Extracto
El consumo de alimentos que contienen resveratrol produce beneficios significativos para la salud. Resveratrol inhibe el cáncer mediante la reducción de la proliferación celular y la metástasis y mediante la inducción de apoptosis. Estas acciones podrían explicarse por su capacidad de inhibir (ERK-1/2), Akt y la supresión de los niveles de estrógeno y el crecimiento de la insulina del factor -1 (IGF-1) receptor. Cómo estos procesos se manifiestan en las acciones antitumorales de resveratrol no está claro. Utilizando estudios de microarrays, se muestra que el resveratrol reduce la expresión de varios microARN asociados a tumores de próstata (MIR) que incluye
miR-21 Hoteles en andrógeno-receptor de las células de cáncer de próstata humano negativo y altamente agresivos, PC-3M-MM2. Este efecto de resveratrol se asoció con la viabilidad celular reducida, la migración y la invasión. Además, el resveratrol aumentó la expresión de supresores tumorales, PDCD4 y maspina, que están reguladas negativamente por
miR-21
. De interferencia corto (si) ARN contra PDCD4 atenúa el efecto del resveratrol en las células del cáncer de próstata, y no se observaron efectos similares sobre la expresión de
miR-21
con
pre-miR-21
oligonucleótidos. células PC-3M-MM2 también mostraron altos niveles de fosfo-Akt (pAkt), que se reduce por tanto resveratrol y LY294002 (un inhibidor de la PI3-quinasa).
miR-21
expresión en estas células parecía ser dependiente de Akt, como LY294002 reduce los niveles de
miR-21
junto con un aumento simultáneo de la expresión PDCD4. Estos
in vitro
hallazgos fueron corroborados aún más en un ratón modelo de xenoinjerto de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) del cáncer de próstata. La administración oral de resveratrol no sólo inhibió el crecimiento del tumor, pero también redujo la incidencia y el número de lesiones pulmonares metastásicos. Estos a tumores metastásicos y supresores efectos del resveratrol se asociaron con una reducción
miR-21 y
pAkt, y elevados niveles PDCD4. No se observaron efectos antitumorales similares de resveratrol en las células de cáncer de próstata DU145 y LNCaP que se asociaron con la supresión de Akt y PDCD4, pero independiente de
miR-21
datos .Estas sugieren que las acciones antitumorales del resveratrol en la próstata cáncer podría explicarse, en parte, a través de la inhibición de Akt /
miR-21
vía de señalización
Visto:. Sheth S, Jajoo S, T Kaur, Mukherjea D, K Sheehan, Rybak LP , et al. (2012) El resveratrol reduce el crecimiento del cáncer de próstata y metástasis mediante inhibición de la vía Akt /microARN-21. PLoS ONE 7 (12): e51655. doi: 10.1371 /journal.pone.0051655
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2012; Aceptado: 5 Noviembre 2012; Publicado: 13 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Sheth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el NIH Grant (R15CA135494), Escuela de Medicina de la SIU Centro del cáncer Grant y la Escuela de Medicina de la SIU Premio de Excelencia en Medicina Académica de VR. SJ fue apoyado por el Departamento de Defensa estadounidense Grant (PC100127). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una serie de productos naturales, tales como la curcumina, isoflavona, resveratrol y epigallactocatechin-3-galato (EGCG), muestran una eficacia en el control del crecimiento y la metástasis de varios tipos de cáncer [1]. Los estudios sugieren que la ingesta alimentaria de algunos de estos productos podría ayudar en la prevención del cáncer o mejorar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos estándar. El resveratrol (trans-3, 4 ', 5-trihidroxiestilbeno) es un antioxidante polifenólico que se encuentra en los cacahuetes, las uvas y el vino tinto [2], [3], que posee beneficios significativos para la salud [4]. Este compuesto ha mostrado efectos beneficiosos en modelos experimentales de cáncer, donde se suprime la iniciación, promoción y progresión de los tumores [5]. Estudios recientes han implicado a la activación de la vía apoptótica como un mecanismo de cuenta de los beneficios anti-tumorales de resveratrol. Por ejemplo, el resveratrol inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis de las células de carcinoma de próstata DU145 humanos [6] y células de la leucemia linfoblástica aguda [7]. El resveratrol también produce la detención del ciclo celular de las células andrógeno-insensible PC3 y DU145 [8]. En un modelo de ratón transgénico Adenocarcinoma ratón de próstata (TRAMP), el resveratrol se ha demostrado que ejercen su acción anti-tumor mediante el aumento de la expresión de receptores de estrógenos β y por la disminución de factor de crecimiento insulínico-1 quinasa (IGF-1) y la señal extracelular regulada 1 /2 (/2 ERK1) fosforilación [9]. Las últimas acciones de resveratrol podían ser producidos por su capacidad para servir como un agonista /antagonista de los receptores de estrógeno en células de cáncer de próstata [10].
