,5 mM palmitato vs. palmitato 0,5 mM 25 mM RSV).
células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfieren a medio libre de suero con o sin 25 mM RSV durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) Cleaved análisis de caspasa-3 por transferencia de Western. La mancha que se muestra es una imagen representativa de tres experimentos independientes. B) las células HepG2 fueron tratadas con o sin 25 RSV mu M durante 28 h. Antes de un 8 h palmitato-RSV co-tratamiento, las células se incubaron con DCFH-DA (20 mM de concentración final) a 37 ° C durante 30 min. la producción de ROS se muestra como la media de la RFU (unidades de fluorescencia relativa) ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas respecto al control (vehículo o palmitato) se analizaron mediante pruebas t de Student pareada. *** P & lt; 0,001, ** p & lt; 0,01 y * p & lt;. 0,05
producción de ROS se reduce por el VRS en las células HepG2-palmitato tratado
La contribución del estrés oxidativo en la muerte celular palmitato inducida se investigó mediante la detección de la producción de ROS. Para este ensayo, se midió la señal fluorescente después de la oxidación intracelular de ROS (tal como peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo) de la membrana de colorante permeable 2 ', 7'-diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA). La Figura 4B muestra que el cultivo de células HepG2 con concentraciones crecientes de palmitato (que van desde 0,2 mM a 1 mM) durante 8 h causó un aumento en la señal fluorescente (1026 ± 104 vs. 3294 ± 61; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre las muestras no tratadas y las muestras tratadas palmitato). incubaciones anteriores con 25 M de RSV durante 20 h disminuyó la cantidad intracelular de ROS en todas las dosis ensayadas palmitato (2478 ± 36 vs. 1.222 ± 108; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre el palmitato de muestras tratadas y el RSV + palmitato muestras tratadas). Este resultado apoya la capacidad antioxidante establecida de la polifenol [35] y sugiere que los efectos de RSV antes mencionados relacionados con la exacerbación del efecto palmitato en células HepG2 no se deben principalmente a un aumento en la producción de ROS intracelular.
dinámica de SCD1 se alteran en respuesta a RSV
se ha demostrado previamente que entre los estímulos nutricionales que modulan la expresión del gen de SCD1, las grasas saturadas eran activadores fuertes. En miotubos en cultivo, palmitato de aumento de la expresión de SCD1 asociado con un aumento en el almacenamiento de músculo FA [36]. La Figura 5A muestra que 8 h de tratamiento con concentraciones crecientes de palmitato indujo una sobreexpresión significativa de SCD1 en dosis palmitato superiores (1 ± 0,14 vs. 2,21 ± 0,52; p & lt; 0,001; el cambio máximo de plegado fue de entre el palmitato de tratar y las muestras no tratadas ). En contraste, cuando eran células HepG2 pre-tratada durante 20 h con RSV, SCD1 sobreexpresión disminuyó significativamente, lo que sugiere que RSV afecta el aumento palmitato inducida en la expresión de SCD1 (2,21 ± 0,52 vs. 0,7 ± 0,12; p & lt; 0,001; la máxima diferencia era entre las muestras tratadas con palmitato y el RSV + palmitato muestras tratadas). Por el contrario, se obtuvo una ligera disminución en el contenido de proteína cuando SCD1 se estudió a nivel de proteínas (figura 5B). Esta falta de correlación entre el ARNm de SCD1 y los niveles de proteína sugiere que los factores (factores posteriores a la traducción, la regulación de la actividad enzimática) que no sean la expresión de genes también podrían ser importantes para la dinámica SCD1 en respuesta al VRS. Debido a esta discrepancia, hemos desarrollado experimentos siRNA desmontables para aclarar el papel de SCD1 en el estrés ER inducida por VRS. expresión de SCD1 disminuyó significativamente debido a la transfección siRNA (Figura S1 A). Los principales niveles de inhibición se obtuvieron a una concentración 10 nM de ARNsi utilizando siRNA- (3) o el uso de una combinación de los tres oligonucleótidos siRNA siRNA- (1, 2, y 3). De acuerdo con ello, el contenido de proteína de SCD1 (Figura S1B) también se redujo significativamente debido a este enfoque experimental. Una vez que la caída de SCD1 fue validado, se estudió el efecto de este silenciamiento de genes en los mecanismos de estrés ER utilizando empalme XBP1 como un marcador de estrés ER. Curiosamente, como se ha descrito previamente por otros autores [37], SCD1 inhibición activado empalme XBP1 (figura S1C), lo que sugiere que la disminución de insaturación de la membrana podría desencadenar ER-estrés y la muerte celular. Seleccionamos siRNA (3) y la combinación de los tres oligonucleótidos siRNA siRNA- (1, 2, y 3) para estudiar aún más el efecto de la inhibición de SCD1 en un contexto FA saturado (tratamiento palmitato). Sorprendentemente, ambos de los siRNA silenciamiento enfoques (figuras 5C) mostraron que