Extracto
Antecedentes
La recurrencia de cáncer colorrectal (CCR) es frecuente dentro del primer año de la cirugía de resección curativa y puede ser inevitable. microRNAs se han propuesto para desempeñar un papel en la carcinogénesis y la recurrencia del cáncer. Recientemente hemos identificado microARN-29c (miARN-29c) como predictor de recurrencia temprana en el CCR. En el presente estudio, se investigó aún más el suero de funciones y nivel de miARN-29c en relación con la recurrencia precoz del CCR.
Métodos
En primer lugar nos confirmó la sobreexpresión adicional de miARN-29c en la no primeros temas de recaída. Con ganancia de función
in vitro se utilizaron
estudios para evaluar el efecto de los genes miARN-29c en la proliferación celular, la migración, la invasión y la progresión del ciclo celular. La línea celular de cáncer de colon Caco2 y un clon estable sobreexpresión de los genes miARN-29c fueron xenoinjertado para evaluar la
in vivo
efecto de los genes miARN-29c en ratones nulos. Por último, circulando miARN-29c se investigó como un biomarcador potencial para la identificación de recaída temprana.
Resultados
expresión de los genes miARN-29c disminuyó significativamente durante la recaída temprana en comparación con la recaída no temprano en fase II y la UICC III pacientes de CRC (
P = 0,021
).
in vitro
estudios mostraron que la sobreexpresión de inhibió la proliferación celular miARN-29c y la migración. Los estudios del ciclo celular también revelaron que los genes miARN-29c provocó una acumulación de la población de G1 y G2.
In vivo
, miARN-29c suprimido el crecimiento tumoral en ratones nulos. El suero miARN-29c aumentó significativamente en pacientes con recaída primeros en comparación con los pacientes no transcurridos temprana (
P = 0,012
).
Conclusiones
miARN-29c muestra contra la tumorigénesis actividad, y preoperatorios los niveles circulantes de miARN-29c pueden ser utilizados para predecir la recaída temprana postoperatoria del CCR
Visto:. Yang IP, Tsai NS, Huang CW, Huang MI, Hou MF, Juo S-HH, et al . (2013) La importancia funcional de microARN-29c en pacientes con cáncer colorrectal: un biomarcador circulante potencial para predecir la recaída temprana. PLoS ONE 8 (6): e66842. doi: 10.1371 /journal.pone.0066842
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 3 de diciembre de 2012; Aceptado: 10-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia de la República de China (NSC 99-2320-B-037-014 MY3); Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04, KMUH100-OR16); Biofirma en el cáncer colorrectal, Academia Sinica, Taiwán; y una excelencia para el Centro de Investigación del Cáncer de subvención financiado por el Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, Taiwán, República de China (DOH102 TD-C-111-002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La alta incidencia y mortalidad del cáncer colorrectal (CCR) representa un problema importante de salud pública en todo el mundo [1]. Aunque la resección quirúrgica puede ser muy eficaz para una enfermedad localizada, el 30-40% de los pacientes desarrollan la recurrencia después de la cirugía [2] y 40 a 50% de las recidivas aparentes dentro del primer año después de la resección quirúrgica inicial [3], [4]. El tiempo desde el tratamiento inicial para el desarrollo de recurrencia se ha informado a estar fuertemente relacionado con la supervivencia, en particular en los pacientes dentro de un año de su resección quirúrgica [5]. Se han hecho esfuerzos continuos para buscar métodos simples y fiables /biomarcador para la detección temprana de los tumores y de CRC pronóstico con el fin de proporcionar un tratamiento precoz, adecuado y eficaz.
Un microARN maduro (miARN) es una RNA pequeño, no codificante que contiene aproximadamente 20 nucleótidos y pueden post-transcriptionally regular la expresión de varios genes diana en la misma hora [6]. La tumorigénesis de CRC implica cambios genómicos de varios pasos, incluyendo la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores [7]. miRNAs se han sugerido que juegan un papel en el desarrollo de cánceres, incluyendo carcinogénesis, la progresión y recurrencia [7] - [10]. La mayoría de los estudios publicados se han centrado en la expresión basada en el tejido miARN [8], [11], [12], y sólo unos pocos estudios han investigado miRNAs en pacientes con CCR circulantes [13] - [15]. Estudios recientes han indicado que los niveles séricos de determinados miRNAs pueden servir como biomarcadores potenciales para diversos tipos de cáncer [16] - [18]
Recientemente hemos utilizado una combinación de la bioinformática y enfoques experimentales para predecir y validar los genes miARN-29c. como un biomarcador candidato asociado con CRC recurrencia [19]. En el presente estudio, se utilizó por primera vez un gran conjunto de datos para confirmar la relación entre la expresión de los genes miARN-29c y recurrencia precoz del CCR. Una serie de
in vitro
y
in vivo se llevaron a cabo experimentos
para ilustrar el papel funcional de los genes miARN-29c en el CCR tumorigénesis. Posteriormente, se exploró si el nivel sérico de miARN-29c puede ser utilizado como un biomarcador para predecir la recurrencia temprana de CRC.