Los estudios preclínicos indican acciones beneficiosas de resveratrol en la prevención y tratamiento del cáncer, con pocos efectos secundarios asociados. Un estudio epidemiológico diez por año mostró una reducción superior al 50% en el riesgo de cáncer de mama en las mujeres que ingirieron el resveratrol mediante el consumo de uvas de vino, pero no [11]. Varios fase I y II de ensayos clínicos de fase están actualmente en marcha para el resveratrol en el Instituto Nacional de Salud (http: /clinicaltrials.gov). Por ejemplo, el resveratrol está siendo investigado actualmente en la Fase I de ensayos en contra de la vía Wnt en el cáncer de colon. El resveratrol también se está utilizando en ensayos de fase II en pacientes con linfoma [12].
La eficacia de los productos naturales, tales como el resveratrol, podría explicarse, al menos en parte, a través de su regulación de los microARN (miARN) [ ,,,0],13]. MiRNAs son pequeños ARN no codificantes que regulan la codificación de ARN a nivel post-transcripcional [14]. Varios informes recientes implican miRNAs en el crecimiento y la metástasis de varios tipos de cáncer [15], [16]. Sobre regulación de
miR
21 se ha detectado en varios tipos de cáncer [14], incluyendo el cáncer de próstata [17], [18], [19], lo que sugiere que este miARN podría servir como un biomarcador para estos tipos de cáncer. Varios estudios han implicado
miR-21
en la oncogénesis. Por ejemplo,
miR-21
regula el crecimiento de las células del cáncer de mama (MCF7)
in vitro
y en un modelo de xenoinjerto en ratones [20]. Estos investigadores demostraron posteriormente que
miR-21
mama regulado por la metástasis del cáncer abajo regulación de los genes supresores de tumores, como la muerte celular programada 4 (PDCD4) y maspina [21].
miR-21
también se ha implicado en la proliferación y metástasis de células de cáncer hepatocelular por la disminución de fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma 10 (PTEN) [22]. Además,
miR-21
regula intravasación cáncer de colon y metástasis de cáncer de colon en la orientación PDCD4 para la regulación hacia abajo [23]. Informes recientes también han identificado receptores de la proteína morfogenética ósea II (BMPRII) [24] y lucine repeticiones ricas (en FliI) que interactúa la proteína 1 (LRRFIP1) [25] como objetivos de
miR-21
. La inhibición de
miR-21 aumentó
apopotosis de las células de glioblastoma humano [26], lo que sugiere un papel anti-apoptótica de este miARN. La función anti-apoptótica de
miR-21
también se atribuye a la inducción de la antiapoptótico proteína Bcl-2 [20] y, posiblemente, a la activación del factor nuclear (NF) -κB [27].
en este estudio, mostramos que el resveratrol reduce la viabilidad y capacidad de invasión de las células PC-3M-mM2 en el crecimiento de la cultura y el tumor en el modelo de xenoinjerto en ratones mediante la inhibición de
miR-21
expresión. Esta acción está mediada por la inhibición de Akt, un regulador aguas arriba de
miR-21
gen.
Ensayo
MTS se realizó en células PC-3M-MM2 tratados con vehículo o diferentes concentraciones de resveratrol ( 5-100 mM) durante 72 h, que mostró que la viabilidad celular resveratrol dependiente de la dosis reducida.
