Extracto
El resveratrol, extraído de la medicina china a base de hierbas cuspidatum Polygonum, es conocida para inhibir la invasión y metástasis de cáncer colorrectal humano (CRC), en la que largo no codificante Metástasis de pulmón asociado Adenocarcinoma Transcripción 1 (RNA-MALAT1) también juega un papel importante. Usando MALAT1 lentiviral shRNA y el exceso de construcciones de expresión en líneas celulares de CRC derivados, LoVo y HCT116, hemos demostrado que los efectos antitumorales del resveratrol sobre la Convención son a través de la inhibición de la señalización de Wnt /β-catenina, por tanto, la expresión de sus genes diana tales como c-Myc, MMP-7, así como la expresión de MALAT1. En detalle, el resveratrol regula a la baja MALAT1, lo que resulta en una disminución de la localización nuclear de β-catenina de este modo atenuada de señalización Wnt /β-catenina, que conduce a la inhibición de la CRC invasión y metástasis. Este hallazgo de los nuestros sin duda proporciona evidencia preclínica importante que apoya el uso futuro de resveratrol en la prevención y el tratamiento del CCR
Visto:. Ji Q, Liu X, X Fu, Zhang L, H Sui, Zhou L, et Alabama. (2013) El resveratrol inhibe la invasión y metástasis de células de cáncer colorrectal a través de MALAT1 mediada por Wnt /β-catenina Señal Camino. PLoS ONE 8 (11): e78700. doi: 10.1371 /journal.pone.0078700
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: May 9, 2013; Aceptado: September 15, 2013; Publicado: 11 de noviembre 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81202812, 81303102, 81303103), el Programa de la Comisión de Educación Municipal de Shanghai (2011JW57, 12YZ058), Shanghai Oficina Municipal de Salud (ZYSNXD-CC-YJXYY-JS20, 2011ZJ030, 20114Y001, 20114037), Shanghai clave Laboratorio clínico de Medicina tradicional china (C10dz2220200). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el resultado de la mutación de múltiples genes incluyendo proto-oncogenes y genes supresores de tumores. A medida que los oncogenes control de la proliferación celular restante altamente expresado, o los genes supresores de tumores están mutados, las células cancerosas resultantes evadir el sistema inmune, forman tumores en distales ubicaciones /órganos, es decir, la metástasis y la fase terminal de cáncer comienza [1].
la aparición de nuevos fármacos de la medicina china monómero contra el cáncer ha proporcionado una nueva opción para la reptoire de drogas sintéticas para el tratamiento del cáncer [2]. Polygonum cuspidatum es los rizomas y raíces de la hierba perenne Tateshina - Polygonum cuspidatum [3]. datos anteriores demostraron que Polygonum cuspidatum tenía varios efectos inhibidores sobre tumor, infecciones virales /bacterianas y la inflamación [3] - [7]. Resveratrol extraído de Polygonum cuspidatum es un antioxidante natural, que puede reducir la viscosidad de la sangre, inhibir la agregación de plaquetas y la vasodilatación, mantener el flujo de sangre, y prevenir la aparición y el desarrollo de cáncer [8] - [10].
Early en 2003, Ji
et al
primer lugar identificado largo no codificante ARN - MALAT1. En 225 casos de la etapa I no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC), se encontró en 70 de los casos, la metástasis se correlaciona con MALAT1 sobre-expresión, en un curso y de manera específica de tejido, lo que sugiere que la expresión MALAT1 puede servir como un marcador potencial de supervivencia en la fase 1 en pacientes con NSCLC [11]. Además, otros grupos mostraron que MALAT1 sobre-expresa en el hígado, el cáncer de cuello de útero y de colon [12] - [14]
Muchos estudios han demostrado que la vía de señalización Wnt /β-catenina regula invasión de células tumorales y la metástasis.. Soichi
et al
encontró que en células de carcinoma de células escamosas orales, la acumulación de β-catenina en el citoplasma induce TCF /LEF transcripcional actividad, y aumentar la expresión de MMP-7, induciendo de este modo la conversión de células epiteliales de células mesenquimales, así como la mejora de la invasión y metástasis [15]. Guo
et al
demostrado en la línea celular HT29 CRC, NGX6 producto del gen inhibe la transferencia de la β-catenina del núcleo y el citoplasma a la membrana celular, inhibiendo de este modo la actividad transcripcional de TCF y abajo de la regulación de la expresión de los genes diana de Wnt c-Myc, cyclinD1 y COX-2, lo que lleva a una disminución de la invasión de células del cáncer y la metástasis [16]
.