Métodos
Pacientes y muestras
Para evitar el potencial influencia del tratamiento neoadyuvante sobre la expresión de los genes miARN, se excluyeron los pacientes si habían sido sometidos a tratamiento neoadyuvante con quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Las muestras de tumores de CRC se obtuvieron de 107 pacientes con CCR primaria en la UICC etapas II /III (56 no-primeros pacientes con recaída y 51 pacientes en recaída-temprano después de la resección radical). Entre estos 107 pacientes, se han reportado datos de miARN-29c para 68 sujetos (27 pacientes con recaída temprana y no 41 pacientes con recidiva temprana) en nuestro documento permeable [19]. CRC recaída temprana se define como la recurrencia local o metástasis a distancia que se produce dentro de 1 año después de la resección radical [5], [20], [21] y los pacientes que recayeron después del primer año y no recayeron durante el tiempo del estudio eran clasificado en el grupo de recaída no temprano. Debido a que la tasa de recidiva del CCR en estadio I es relativamente baja, y los pacientes con estadio IV CRC entidades ya tienen metástasis [19], [20], el presente estudio sólo se reclutaron pacientes con CCR en estadio II y estadio III. CRC tejidos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido después de la resección quirúrgica. Las muestras de suero de 61 pacientes con CRC CRC primaria en la UICC etapas II /III (41 no principios de recaída y 20 pacientes con recidiva temprana) antes de recibir la cirugía se recogieron y se midieron los niveles séricos de miRNA-29c. los niveles séricos de miRNA-29c también se midieron en 23 sujetos sanos (14 mujeres y 9 varones). Ambas muestras de suero y tumorales CRC se obtuvieron de 38 sujetos en este estudio. Todos los sujetos eran no relacionados étnicos chinos que residen en Taiwán. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada sujeto para recoger sus muestras clínicas y de publicar estos detalles del caso y todos los datos de los pacientes fueron anónimos. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Médica de Kaohsiung (Número de protocolo: KMUH-IRB-990343)
extracciones de ARN a partir de tejido
Aproximadamente se homogeneizaron 100 mg de cada tejido utilizando. un homogeneizador de banco superior (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerna, Suiza) y el ARN total, incluyendo mRNA y los genes miARN, se purificó utilizando un sistema de Qiagen RNAeasy (Qiagen, Hamburg,
Alemania |), de acuerdo con el fabricante de instrucciones.
Los niveles de expresión de los genes miARN-29c en CRC pacientes con recidiva precoz y no principios
Para medir los niveles de expresión de los genes miARN-29c, 29c-miARN cDNA fue sintetizado a partir de 20 ng de ARN total con una se utilizó el cebador único (Applied Biosystems Inc., CA) y el ensayo TaqMan miARN RT-qPCR (Applied Biosystems Inc.). Los niveles relativos de expresión de los genes miARN-29c en los tejidos se normalizaron a la de U6b como un control interno mediante la ecuación: log
10 (2
-ΔCt), donde Ct = (Ct
miARN-29c - ct
U6b). La media y la desviación estándar se calcularon los valores de log
10 (2
-ΔCt) (SD).
Cell Cultura y
La línea celular de carcinoma de colon humano Caco2, Lovo, SW480 y SW620 (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS; Gibco-BRL) y 100 U /ml de penicilina [21]. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2.