la exposición subsiguiente de palmitato a experimentalmente células no exacerbar empalme XBP1 SCD1-agotado; por el contrario, en presencia de palmitato, este empalme se disminuyó ligeramente. Para validar que este fenotipo celular no era debido a un hipotético "superior" de la estrategia de silenciamiento, se estudió la expresión de SCD1 una vez (3) se transfectó siRNA-. El tratamiento palmitato no pudo revertir la supresión genética de SCD1 (figura 5D). Por lo tanto, como se discute más abajo, otros mecanismos compensatorios promovidas por la inhibición de SCD1 podrían ser responsables de la disminución relativa en el empalme XBP1. Además, la figura 5E muestra que los niveles de CHOP aumentó ligeramente debido a la inhibición de SCD-1, lo que sugiere que a pesar de la disminución relativa de empalme XBP1, otros sensores de estrés ER, como ATF6 o PERK, podrían estar influyendo en la expresión de CHOP. En particular, esta elevación CHOP no es comparable a la obtenida previamente con el RSV + tratamientos palmitato (figura 3B).
células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con o sin 25 M RSV durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) los niveles de expresión del gen de SCD1. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. B) los niveles de proteína de SCD1. Los lisados celulares se prepararon y se analizaron por transferencia Western. Los resultados de las inmunotransferencias por triplicado se cuantificaron por densitometría. Los resultados mostrados en el gráfico representan la relación de SCD1 /tubulina. Un inmunoblot representativo se muestra debajo del gráfico. . Las diferencias significativas respecto al control (vehículo o palmitato) se analizaron mediante pruebas t de Student pareada para la expresión de SCD1 ARNm y por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni test post hoc para la cuantificación de Western blot *** p & lt; 0,001, ** p & lt; 0,01 y * p & lt; 0,05. SCD1 desmontables (C) induce empalme XBP1 pero este empalme se reduce cuando las células SCD1 empobrecido están expuestas a concentraciones crecientes de palmitato. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. D) La disminución de corte y empalme en las células XBP1 palmitato siRNA + no es debido a la restauración de SCD1. Se muestra el porcentaje de la expresión génica de SCD1 relativa. Los resultados se representan como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. E) silenciamiento SCD1 promueve un ligero aumento de la expresión de CHOP. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes.
inhibición de la acumulación de RSV palmitato en piscinas de triglicéridos se correlaciona con el incremento en el CHOP y XBP-1 empalme
Para dilucidar otro posible mecanismo molecular por VRS que promueve la exacerbación de la apoptosis ER estrés derivado, nos centramos nuestra atención en la acumulación de triglicéridos.
almacenamiento de triglicéridos se evaluó mediante tinción de aceite rojo O. La Figura 6A muestra que 8 h de tratamiento palmitato indujo un aumento dependiente de la dosis en el contenido de triglicéridos HepG2 (0,643 ± 0,006 vs. 0,994 ± 0,015; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre las muestras no tratadas y el palmitato de muestras tratadas). A la inversa, cuando se preincubaron células durante 20 h con RSV, el contenido de lípidos intracelular se reduce en todas las concentraciones de palmitato ensayadas (0.951 ± 0.068 vs 0.774 ± 0.011; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre el palmitato de muestras tratadas y el RSV + muestras tratadas palmitato). Estos resultados están de acuerdo con el acumulado
in vitro e
Tarjetas telefónicas evidencia del efecto anti-adipogénica del VRS [38], [39]
células HepG2 in vivo. se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con o sin 25 mM RSV durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) Aceite rojo cuantificación O tinción. la acumulación de triglicéridos se expresa como la media de la OD (densidad óptica) ± SD de cuatro experimentos independientes. Para las concentraciones de RSV fijos, las células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con un vehículo (0,1% de etanol), 5, 10, 25, 50 o 100 mM RSV y una concentración fija de palmitato ( 0,25 mM) durante 24 h. B) la cuantificación de aceite rojo O tinción. la acumulación de triglicéridos se expresa como la media de la OD (densidad óptica) ± SD de cuatro experimentos independientes. Las diferencias significativas respecto al control (vehículo) y palmitato de 0,25 mM fueron analizados por ANOVA de una vía seguido por la prueba post hoc de Bonferroni: *** p & lt; 0,001. C) CHOP niveles de mRNA expresión. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas con respecto al control (vehículo) se analizaron por ANOVA de una vía seguido por la prueba de Bonferroni post hoc: *** p & lt; 0,001 y ** p & lt; 0,01. D) de empalme XBP1. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes.