Nuestros estudios actuales interrogado a los mecanismos por los que el resveratrol regula MALAT1 y la vía de señalización de Wnt /β-catenina , lo que resulta en la invasión de células del cáncer y la metástasis. reprimida
tumorales Materiales y Métodos
hibridación in situ en muestras de tejido de pacientes con CCR
incluidas en parafina
y adyacentes muestras de tejido normal de 60 pacientes con CRC que se sometieron a la resección del tumor en el hospital de la Universidad de Shanghai, Putuo de Medicina tradicional china (SUTCM) entre 2010 y 2012 fueron seleccionados para la hibridación con digoxigenina (DIG) marcado con sonda de ADN MALAT1 (Shinegene Biotecnología Molecular, Shanghai, china). El experimento se realizó de acuerdo con el método descrito por Tanner
et al
[17]. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Tuo Pu, SUTCM y todos los pacientes se les proporcionó el consentimiento informado por escrito.
Proyección de Medicina China de monómero Medicamentos contra el cáncer en la expresión en células LoVo MALAT1
LoVo células (derivadas de metástasis izquierda supraclavicular región, Dukes 'tipo C, grado IV, adenocarcinoma colorrectal) se cultivaron en medio F12K suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 g /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, a 37 ° C, 5% de CO2, y alta humedad. Todos los medicamentos contra el cáncer de monómero de la medicina china se diluyeron en serie para detectar la concentración de la mitad de la inhibición de la proliferación de las células LoVo. La proliferación de células LoVo se determinó por recuento celular Kit-8 de ensayo (CCK-8) como se describe anteriormente [18]. PCR en tiempo real se utilizó para la detección de la tasa de inhibición de los fármacos candidatos sobre la expresión MALAT1. Para el análisis de PCR en tiempo real, el cebador directo, el cebador inverso y la sonda TaqMan se diseñaron de la siguiente manera: hacia adelante (5-AGGCGTTGTGCGTAGAGGA-3), inversa (5-GGATTTTTACCAACCACTCGC-3), sonda TaqMan (5-FAM + CCTAGACCAGCATGCCAGTGTGCC + tamara-3). PCR en tiempo real se realizó en el Applied Biosystems 7300 System (Applied Biosystems Deutschland GmbH) utilizando Premezcla Ex Taq (Takara, Dalian, China). GAPDH se utilizó como referencia interna
Derribo y sobreexpresión de genes MALAT1
Humano MALAT1 ADNc (Gene ID: 378938). Se amplificó por RT-PCR con el ARN extraído de células LoVo, y después se clonó en pLV4 vector. MALAT1 Se realizaron búsquedas de secuencias diana siRNA adecuado, tres secuencias de siRNA fueron diseñados, sintetizados, y se confirmaron mediante secuenciación respectivamente. partículas lentivirales se produjeron mediante co-transfección de vector de expresión pLV4-MALAT1 cDNA o pLV4-MALAT1 shRNA con el empaquetado de partícula viral vector helper en células 293T. Los experimentos preliminares escogieron las secuencias de siRNA más eficientes de la caída de la mencionada tres candidatos siRNA (Figura S1): sentido 5'-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3 ', anti-sentido 5'-AUAAAUCCCUUUACACCUCTT-3'; con una secuencia de siRNA control negativo: sentido 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '., anti-sentido 5'-ACGUGACACGUUCG
GAGAATT-3'. Título de partículas virales que contienen MALAT1 shRNA y MALAT1 cDNA se determinó mediante dilución en serie limitada. La eficiencia de la caída o la sobre expresión se determinó mediante PCR en tiempo real. células LoVo o células HCT116 se infectaron con el lentivirus con el pLV4-MALAT1 ADNc, pLV4-MALAT1 shRNA o pLV4-vectorial.