Construcción de un plásmido para la sobreexpresión de los genes miARN-29c
El vector Pcdh (Sistema Biosciences, Mountain View, CA) se utilizó para evaluar las consecuencias funcionales de la sobreexpresión de los genes miARN-29c. Se construyó el plásmido miARN-29c pCDH- mediante inserción del producto de PCR de los genes miARN-29c en las múltiples regiones del sitio de clonación de Pcdh. Las secuencias de los cebadores utilizados para amplificar los genes miARN-29c fueron tcctgaattcgaggatgccctggagtattcgg y ctaggcggccgcgcatgatcttccttccctattc. El cebador directo se extendió en el extremo 5 'para incluir la secuencia gaattc para crear un
EcoR1
sitio de restricción, y el cebador inverso se alargó en el extremo 5' para incluir la secuencia gcggccgc para crear un
Not1 sitio de restricción
. El constructo se confirmó mediante secuenciación directa del ADN.
Establecimiento de clones estables
células Caco2 (5 × 10
5) se sembraron y se transfectaron con 400 ng de los constructos (ya sea el negativo revueltos vector Pcdh o el plásmido Pcdh-miARN-29c) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se seleccionaron más de un período de 4 semanas mediante el uso de medio de cultivo estándar Las células Caco2 transfectadas de manera estable que contienen el plásmido Pcdh-NC (NC:: control negativo) o el plásmido Pcdh-miARN-29c (la sobreexpresión de los genes miARN-29c O miRNA-29c) suplementado con 12 g /ml de puromicina (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MI). La transfección estable de los plásmidos fue confirmada mediante la realización de un ensayo de miR QRT-PCR.
Análisis de la proliferación celular
Caco2 células clones estables se sembraron y se incubaron durante 22 h, después se incubaron adicionalmente durante otro 2 h con 1/10 volumen de reactivo WST-1 (Roche Diagnostics, Corp., Indianapolis, IN) antes de la absorbancia a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro [21].
Para examinar aún más el papel de los genes miARN -29˚C en la proliferación, se evaluó el efecto de los genes miARN-29c sobre-expresión en el crecimiento de 3 líneas celulares de cáncer diferentes (Lovo, SW480 y SW620). Hacemos la transición transfectadas contiene los genes miARN-29c (gráfico miR-29c, Ambion, EE.UU.) miARN o un control negativo (NC, mirVana miARN mímica, Ambion, EE.UU.) en Lovo, SW480 y SW620 células. Se sembraron las células, se incubaron durante 22 h, y luego se analizaron adicionalmente como se describe permeable.
Ciclo Celular Análisis
Después de la incubación durante 36 h, la progresión del ciclo celular se cuantificó mediante yoduro de propidio (PI, Sigma -Aldrich Co.) tinción y posterior análisis en un citofluorímetro FACScan (Becton Dickinson, NJ) con el software CellQuest (BD Biosciences), según las instrucciones del fabricante.
análisis de la migración celular
Cell la migración se evaluó mediante inserciones Transwell de membrana de policarbonato (Millipore, GmbH, Schwalbach, Alemania) en placas de 24 pocillos. Las células (2 × 10
4) se sembraron en millicells de 24 pocillos y se dejaron migrar durante 24 horas a 37 ° C. Los insertos se enjuagaron en 1X PBS, y las células se retiraron de las membranas con 1% de tripsina en el reactivo de lisis de cultivo celular (Promega, Corp., Madison, WI, EE.UU.). La migración celular se evaluó mediante la cuantificación de la fluorescencia verde del vector Pcdh como se describe anteriormente [21].
cicatrización de heridas Ensayo
Después de formar una monocapa, una herida fue creado en la capa celular por raspado manual con una punta de micropipeta de 200 mL. El medio de cultivo se reemplazó y las células se incubaron a 37 ° C. Cierre de la herida se controló y se fotografió en varios puntos de tiempo (0, 24, y 48 h) bajo un microscopio.