Además, hemos desarrollado varios experimentos en los que se fijó la concentración de palmitato (0,25 mM) y las células HepG2 expuestas a concentraciones crecientes de RSV. Notablemente, RSV fue capaz de disminuir la acumulación de triglicéridos en un (figura 6B) de manera dependiente de la dosis. A pesar de esta disminución en la acumulación de triglicéridos, hubo una activación concomitante de un componente de estrés ER primaria, tales como corte y empalme XBP1 y el factor de CHOP apoptosis aguas abajo derivados del ER (figura 6C y 6D). Este resultado sugiere fuertemente que, a pesar del efecto beneficioso inicial de RSV en la disminución de la acumulación de triglicéridos, había un umbral de inhibición inducida por VRS de la acumulación de lípidos (25 mM RSV) que, una vez alcanzado, desencadenado el ER apoptosis estrés derivado inducida por palmitato. Por lo tanto, parece que, a pesar de la capacidad tampón de palmitato de por la célula se inhibe por RSV (principalmente por el efecto inhibidor de RSV bien conocido de SREBP1c), cuando esta inhibición es excesivamente fuerte /continua, la cantidad de la palmitato restante dentro de la celular aumentará y la promoción de los efectos nocivos de la AG saturados (palmitato inducida por estrés ER y apoptosis).
la reversión de los efectos de RSV debido a la co-tratamientos con ácido eicosapentaenoico (EPA) o el receptor X del hígado ( LXR) agonista (a-901317)
a fin de examinar si la inducción de estrés ER en las células tratadas con palmitato VSR + se debe a alteraciones en la capacidad de procesamiento palmitato de la célula, hemos desarrollado las siguientes dos enfoques experimentales: ( a) ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) suplementación (tratamiento con EPA a dos concentraciones crecientes) y (b) tratamiento con agonistas de LXR (adición de a-901 317 para estimular la expresión de SCD1). Sorprendentemente, la figura 7C muestra que la suplementación de las dos concentraciones de EPA rescató células HepG2 desde el proceso de apoptosis (niveles de caspasa 3 escindida en comparación con RSV + palmitato reducida). Este nivel reducido del factor de apoptosis en correlación con una disminución en XBP1 de empalme (figura 7A) y CHOP expresión (Figura 7B) (16,54 ± 2,16 vs. 6,27 ± 0,67; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre el RSV + palmitato muestras tratadas y la RSV + palmitato + EPA muestras tratadas), lo que sugiere restauración de la función ER.
células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a medio libre de suero con un vehículo (etanol 0,1%), 25 M de RSV, 50 mM o 100 mM EPA EPA durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0, 0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) de empalme XBP1. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb). Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. B) CHOP niveles de mRNA expresión. Los resultados se muestran como la media de las veces el cambio ± SD de tres experimentos independientes. C) El escindido nivel caspasa-3 se determinó por transferencia Western. La mancha que se muestra es una imagen representativa de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por la de Bonferroni test post hoc: *** p & lt; 0,001 y ** p & lt; 0,01
Como alternativa, las células HepG2 tratadas con dos concentraciones (1 mM. y 10 mM) de LXR agonista a-901317 mostró un aumento de la proteína de SCD1 y los niveles de mRNA (Figura S2A y S2B). Además, la Figura 8 muestra que el tratamiento agonista también corrige los efectos promovidos por el palmitato y desencadenados por RSV. Por ejemplo, el tratamiento con agonistas de corregir el aumento en la escisión de la caspasa-3 (figura 8A) y revoca los efectos sobre el estrés ER (Figura 8B y 8C) en XBP1 y en la expresión de CHOP (4,43 ± 0,26 vs. 1,67 ± 0,26; p & lt; 0,001; la diferencia máxima fue entre el VSR + palmitato muestras tratadas y las muestras tratadas por VSR + palmitato + a-901317)
células HepG2 se lavaron dos veces en DMEM libre de suero y se transfirieron a un medio libre de suero con. vehículos (0,05% de etanol y 0,1% de DMSO) y 25 M de RSV o 10 mM a-901317 durante 28 h; 8 h antes del final del experimento, el aumento de las concentraciones de palmitato (0,75 y 1 mM) se añadieron al pocillo correspondiente. A) de empalme XBP1. (XBP1 unspliced-197 pb de amplificación; XBP1 empalmados-171 amplicón pb).