luciferasa reportero de ensayo
Para probar promotor o promotora MALAT1 LEF /TCF actividad, las células LoVo fueron co-transfectadas con el promotor o bien el plásmido recombinante pGL3-basic-MALAT1 o pGL3-basic-LEF promotor /TCF con un plásmido de control positivo pRL-SV40 como se describe anteriormente [19]. La actividad del promotor se analizó usando un kit de ensayo de doble luciferasa comercial (Instituto de Biotecnología Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante.
migración y la invasión de ensayo
Un total de 5 × 10
5 células LoVo cultivadas en 100 F12K l con 0,5% de FBS se sembraron en la parte superior de una cámara transwell (Corning Incorporated, Corning, NY). Para el análisis de la migración, en la parte inferior de la cámara, se añadió 600 F12K l con 15% de FBS y 10μg /ml de fibronectina y el ensayo se realizó durante 24 horas a 37 ° C y 5% CO2. Las células migradas se analizaron por tinción con violeta cristal, seguido de la observación bajo un microscopio invertido DMI3000 B (Leica, Alemania). Para el análisis de invasión, 100 l de Matrigel (BD, EE.UU.) se añadió en primer lugar a la parte inferior de la cámara transwell antes que las células LoVo se sembraron, y los siguientes procedimientos fueron los mismos que el análisis de la migración, a excepción de las células invasoras que se analiza después de co-cultivo durante 48 horas. En cuanto a las células HCT116, los procedimientos fueron similares, la única diferencia era que se cultivan las células con RIPM 1640.
Western Blot
células enteras, se prepararon citoplasma, y las proteínas nucleares de células LoVo o HCT116 de acuerdo con las instrucciones del fabricante de ProteoJET citoplasmática y kit de extracción de proteína nuclear (Fermentas, EE.UU.). Las proteínas se cargaron en los geles SDS-PAGE para electroforesis, se transfirieron a membranas de PVDF y bloqueadas en el 5% de leche antes de la incubación con los anticuerpos primarios indicados y los anticuerpos secundarios. Los inmunocomplejos resultantes se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada. La carga de proteína se normalizó por β-actina (proteína entera o proteína citoplasma) o PCNA (proteína nuclear).
se realizó ARN-proteína de unión inmunoprecipitación
ARN-proteína de unión inmunoprecipitación (RIP) de acuerdo con los protocolos del fabricante de la EZ-Magna RIP Kit (Millipore, EE.UU.). Brevemente, las células LoVo se enjuagaron con solución salina enfriada con hielo tamponada con fosfato (PBS), se lisaron por tampón de lisis RIP. Tanto β-catenina (CST, EE.UU.) y anticuerpos IgG de conejo de control no específicos se utilizaron para la inmunoprecipitación. lisados RIP y anticuerpos β-catenina perlas enlazados magnética se incuban junto con la rotación de la noche a 4 ° C. Posteriormente, las proteínas en el inmunoprecipitado se digirieron con proteinasa K y los ARN unidos se purificaron a partir de los sobrenadantes, transcrito de forma inversa usando el kit de reactivo PrimeScript RT seguido de análisis cuantitativo.
Inmunofluorescencia Microscopía
células LoVo ( 2,5 × 10
5) se cultivaron en portaobjetos de cámara (Millipore, EE.UU.) durante 8 horas, de hambre durante 12 horas. Las células se fijaron durante 40 minutos con paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente, permealized y se bloquearon con leche en polvo 5% no grasa, 1% BSA, 0,5% de Triton X-100 y se incubaron durante la noche con monoclonal de conejo anti-β-catenina ( CST, EE.UU.). Después de lavar los portaobjetos, se añadió anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con Cy3 (Instituto de Biotecnología Beyotime, China) en solución de bloqueo durante 1 hora. se aplicó 4-6-diamidino-2-fenilindol a los núcleos de manchas. Inmunofluorescencia imágenes fueron tomadas con un microscopio invertido DMI3000B (Leica, Alemania).
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como medias SEM. Los valores medios de los dos grupos fueron comparados por
t de Student
. Las asociaciones entre la expresión de MALAT1 y parámetros clínico se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher, chi-cuadrado pruebas o pruebas de chi-cuadrado de corrección de continuidad por el software SPSS18.0.