Matrigel invasión de ensayo
invasión celular fue ensayada mediante 24 pozos soportes permeables Transwell ( BD Biosciences, San Jose, CA) con 8 micras de poro de membrana de policarbonato insertos. Las células (1 × 10
4) fueron colocados en la cámara superior y se deja invadir durante 24 h. la invasión de células fue ensayada como se describe anteriormente [21]
Los estudios in vivo Animales
Cuatro semanas de edad /c ratones nude (peso corporal: 12.6 a la 15,6 g) Balb. fueron adquiridos de BioLasco Taiwan Co., Ltd (Taipei, Taiwán) y se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos específicos (certificado no .: 26-99S029). A las 6 semanas de edad, cada ratón desnudo se le inyectaron por vía subcutánea con 1 x 10
7 células Caco2 (NC o OMIR-29c;
N = 4
por línea de células transfectadas) en la zona del cuello. El diámetro del tumor se midió y el volumen del tumor (cm
3) se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen = (anchura x longitud x altura) /2 [22]. Los animales se sacrificaron 3 semanas después de la inyección de las células tumorales, y los tumores se examinaron y se contaron inmediatamente sin fijación previa. Antes del sacrificio, un sistema de imagen no invasiva (Ultra Sensitive Molecular Imaging System Berthold NightOwl, Berthold Tecnología, Oak Ridge, TN) se utilizó para realizar el seguimiento del cáncer de células
in vivo
y para confirmar que los genes miARN-29c que sobreexpresan los plásmidos todavía estaban presentes en las células cancerosas. Esta estrategia de formación de imágenes proporciona un método no invasivo y ultrasensible para la detección de los plásmidos transfectados que expresan GFP. Los protocolos para el uso de animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Médica de Kaohsiung (IACUC Número de Registro: 99052). De acuerdo con los principios rectores con el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
Preparación de suero, la extracción de RNA y niveles de expresión de los genes miARN-29c
La sangre venosa se obtuvo antes de la operación. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 min y el suero se dividió en alícuotas en 1,7 ml tubos Eppendorf. En ausencia de una endógeno expresado de manera estable bien documentado que circula miRNAs para servir como controles de normalización,
C. elegans
sintética
lin-4
miARN (Cel-lin-4, Número de pieza: 4398988, Invitrogen) que se añadió a la preparación de suero antes de la extracción de RNA se utilizó como control de normalización como en estudios anteriores [ ,,,0],23], [24]. Para el aislamiento de ARN a partir de suero, 300 l de suero se homogeneizaron en 900 l de Trizol LS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) con pequeñas modificaciones: 6 l de 1 nm cel-lin-4 fueron añadidos en muestras de suero. Después, se añadieron 250 ml de cloroformo a la muestra y se centrifugó la solución mezclada. Después de una extracción con cloroformo adicional y la precipitación con isopropanol, el sedimento se lavó dos veces por centrifugación con 70% de etanol. El sedimento de ARN se secó durante 10 min a temperatura ambiente y se disolvió en 30 l de agua destilada. tratamiento con DNasa (Qiagen) se llevó a cabo para eliminar cualquier contaminación de ADN.
Para medir los niveles de expresión de los genes miARN-29c, 29c-miARN cDNA fue sintetizado y el ensayo TaqMan RT-qPCR MIR se realiza como se describe permeable. Los niveles relativos de expresión de los genes miARN-29c en el suero se normalizaron a la de Cel-lin-4 utilizando la ecuación: log
10 (2
-ΔCt), donde Ct = (Ct
miARN-29c - ct
Cel-lin-4). La media y la desviación estándar (SD) valores de log
10 (2
-ΔCt) se calcularon.
Análisis estadístico
Las variables continuas se presentan como media ± desviación estándar valores (SD), y las variables dicotómicas se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson y presentados como número y porcentaje valores. El análisis de covarianza se realizó utilizando el software JMP (versión 7.0.1, SAS Institute Inc., Cary, NC) para comparar las medias de los niveles de miARN-29c entre los pacientes con CCR recaída precoz y no principios. La edad, el sexo, y la etapa de CRC se incluyeron como covariables en los modelos estadísticos. Una de 2 colas
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. La potencia estadística se calculó utilizando la calculadora en línea DSS de Investigación de Energía de Estadística (http://www.dssresearch.com/Home.aspx), sobre la base siguiente: prueba de una cola, un alfa de 0,05, el suero de 20 pacientes con recaída temprana y 41 pacientes con recaída no anticipada, así como los niveles de expresión empíricos en cada grupo.