B, disminución de la viabilidad celular por el resveratrol era dependiente del tiempo en los grupos tratados con resveratrol (25 y 50 micras) en comparación con el vehículo.
C, España Resveratrol (25 y 50 mM) aumento de la apoptosis de las células PC-3M-MM2 de una manera dependiente del tiempo, según lo determinado por Anexina V-FITC y PI tinción.
D, España Resveratrol (25 M) aumento de la apoptosis de las células PC-3M-MM2, como se determina por el ensayo TUNEL. Las células fueron tratadas con resveratrol durante 24 h y se utilizan para los ensayos de TUNEL, como se describe en Métodos. Se usó tinción con DAPI para identificar los núcleos celulares. se muestran imágenes representativas. La barra de escala representa 100 micras.
E, sobre Bar gráfico indican el porcentaje de células apoptóticas en presencia de 25 mM resveratrol se muestra en la
D
. Los datos indican la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de células tratadas con vehículo
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Se llevaron a cabo todos los estudios en animales de acuerdo con los Institutos nacionales de Salud directrices para el uso de animales y un protocolo aprobado por la Escuela de Medicina de Laboratorio Cuidado de animales y el empleo Comisión de la Universidad del Sur de Illinois.
ensayos de cicatrización de la herida se realizaron en células tratadas con vehículo o el resveratrol (25 y 50 mM) durante 24 h. El resveratrol inhibió significativamente la migración de las células en las áreas desnudas, como indican las flechas dobles
(A): perfil y en el diagrama de barras
(B)
.
ensayo de invasión de cámara de Boyden C, D, España Modificado mostraron que el resveratrol (25 y 50 mM) el tratamiento durante 24 h invasión de células PC-3M-MM2 inhibió significativamente como indica la flecha roja
(C)
. se muestran imágenes representativas de las células invasoras por grupo de tratamiento. Los datos presentados en el diagrama de barras
(B, D)
es la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de células tratadas con vehículo
gen microARN perfil de la matriz de genes regulados por el resveratrol. células PC-3M-MM2 se trataron con vehículo o resveratrol (25 M) durante 24 h, después de lo cual se aisló el ARN total. Las muestras se sometieron a continuación a análisis de microarrays para la detección de los
miRs
que se sabe que están regulados en el cáncer de próstata [19] utilizando chips de genes Affymetrix (ver Métodos). Los paneles se comparan
miARN
perfil del vehículo y células PC-3M-MM2 resveratrol tratados. La intensidad del color rojo y verde indica que el alcance de la regulación hacia abajo-arriba y de
miRNAs, España, respectivamente. Se realizaron estudios similares en tres muestras independientes para cada grupo de tratamiento. Se observó el cambio más alto para
miR-21
como se indica.
B, el resveratrol disminuye
miR-21
niveles en una forma dependiente de la dosis. Las células PC-3M-MM2 fueron tratados con vehículo o el resveratrol (5-100 mM) durante 24 h, después de lo cual se aisló el ARN total y
miR-21
niveles fueron detectados por RT-PCR cuantitativa utilizando TaqMan miARN ensayo.
C, D,
Resveratrol aumenta los niveles de PDCD4 y maspin de una manera dependiente de la dosis. células PC-3M-MM2 se trataron con vehículo o resveratrol (5-100 mM) durante 24 h, después de lo cual los lisados de células enteras se prepararon por Western blot para la detección de PDCD4 y maspin, respectivamente.