Resultados
1. MALAT1 se sobreexpresa en el cáncer colorrectal tejidos y se correlaciona con la metástasis del tumor y la invasión
Con
In situ
hibridación, nos pareció que había una mayor expresión de MALAT1 en el tejido de cáncer colorrectal (CCR) que la tejido normal adyacente colorrectal (Figura 1 y Tabla 1). A continuación realizamos un análisis de correlación entre la expresión MALAT1 y características clinicopatológicas de CRC. Se observó una asociación estadísticamente significativa entre la expresión MALAT1 y extensión de la metástasis y la invasión. En contraste con los tejidos normales adyacentes, la expresión MALAT1 en los tejidos de CRC resecado de pacientes con enfermedades metastásicas fue mayor que aquellos sin metástasis (Tabla 2). Esta asociación entre la expresión MALAT1 y extensión de la metástasis y la invasión también fue confirmada por PCR en tiempo real (Figura S1).
In situ
hibridación se aplicó para investigar la expresión MALAT1 en parafina embebido-60 tejido tumoral y muestras de tejidos normales adyacentes de los pacientes con CCR.
2. El resveratrol inhibe la proliferación, migración e invasión de células LoVo
Para analizar fármacos contra el cáncer monómero de la medicina china que inhibieron la expresión en células LoVo MALAT1, lo primero que investigó el impacto de los fármacos candidatos sobre la proliferación de células LoVo, y se calcula la media concentración de inhibición (IC50) de todos los fármacos candidatos (Tabla 3). A continuación nos fijamos en el efecto de los fármacos candidatos sobre la inhibición de la expresión MALAT1. Nuestros resultados demuestran que el resveratrol y osthole fueron los medicamentos contra el cáncer 2 superiores con respecto a la inhibición de la expresión MALAT1, con el resveratrol ser el mejor entre estos dos (Figura 2A). Por lo tanto, elegimos el resveratrol para nuestros nuevos estudios sobre MALAT1 y mecanismos relacionados. Con nuestros datos que muestran una CI50 de 55 resveratrol mu M en las células LoVo (Figura 2B), las dosis de los fármacos de 15, 30 y 50 mM fueron así elegidos para la investigación del efecto del resveratrol en las capacidades de invasión y migración de las células cancerosas. Nuestros resultados mostraron células LoVo se inhibieron significativamente en su capacidad de invadir y migrar por el resveratrol, en una forma dependiente de la dosis (Figura 2C)
(A):. Se ensayaron Veintidós medicina china fármacos contra el cáncer monómero candidatos para las dosis eficaces en la inhibición de la expresión en células LoVo MALAT1. (B): Correlación de la dosis de los fármacos de resveratrol y la inhibición del crecimiento en células LoVo. eje Y: porcentaje de inhibición del crecimiento; eje X: concentración de resveratrol (M). (C): Evaluación y cuantificación de la migración celular y la invasión de las células LoVo. Los valores representan el número de células migratorias /invasivos por 5 campos de alta potencia. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, en comparación con las células de control LoVo
3. El resveratrol inhibe la localización nuclear de β-catenina, los niveles de sus proteínas aguas abajo, y la expresión en células LoVo MALAT1
A continuación, se encontró que el resveratrol atenúan la localización celular de β-catenina, una invasión de células cancerosas y la proteína que regula metástasis. Como se muestra en la Figura 3A, de una manera dependiente de la dosis, el resveratrol mejora los niveles citoplasmáticos de β-catenina, mientras que la disminución de su presencia en el núcleo, con poco efecto sobre la proteína total β-catenina celular.
( a): Número total de células o extractos de los diferentes compartimentos celulares a partir de células LoVo tratados con resveratrol se probaron para β-catenina. β-catenina se cuantificaron los niveles de proteína. *
p
& lt; 0,05 ** o
p
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control. (B): los extractos celulares totales de células LoVo tratados con resveratrol se probaron para c-Myc, los niveles de proteína MMP-7 y se cuantificaron. *
p
& lt; 0,05 ** o
p
& lt; 0,01, en comparación con las células de control LoVo. (C): Los niveles de expresión de MALAT1 a partir de células LoVo tratados con dosis indicadas de resveratrol se determinaron mediante PCR en tiempo real. Se midieron las actividades relativas promotor MALAT1 en células LoVo tratados con dosis de resveratrol indicados. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, en comparación con las células de control LoVo
A continuación se estudió la expresión de β-catenina aguas abajo genes diana en presencia de resveratrol, para el papel principal de la β-catenina en el núcleo es a través de su regulación en la transcripción de genes. Como era de esperar, se encontró la expresión de β-catenina los genes diana c-Myc y MMP-7 se redujo significativamente por el resveratrol, en una forma dependiente de la dosis (Figura 3B). Estos datos indican que el resveratrol puede inhibir la invasión de células cancerosas y la migración a través de la represión de la vía de señalización de Wnt /β-catenina.
Además, hemos descubierto que el resveratrol redujo regulado la expresión de largo no codificante ARN-MALAT1 en una dosis -dependiente (Figura 3C). Para comprobar los efectos del resveratrol sobre la expresión MALAT1, se utilizó el promotor MALAT1 sistema dual-informador de luciferasa y se encontró que el resveratrol inhibe directamente la actividad promotora de MALAT1, por ejemplo, Sólo se logró 10% la actividad del promotor con 50 M de resveratrol en relación con el control (Figura 3D). Estos datos sugieren que el resveratrol tiene un impacto directo sobre la transcripción de genes MALAT1.
4. MALAT1 promueve la proliferación, invasión y migración, y aumenta la localización nuclear de β-catenina y Niveles de sus productos intermedios de genes en células LoVo
A continuación, utilizando construcciones de lentivirus mediada, hemos derribado o sobreexpresado gen MALAT1 la expresión en células LoVo. Nuestros datos demuestran claramente que la proliferación y capacidad de invasión /migración de las células LoVo se redujeron significativamente por MALAT1 caída, y se incrementaron en MALAT1 sobre-expresión (Figura 4A, 4B)
(A):.
En vitro
crecimiento de las células LoVo que expresan MALAT1-shRNA, MALAT1-sobreexpresión, vector vacío frente a células parentales. (B): Evaluación y cuantificación de la migración celular y la invasión de las células LoVo indicados en A. Los valores representan el número de células migratorias /invasivas por 5 campos de alta potencia. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, comparado con el grupo de control LoVo
Cuando derribaron, la expresión génica utilizando MALAT1 shRNA construir en células LoVo, que se sorprendieron al encontrar que la proteína β-catenina fue retenido en el citoplasma, mientras que su presencia en los núcleos se incrementó remarkedly (Figura 5A). Además, se encontró MALAT1 caída reduce la expresión de β-catenina los genes diana, tales como c-Myc, MMP-7, como MALAT1 sobre-expresión hizo lo contrario (Figura 5B). Este conjunto de datos implica fuertemente que el resveratrol inhibe las propiedades de proliferación, invasión y migración de las células a través de CRC la regulación negativa de la expresión MALAT1
(A): MALAT1 enteras o extractos de células de diferentes compartimentos celulares a partir de células LoVo expresar. -shRNA, MALAT1-sobreexpresión, vector vacío se probaron para la β-catenina y se cuantificaron los niveles de proteína. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p Hotel & lt; 0,01, comparado con el control de vectores. (B): enteras o extractos de células de diferentes compartimentos celulares a partir de células LoVo que expresan MALAT1-shRNA, MALAT1 sobreexpresa-, vector vacío se probaron para c-Myc, MMP-7 y los niveles de proteína se cuantificaron. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, comparado con el control de vectores
5. La sobreexpresión de MALAT1 rescata células LoVo de Suprimida migración y la invasión por el resveratrol
Para confirmar nuestro hallazgo de resveratrol supresión de la migración y la invasión de las células LoVo través MALAT1, se realizó un experimento de rescate MALAT1. Nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión lentivirus mediada de MALAT1 atenuó significativamente la inhibición inducida por resveratrol sobre la migración celular y la invasión en las células LoVo (Figura 6A). En otras palabras, la sobreexpresión de MALAT1 podría revertir el efecto de resveratrol. Además, los resultados Western Blot mostró que la sobreexpresión de MALAT1 invirtió el efecto del resveratrol sobre la β-catenina nuclear y la expresión de la proteína de c-Myc y MMP-7 en células LoVo (Figura 6B).