E, España El resveratrol aumentó la actividad de luciferasa PDCD4. El plásmido que contiene UTR PDCD4 3 'insertado aguas abajo de la secuencia codificante de luciferasa se transfectó en las células PC-3M-mm2 para 48 h. Las células se trataron luego con resveratrol (25 M) durante 24 h, después de lo cual se prepararon y sometieron a ensayo de luciferasa lisados celulares. Los datos se presentan como la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de células tratadas con vehículo
Cell Cultura y
altamente invasivo, independiente de los andrógenos carcinoma de próstata humano PC-3M-MM2 se obtuvieron células del Dr. Kounosuke Watabe (Escuela de Medicina de la SIU, Springfield, IL). Esta línea celular se deriva de hueso metastásico cultivos celulares de inyecciones intra-cardíacos de células PC-3M-MM1 en ratones nude [28]. Las células PC-3M-MM1 a su vez se derivan de las células PC-3M [28], que son una variante agresiva de células PC-3 [29]. Otras líneas celulares de cáncer de próstata, DU145 y LNCaP, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Daotai Nie (Escuela de Medicina de la SIU, Springfield, IL). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals,, Lawrenceville, GA), 50 unidades /ml de penicilina y 25 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Las células se cultivaron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 y 95% de aire ambiente. Todos los experimentos se llevaron a cabo en medio completo usando monocapas confluentes, a menos que se indique lo contrario.
A,
de transferencia Western de los extractos celulares totales de células PC-3M-MM2 transfectadas ya sea con o scramble PDCD4 siRNA (10 nM) durante 48 h mostró baja regulación de los niveles de PDCD4 y reduce la respuesta al resveratrol (25 mM). Las células fueron expuestas a resveratrol durante 24 h después de la transfección de ARNsi.
B, PDCD4 siRNA (10 nM) redujo significativamente la capacidad de resveratrol (25 M) para inhibir la viabilidad de las células PC-3M-MM2 como se determina por el ensayo de MTS. Después de 24 h de siRNA transfección, las células se sembraron en placa de 96 pocillos y se expusieron a resveratrol durante 72 h.
C, España PDCD4 siRNA invierte parcialmente la capacidad del resveratrol para inducir la apoptosis en células PC-3M-mm2. ensayo de apoptosis se lleva a cabo por la anexina V-FITC tinción después de 48 h de resveratrol tratamiento (25 mM) después de 24 h de siRNA transfección.
D, E, España PDCD4 siRNA (10 nM) bloqueó la capacidad del resveratrol (25 M) para inhibir la migración de las células PC-3M-MM2 en el ensayo de cicatrización de la herida como se demuestra por las dobles flechas
(D )
. Las células fueron transfectadas durante 24 h, después de lo cual se creó la herida y las imágenes fueron tomadas a tiempo, 0 h. Las células se trataron luego con resveratrol durante 24 h y se tomaron imágenes de nuevo. se muestran imágenes representativas. Los datos de
(D) ¿Cuáles son presentados en gráfico de barras en
(E)
.
F, España PDCD4 siRNA (10 nM) revirtió la inhibición resveratrol inducida por la invasión de las células PC-3M-MM2 en el ensayo de invasión de cámara de Boyden modificada. Las células se transfectaron en frascos durante 24 h antes de la siembra en el compartimento superior. Los datos indican la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. (*), (**) Y (***) indican una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) de scramble siRNA, desde el resveratrol + scramble siRNA y de los grupos de tratamiento PDCD4 siRNA, respectivamente
. Las células transfectadas con
pre-miR-21 gratis (30 nM) mostraron mayores niveles de
miR-21
. Las células fueron transfectadas con
pre-miR-21
secuencia durante 48 h y luego se utilizaron para la determinación de los
miR-21
niveles por RT-PCR cuantitativa utilizando el ensayo TaqMan miARN. Control de las células fueron transfectadas con revueltos
pre-MIR.
B,
Pre-miR-21 gratis (30 nM) transfección disminuyó los niveles de PDCD4 y atenúa la respuesta de resveratrol (25 M durante 24 h), como se determinó por Western secante.
C, España
Pre-miR-21 gratis (30 nM) revocó la inhibición resveratrol inducida por la invasión de las células PC-3M-MM2 en el ensayo de invasión de cámara de Boyden modificada.
D, E, España Wound ensayo mostrando inversión de la inhibición resveratrol inducida por la migración de células PC-3M-MM2 curando
pre-miR-21 gratis (30 nM). se muestran imágenes representativas. Los datos en el gráfico de barras se presentan como media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. Los asteriscos (*), (**) y (***) indican una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) de scramble tratados con el control, el resveratrol + scramble
pre-MIR
y
pre-miR 21
transfectaron células PC-3M-mM2, respectivamente.
Reactivos
El resveratrol y LY294002 fueron adquiridos de Sigma Chemical, Co (St. Louis, MO).
Pre-miR-21
oligonucleótido,
pre-MIR
control negativo, PDCD4 siRNA y ARNsi de control negativo fueron adquiridos de Ambion (Houston, TX). anticuerpo anti-PDCD4 era de Epitomics, Inc (Burlingame, CA), mientras que, los anticuerpos contra fosfo-Akt fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Los anticuerpos contra maspin y Akt se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA) y el anticuerpo anti-β-actina fue comprado a Sigma Chemical, Co. Todos los reactivos y materiales eran de la más alta calidad disponible y se adquirieron de fuentes estándar.
Resveratrol inhibe la fosforilación de Akt en una forma dependiente de la dosis. células PC-3M-MM2 fueron expuestas a vehículo o diferentes dosis de resveratrol (5-100 mM) durante 24 h y los lisados de células completas preparados a partir de estas células se utilizaron para la transferencia Western.
B, la inhibición de la fosforilación de Akt por LY294002. células PC-3M-MM2 se trataron con LY294002 (10 mM), un inhibidor de PI3 quinasa, durante 24 h y se utilizan para la transferencia Western para evaluar la activación de Akt.
C de inhibición, España Akt redujo
miR-21
niveles según lo determinado por el análisis conjunto de microARN. células PC-3M-MM2 se trataron con vehículo o LY294002 (10 M) durante 24 h, después de lo cual se aisló el ARN total. Las muestras de ARN se sometieron a análisis de microarrays de
MIR
. Los
MIR
que son conocidos por ser regulados en el cáncer de próstata [19] se muestra el uso de chip de genes Affymetrix. Los paneles se comparan
miARN
perfil del vehículo y células PC-3M-MM2 tratados con LY294002. La intensidad del color rojo y verde indica que el alcance de la regulación hacia abajo-arriba y de
miRNAs
, respectivamente. Se llevaron a cabo estudios similares en tres muestras independientes para cada uno de los grupos de tratamiento.
D, España LY294002 aumento de los niveles PDCD4. células PC-3M-MM2 se expusieron a LY294002 (10 M) durante 24 h y se utilizan para la transferencia Western.
E, España LY294002 aumento de la actividad PDCD4-luciferasa. El plásmido que contiene PDCD4 3'-UTR aguas abajo de la secuencia de codificación de gen de luciferasa se transfectó en las células PC-3M-mm2 para 48 h. Las células se trataron luego con LY294002 (10 M) durante 24 h, después de lo cual se prepararon y sometieron a ensayo de luciferasa lisados celulares. Los datos de la gráfica de barras se presentan como la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. El asterisco (*) indican una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de células tratadas con vehículo
células PC-3M-MM2 se trataron con vehículo o LY294002 (10 M) durante 72 h y la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS.
B, LY294002 (10 mM) de tratamiento durante 48 h apoptosis inducidos en las células PC-3M-MM2 como se determina por tinción con anexina V-FITC y PI que se cuantificó mediante citometría de flujo.
C, España LY294002 (10 M) aumento de la apoptosis de las células PC-3M-MM2, como se determina por el ensayo TUNEL. Las células se trataron con LY294002 durante 24 h y luego se utilizaron para el ensayo de TUNEL, como se describe en Métodos. Se usó tinción con DAPI para identificar los núcleos celulares. se muestran imágenes representativas. La barra de escala es de 100 micras. gráfico de barras
(D)
muestra el porcentaje de células apoptóticas en presencia de 10 mM LY294002.