(A) : células LoVo que expresan sobreexpresa-MALAT1, vector vacío fueron tratados con resveratrol o sin 50 mM durante 48 horas y se midieron la migración celular y la capacidad de invasión. (B): enteras o extractos celulares de diferentes compartimentos celulares a partir de células LoVo que expresan sobreexpresa-MALAT1, vector vacío tratada con o sin 50 mM resveratrol se probaron para β-catenina, c-Myc, MMP-7, y se cuantificaron los niveles de proteína . *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, en comparación con las células LoVo tratados con 50 mM resveratrol
6. El resveratrol inhibe la señalización de Wnt /β-catenina vía MALAT1
La hipótesis de que el resveratrol inhibe la vía de señalización de Wnt /β-catenina través de la regulación MALAT1. Para probar esta hipótesis, se utilizó la inmunotinción y análisis de Western blot para observar si β-catenina trans-situado de citoplasma al nuclear con la presencia de resveratrol y la manipulación de los niveles de expresión MALAT1. Para hacer que el efecto más obvio, se utilizó LiCl para inhibir la GSK3 de la unión a la proteína ß-catenina, para aumentar el estado activo de la vía de señal /β-catenina Wnt. Nuestros resultados establecen, como LiCl hecho indujo la translocación de la proteína β-catenina de citoplasma al núcleo, el resveratrol (50 M) obstáculo significativo para este proceso (Figura 7A). Posteriormente, la baja regulación de MALAT1 aumentó el efecto del resveratrol sobre la inversión de la translocación de β-catenina del citoplasma al núcleo de las células shRNA /MALAT1 LoVo, mientras que la sobre regulación de MALAT1 debilitado (Figura 7B, 7C).
(A): Resveratrol negada LiCl inducida por la translocación nuclear de β-catenina. La tinción de inmunofluorescencia de β-catenina en las células LoVo tratados con LiCl, con o sin resveratrol. (B): los extractos nucleares de las células LoVo que expresan MALAT1-shRNA, MALAT1-sobreexpresa, vector vacío, se trató con LiCl con o sin resveratrol, se probaron para la β-catenina, c-Myc, MMP-7. (C): La cuantificación de la β-catenina, c-Myc, MMP-7 niveles de proteína a partir de los datos mostrados en (A). **
p
& lt; 0,01, comparado con el grupo en blanco o LiCl solo grupo. (D): Los /TCF relativos actividades promotoras ABL en células LoVo que expresan MALAT1-shRNA, MALAT1-sobreexpresa, vector vacío, tratado por LiCl, con o sin el resveratrol. **
p
& lt; 0,01, comparado con el grupo en blanco o LiCl solo grupo. (E): No hay interacción entre MALAT1 y β-catenina. Insertar: resultado de RT-PCR que muestra cantidad de ARN tirado hacia abajo por inmunoprecipitación de proteínas de unión al ARN. Como controles negativos, no se utilizó ADNc (en blanco) o IgG solo. Panel inferior: resultado de cuantificación del inserto
Por otra parte, hemos probado el efecto del resveratrol sobre la señalización /β-catenina usando un reportero promotor LEF /TCF construcción de doble luciferasa.. Nuestros resultados indican claramente que, el resveratrol inhibió la actividad del promotor de LEF /TCF inducido por LiCl, y co-represión de MALAT1 llevaron a la mejora de este efecto, como co-sobreexpresión de MALAT1 oponerse a ella (Figura 7D). Todos estos datos sustentan que el resveratrol inhibe la actividad de la vía de señal /β-catenina Wnt a través de la represión de la expresión MALAT1. Desde MALAT1 y la proteína β-catenina ambos existen en el núcleo, por lo que es de gran interés para nosotros saber si estas dos moléculas pueden interactuar directamente entre sí, que se puede detectar mediante una técnica de inmunoprecipitación de proteínas de unión al ARN. Sorprendentemente, nuestros datos muestran poca interacción entre MALAT1 y β-catenina (Figura 7E). Esto ilustra que MALAT1 podría interactuar indirectamente con β-catenina afectar a su cascada de señales.