E, F, España LY294002 (10 mM) de la exposición durante 24 h migración de las células PC-3M-MM2 reducidos, tal como se determina por el ensayo de curación de la herida. se muestran imágenes representativas.
exposición G, España LY294002 (10 M) durante 24 h reduce la invasividad de las células PC-3M-MM2, como se determina por el ensayo de cámara de Boyden modificada. Los datos en el gráfico de barras se presentan como la media ± SEM de al menos 3 experimentos independientes. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de células tratadas con vehículo
El resveratrol suprimió el crecimiento tumoral
in vivo
. Doce ratones SCID fueron divididos en dos grupos- tratamiento con el vehículo y el resveratrol (20 mg /kg de peso corporal). Los fármacos se administraron por sonda oral cada dos días hasta el final del estudio. Las células PC-3M-MM2 luciferasa-etiquetado (1 × 10
6) se inyectaron en la región del flanco de cada ratón en el día 8 (flecha) del tratamiento con resveratrol y se controlará para el crecimiento tumoral. los ratones tratados con resveratrol mostraron suprimen el crecimiento del tumor
(A)
, disminución de la señal de luciferasa
(B, C)
, y los tumores más pequeños
(D)
. Imágenes representativas se muestran en la
(B)
y
(D)
, mientras que en los histogramas
(C)
y
(D) representan la media ±
SEM de seis ratones de cada grupo de tratamiento.
E,
tumores aislados de ratones tratados con resveratrol mostraron niveles de
miR-21
reducirse como se determina por el ensayo TaqMan.
F, España resveratrol regula la expresión de pAkt y PDCD4 en el tejido tumoral. tumores aislados de ratones tratados con vehículo y resveratrol se seccionaron para la tinción inmunohistoquímica para pAkt y PDCD4. La barra de escala es de 50 micras. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). A partir de ratones tratados con vehículo
ratones SCID se trataron con vehículo (n = 4) o resveratrol (20 mg /kg de peso corporal) (n = 6) a través de una sonda oral, cada dos días hasta el final del estudio, a partir de una semana antes de la inyección de células PC-3M-mm2 (1 × 10
6), iv a través de la vena de la cola. Los ratones tratados con resveratrol mostraron una reducción significativamente el número de lesiones metastásicas (flecha). se muestran imágenes representativas de los pulmones de un ratón por grupo de tratamiento.
Ensayo de viabilidad celular (MTS Assay)
in vitro la proliferación celular
PC-3M-MM2 se llevó a cabo mediante el uso de CellTiter 96® acuosa One Solution ensayo de proliferación celular Kit (Promega, Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 2500 células por pocillo fueron sembradas en una placa de 96 pocillos. Después de los tratamientos respectivos, se permitió a las células crecer durante 72 h. Después de 72 h, se añadieron 20 l de CellTiter 96 acuoso reactivo Una solución a cada pocillo en 100 l de volumen total de medios de comunicación. Las células se incubaron durante 3 a 4 h, y la absorbancia se registró a 490 nm usando un lector de placas de ELISA. La absorbancia es directamente proporcional al número de células vivas y se expresa como un porcentaje respecto a las células tratadas con vehículo.
detección de apoptosis por citometría de flujo
La muerte celular a través de apoptosis se determinó mediante el uso de FITC La apoptosis kit -AnnexinV detección (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) y se cuantificó por citometría de flujo como se describe anteriormente [30]. En resumen, al final del tiempo de tratamiento, las células PC-3M-MM2 se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se recogieron en una solución de tripsina /EDTA al 0,5% a 37 ° C, se centrifuga a 220 ×
g
durante 5 minutos y luego inmediatamente se volvieron a suspender en el tampón fisiológico (1X) proporcionado en el kit. Las células (1 × 10
5 células /500 l) y luego se mantuvieron en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente con 5 l de tanto yoduro de propidio y FITC conjugado de anexina V, después de lo cual se analizaron las muestras inmediatamente por BD Biosciences
citómetro
citómetro de flujo (San Jose, CA). Los resultados se cuantificaron utilizando el software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA).