7. La corroboración de los hallazgos clave de CRC Otra línea celular HCT116
Para confirmar nuestros hallazgos claves en las células LoVo, hemos probado otra línea celular HCT116 CRC utilizando enfoques similares. Nuestros resultados muestran que el resveratrol inhibe la proliferación de células HCT116 por la IC50 de 100 mM (Figura 8A). HCT 116 células tenían expresión MALAT1 mucho menor que las células LoVo, pero no obstante, como similar a las células LoVo, la sobreexpresión de MALAT1 promovieron la proliferación de células HCT116 (Figura 8B, 8C, 8D)
(A):. Resveratrol inhibe la proliferación de células HCT116 con una IC50 de 100 mM. (B): células HCT 116 mostraron una expresión MALAT1 más baja que las células LoVo. **
p
& lt; 0,01, en comparación con las células LoVo. (C): La sobreexpresión de MALAT1 en células HCT116. (D): La sobreexpresión de MALAT1 promovió el crecimiento in vitro de células HCT116. (E): La sobreexpresión de MALAT1 atenuó el efecto supresor del resveratrol sobre la migración y la invasión en las células HCT116. Las células HCT116 que expresan sobreexpresa-MALAT1, vector vacío fueron tratados con resveratrol o sin 50 mM durante 48 horas y se midieron la migración celular y la capacidad de invasión. (F): enteras o extractos celulares de diferentes compartimentos celulares a partir de células HCT116 que expresan sobreexpresa-MALAT1, vector vacío tratados con o sin 50 mM resveratrol durante 48 horas se probaron para β-catenina, c-Myc, MMP-7 y los niveles de proteína se cuantificaron. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p
. & Lt; 0,01, en comparación con las células HCT116 tratados con resveratrol 100 M
Además, el resveratrol también significativamente inhibió la capacidad de migración e invasión de HCT116. Al igual que en las células LoVo, la sobreexpresión de MALAT1 rescató células HCT116 de la supresión de la migración y la invasión por el resveratrol (Figura 8E). Western blot resultados también mostraron que la sobreexpresión de MALAT1 invirtió el efecto del resveratrol sobre la β-catenina nuclear y la expresión de la proteína de c-Myc y MMP-7 en las células HCT116 (Figura 8F).
Discusión
el cáncer colorrectal es uno de los tumores malignos más comunes en el mundo, con una alta tasa de recurrencia y metástasis. Los mecanismos de recurrencia y metástasis siguen siendo muy complicada. Actualmente, el tratamiento del cáncer colorrectal es la resección quirúrgica principalmente, en combinación con quimioterapia, inmunoterapia, y otros cuidados alternativos, tales como la medicina tradicional china. La medicina tradicional china y su más recientemente derivada del tratamiento monómero extraído puede mejorar los síntomas de cáncer, reducir la metástasis del cáncer, así como reducir el riesgo de recurrencia del cáncer colorrectal. Sin embargo, los objetivos y los mecanismos terapéuticos siendo difícil de alcanzar. Entre estos monómeros extraídos, el resveratrol es un ejemplo perfecto. Tan temprano como en 1993, Jayafilake
et al
ha descubierto que el resveratrol tiene características anti-cáncer debido a su efecto represivo sobre la actividad de la proteína tirosina quinasa [20]. Otros investigadores han encontrado, además, que el resveratrol tiene efecto inhibidor sobre un gran espectro de células tumorales malignas derivadas de mama, gástrico, de colon, de próstata, de ovario, y cáncer de piel [21] - [26]. Nuestros estudios actuales han demostrado que el resveratrol inhibe la proliferación, invasión y metástasis de células de cáncer colorrectal.
Al ser el factor de activación transcripcional clave de la vía de señalización Wnt /β-catenina, tras la activación aguas arriba, β-catenina a menudo se transloca al núcleo del citoplasma, en coordinación con otros factores de transcripción como el TCF /LEF, para activar sus genes diana c-Myc, cyclinD1, MMP-7, y CD44, que a su vez juega papel fundamental en la iniciación del tumor y el desarrollo [27] - [ ,,,0],30]. Nuestros datos indican que el resveratrol bloqueó la translocación de β-catenina de núcleo, dando como resultado la expresión disminuida de c-Myc y MMP-7.