detección de apoptosis por TUNEL ensayo
La muerte celular por apoptosis en células PC-3M-MM2 fue detectado por TUNEL ensayo utilizando ADN FragELTM fluoresceína kit de detección de la fragmentación (EMD Biosciences). Brevemente, las monocapas de células PC-3M-MM2 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio. Al final del tratamiento, las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído. Las células fueron entonces
permeabilized
utilizando proteinasa K (1:100 dilución) (proporcionado en el kit) durante 20 min a temperatura ambiente. Al final de la incubación se lavaron las células con solución salina tamponada con Tris 1X (TBS). Después de lo cual se incubaron con tampón de equilibrio 1X TdT de 10 a 30 min. Después de la incubación había terminado, se aplicaron 60 l de mezcla de reacción TdT etiquetado en cada cubreobjetos y se colocaron en una cámara humidificada y se incubaron durante 1 a 1,5 horas a 37 ° C. A continuación, se enjuagaron las células dos veces con 1X TBS. Las células que contienen cubreobjetos de vidrio se montaron utilizando fluoresceína-FragELTM medios de montaje. El exceso de los medios de montaje se limpió y los bordes se sellaron usando esmalte de uñas. Las láminas fueron imágenes utilizando un microscopio confocal Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY).
de cicatrización de heridas Modificado Ensayo
Igual número de células se sembraron en cada pocillo de doce pocillos placas de cultivo. Después de que las células alcanzaron 70% a 80% de confluencia, una línea estaba rayado en el centro del pozo utilizando una punta de pipeta para crear una herida. imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) de la zona denudada en tres campos al azar por pocillo fueron capturados por una microscopía confocal justo después de la denudación (tiempo, 0 h). Las células se trataron entonces con diferentes reactivos y se incubaron durante otras 24 h, y las imágenes fueron de nuevo registrados. Para la cuantificación, el área de la herida cierre se mide desde el área denudada y normalizado para los controles tratados con vehículo. Para estudiar los efectos de la PDCD4 siRNA y
pre-miR-21
en la cicatrización de heridas de las células PC-3M-MM2, las células fueron transfectadas con siRNA PDCD4,
pre-miR-21
y sus respectivos controles negativos de 24 horas después de que se creó la herida y las imágenes fueron tomadas a tiempo, 0 h.
Modificado Boyden invasión Cámara Ensayo
la capacidad de las células de cáncer de próstata migrar a través de las membranas matrigel recubierto de se midió utilizando cámaras de 24 pocillos BD Biocoat invasión de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). células PC-3M-mm2 (5 × 10
4) se suspendieron en el medio de cultivo sin suero y se sembraron en el compartimiento superior de la cámara de invasión seguida de tratamientos respectivos. Se añadió medio completo a la cámara inferior. Al final de las 24 horas, los insertos de células se eliminaron, y las células fueron eliminados cuidadosamente de la superficie superior de la membrana con un hisopo de algodón. Las células invasoras se adhieren a la superficie inferior de la membrana se tiñeron con 100% de metanol y 1% de azul de toluidina, respectivamente. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio óptico utilizando un objetivo de 20x. Número total de células invadidas se contó manualmente en cuatro campos elegidos al azar por tratamiento por inserción. Para estudiar los efectos de la PDCD4 siRNA y
pre-miR-21
, las células PC-3M-MM2 fueron transfectadas con siRNA PDCD4,
pre-miR-21
y sus respectivos controles negativos para 24 h antes de la siembra ellos en el compartimiento superior.
análisis de transferencia Western
al final del tratamiento, las células PC-3M-MM2 se lavaron con hielo frío 1X PBS y se homogeneizaron usando un sonicador en tampón de lisis enfriado en hielo que contiene 50 mM Tris HCl, MgCl2 10 mM y EDTA 1 mM en presencia de mezcla de inhibidores de proteasa (Sigma) y el inhibidor de fosfatasa 1 (1:100) (Sigma). Los lisados de células enteras fueron utilizadas para el Western Blot como se describe anteriormente [31]. En pocas palabras, la concentración de proteína se determinó por el método de Bradford y la misma cantidad de proteína de cada muestra se mezcló con tampón de solubilización (20% de SDS, 1 M Tris, 20% de glicerol y una pizca de azul de bromofenol) y se calentó en baño de agua a 95 ° C durante 5 min. Las muestras fueron resueltas por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, bloqueada en una solución que contiene 10X PBS, EDTA 10 mM, 20% de Triton X-100 y 5% de leche desnatada baja en grasa durante 1 h, y después se incubaron a 4 ° C durante la noche con el anticuerpo primario. Después de tres lavados en solución de bloqueo (blotto), manchas de transferencia se incubaron con rábano picante especies marcados con peroxidasa anticuerpo secundario IgG específica para 1 h a temperatura ambiente, se lavó tres veces con 1X TBS que contiene 1% de Tween 20. Esto fue seguido por tres lavados con TBS 1X, sin Tween 20. La transferencia se trató con reactivo ECL plus (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) y se visualizaron usando el dispositivo de carga acoplada LAS 4000 (Fujifilm Norte América Corporation, Valhalla, NUEVA YORK). El análisis densitométrico de las bandas se realizó utilizando la versión 2.0 del software multigalga. bandas individuales se normalizaron a cualquiera Total-Akt o β-actina como la relación de proteína diana. Esto fue aún más normalizada como% del control mediante la adopción de los valores del control como 100%.