Long no codificante de ARN-MALAT1 se informó en primer lugar en la invasivo no pequeñas carcinoma de células, y últimamente se encuentra sobre-expresión en muchos otros tejidos de cáncer, que indica MALAT1 se asocia con la invasión y metástasis [11] - [14]. Nuestros estudios mostraron MALAT1 sobre-expresado en más de 60 tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales adyacentes, y MALAT1 sobreexpresión correlacionada con CRC invasión y metástasis características. En nuestros experimentos de selección, hemos identificado dos medicina tradicional china extraída monómeros que tienen un efecto directo sobre la expresión MALAT1. El resveratrol es el mejor de ellos. En nuestros estudios actuales, que ilustramos shRNA mediada desmontables de MALAT1 reduce obviamente la invasión y migración capacidades de CRC LoVo y las células HCT116. Similar a los resultados del tratamiento resveratrol, desmontables de MALAT1 inhibió la trans-ubicación de β-catenina de citoplasma al núcleo, lo que resulta en una disminución de c-Myc y MMP-7 expresión, mientras que MALAT1 sobre-expresión hizo lo contrario.
mediante el uso de un promotor LEF /TCF dual-luciferasa constructo indicador y la activación de la vía de señal /β-catenina Wnt con LiCl, hemos demostrado, además, que desmontables de MALAT1 mejora el efecto inhibidor del resveratrol sobre la actividad del promotor de LEF /TCF inducida por LiCl, mientras que la expresión excesiva de MALAT1 debilitó. Todos estos resultados sugieren que el mecanismo que subraya de resveratrol puede ser a través de una represión de la señalización de Wnt /β-catenina, a través de la baja regulación de la expresión MALAT1.
MALAT1 se retiene específicamente en manchas nucleares, asociados con el almacenamiento o modificación del pre-mRNA de maquinaria de procesamiento, tiene efecto potencial sobre la regulación de la función de genes, todo esto implica que MALAT1 puede desempeñar un papel importante en la carcinogénesis [31] - [33]. Por la razón que MALAT1 y la proteína β-catenina tanto residen en el núcleo, se examinó si existe una interacción directa entre estas dos moléculas en el núcleo. Desafortunadamente hemos observado poca interacción directa entre MALAT1 y β-catenina, lo que sugiere que podría haber otras moléculas implicadas en la regulación entre MALAT1 y β-catenina. No se encontró correlación directa entre la expresión de alto MALAT1 en muestras clínicas y acumulación nuclear de β-catenina. Según lo propuesto por Brabletz T
et al
, β-catenina (Figura S1) en carcinomas de colon mostró un fuerte enriquecimiento nuclear en el frente de invasión, mientras que en gran parte de la zona central del tumor, β-catenina se detectó en el citoplasma y en la membrana [34] - [36]. Esto significa que hay que separar el frente de invasión del resto del tejido CRC y medir niveles de expresión de MALAT1, β-catenina y su localización, para su correlación. Tenemos previsto en futuros estudios, el uso de tecnologías tales como software de predicción de análisis, co-inmunoprecipitación, la secuenciación de proteínas, chips de proteínas y chips de genes, para identificar los vínculos específicos entre MALAT1 y β-catenina.
En conclusión, nuestros resultados descubierto los mecanismos por los que el resveratrol regula MALAT1, a su vez altera la localización nuclear de β-catenina, que resulta en la señalización rebajado /β-catenina Wnt y eventual inhibición de la invasión y la metástasis. Este descubrimiento sin duda proporcionará evidencia preclínica de vital importancia apoyar el uso futuro de resveratrol en la prevención y tratamiento de la CRC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Selección del shRNA más eficiente para MALAT1, la detección de MALAT1 mRNA y expresión de la proteína β-catenina en los tejidos de CRC y los tejidos normales adyacentes. (A): las células LoVo se infectaron con el lentivirus con tres pLV4-MALAT1 shRNAs o pLV4 en vectores. Sus eficiencias de caída fueron detectados por PCR en tiempo real *
p
. & Lt; 0,05 ** o
p Hotel & lt; 0,01, comparado con el control de vectores. (B): niveles de expresión de ARNm MALAT1 fueron medidos por PCR en tiempo real, los tejidos de CRC y los tejidos normales adyacentes. **
p
& lt; 0,01, en comparación con los tejidos normales o tejidos de CRC sin metástasis.