oligonucleótido y de interferencia corto (si) ARN transfecciones
Sintético
pre-miR-21
(30 ng) (ID#PM10206, Ambion, Austin, TX), PDCD4 siRNA (10 ng) (ID siRNA#s223740, Ambion) y sus respectivos controles negativos fueron entregados en células PC-3M-MM2 utilizando Lipofectamine ™ RNAiMAX ( Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células PC-3M-MM2 se sembraron en placas de 6 pocillos a 30% de confluencia. Al día siguiente, cantidad apropiada de
sus controles negativos pre-miR-21 o
PDCD4 siRNA y se diluyeron en 100 l de medio libre de suero y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos con 5 l de Lipofectamine ™ reactivo de transfección RNAiMAX para permitir la formación de complejos de transfección, que se añadieron a los cultivos celulares girando suavemente las placas. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco después de 5-6 h y se incubaron las células durante 48 h. Para todos los demás experimentos posteriores, el mismo protocolo se siguió a menos que se especifique lo contrario.
Aislamiento de RNA, transcripción inversa y TaqMan PCR en tiempo real
El aislamiento de ARN total a partir de células PC-3M-mm2 y tejidos tumorales se realizó a través QIAzol reactivo de lisis (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
miR-21
cDNA se generó a partir de 200 ng de ARN total, que fue transcripción inversa utilizando
hsa-miR-21
QRT-PCR conjunto de cebadores (Applied Biosystems, Foster City, CA) y TaqMan ® Micro RNA transcripción inversa (RT) kit (Applied Biosystems). Cada reacción de RT RT contenía 1X cebador específico, tampón de reacción 1X RT, 0,15 l de dNTP 100 mM, 50 U de enzima /l MultiScribe RT y 3,8 U inhibidor de RNasa /l. La mezcla de reacción 15 l se incubaron entonces durante 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, y 5 min a 85 ° C y después se mantiene a 4 ° C en un ciclador PCR. La PCR en tiempo real se realizó en Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System utilizando un kit estándar TaqMan® PCR (Applied Biosystems) de protocolo. En pocas palabras, después de la etapa de RT, 2 l de la reacción de RT se combinó con 1 l de 20X TaqMan MicroARN Ensayo (cebador directo, sonda y cebador inverso) y 17 l de mezcla maestra TaqMan PCR Universal en 20 l de volumen final. Las reacciones se incubaron a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Madura
miR-21
expresión se calculó utilizando la 2
-ddC
t con respecto al método de U6 snRNA y se expresa como factor de cambio. Todos los TaqMan-PCR se realizaron por triplicado.
análisis de microarrays
El microarray de perfiles de miARN se realizó utilizando vectores Affymetrix GeneChip miARN v1 (Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante y se llevó a cabo por el Fondo para CFG Microarray Core (Universidad de Albany, Rensselaer, Nueva York). Brevemente, 500 ng del ARN total extraído de las células se marcó mediante polyA Además de la polimerasa usando el kit Genisphere FlashTag HSR (Genisphere, Hatfield, PA). El ARN se hibrida con la gama Affymetrix miARN v1 y escaneado en un escáner GeneChip 30007G según lo recomendado por el vendedor. Los datos en bruto se comprobó la calidad del uso de software de herramienta de control de calidad miARN (Affymetrix). Un análisis más detallado se realizó utilizando GeneSpring Gx V11.3. P-valores de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Como se muestra en la Fig.