resultados
datos demográficos
las características de los 107 pacientes con CRC independientes (56 no- principios de recaída y 51 pacientes con recidiva temprana) se resumen en la Tabla S1. La media de edad (años) de los primeros pacientes con recaída recaída y no tempranos eran 67,20 y 64,90, respectivamente, siendo el rango de 24 a 88 años. La información relativa a la etapa de la enfermedad, el sexo y la edad de los primeros pacientes que han recaído en recaída y no tempranos se muestra en la Tabla 1. recaída temprana se asoció significativamente con el tipo de tumor y la invasión perineural (
P Hotel & lt; 0,05, Tabla 2), pero la edad, el sexo, el tamaño del tumor, la UICC etapa de pacientes o distribuciones de histología no fueron significativamente diferentes entre los primeros y no los primeros pacientes con recaída (
P Hotel & gt; 0,05, Tabla 2)
Nos recogieron muestras de suero de 61 pacientes con CRC (41 recaída no tempranos y 20 pacientes con recidiva temprana) antes de recibir la cirugía. Las características de los 61 pacientes con CRC para el estudio de suero se resumen en la Tabla S2. De los 61 pacientes que donaron muestras de suero preoperatorios, las muestras tumorales CRC también estaban disponibles para 38 pacientes (30 recaída no anticipada y 8 pacientes con recidiva temprana). Por lo tanto, las dos muestras de suero y CRC se analizaron de forma simultánea para 38 pacientes en el presente estudio.
miARN expresión en pacientes con recaída precoz y no principios
Los miARN-29c niveles de expresión en el tumor 107 CRC Las muestras fueron diferentes entre los pacientes con recaída temprana y no principios. La media de registro
10 (2
-ΔCt) fue de 0,67 en el grupo de recaída no temprano y 0,37 en el grupo de recaída temprana (
P = 0,021
, Fig. 1A). Por lo tanto, los niveles de miARN-29c fueron más bajos en las muestras de pacientes con recidiva temprana de 2,00 veces en comparación a la de las muestras de pacientes con recaída no anticipadas. Esto es similar a nuestro informe anterior de un cambio de 2,04 veces [19]. recaída temprana se asoció significativamente con la invasión perineural, tipo de tumor y menor expresión de los genes miARN-29c tumoral mediante análisis univariante y multivariante (tabla 2), pero los niveles de expresión de los genes miARN-29c no se asociaron significativamente con cualquier variable clinicopatológica (Tabla 3). Por lo tanto, la expresión de los genes miARN-29c es un factor predictor independiente para detectar la recidiva temprana del CRC. Estos resultados verifican de nuevo nuestros datos anteriores [19], y apoyan miARN-29c como un potencial predictor de la recidiva temprana del CRC después de la cirugía.
(A) los niveles de expresión de los genes miARN-29c en 56 no temprana y 51 primeros recaída muestras de tumor de CRC. El nivel de expresión se redujo significativamente en los tumores de recaída temprana (
P = 0,021
). (B) WST-1 ensayo que demuestra que los genes miARN-29c suprime la proliferación de células tumorales (
P = 0,006
). OMIR-29c indica que el clon de células que sobreexpresan de forma estable Caco2 miARN-29c, y NC indica que el control clon estable negativo. (C) La sobreexpresión de los genes miARN-29c provoca una acumulación significativa de células en la fase G2 (
P =
0,02). Negro: G1 /G0 fase; gris claro: la fase S; y gris oscuro: la fase G2. ensayo (D) Transwell que muestra que la sobreexpresión de los genes miARN-29c suprime la migración de células tumorales (
P Hotel & lt; 0,0001). (E) La sobreexpresión de los genes miARN-29c no afecta a la invasión de células tumorales (
P = 0,349
). (F) La sobreexpresión de los genes miARN-29c disminuye la migración celular, como se indica por una diferencia de anchura aumentada en O miRNA-29c en comparación con NC en 24 y 48 h. Las fotografías que muestran la inhibición de la migración de células tumorales se obtuvieron a partir del ensayo hiriendo curación.
Para aclarar el papel de la expresión de los genes miARN-29c en pacientes con recaída temprana, se compararon adicionalmente la expresión de los genes miARN-29c entre recaída
vs
. grupos no recaída. Siete pacientes del grupo de recaída temprana no se presentaron recaídas después del primer año; por lo tanto, fueron reclasificadas en grupo recaída. Los niveles de expresión de los genes miARN-29c entre los pacientes con recaída y no una recaída y la media de registro
10 (2
-ΔCt) fue de 0,65 en el grupo de no recaída y 0,43 en el grupo de recaída (
P
= 0,099, figura no. mostrado).
la sobreexpresión de los genes miARN-proliferación Influencias 29c de la célula y la progresión del ciclo celular
Para examinar el papel de los genes miARN-29c en la tumorigénesis, hemos evaluado el efecto de los genes miARN-29c en el crecimiento de las células Caco2. Establecimos un clon estable Caco2 (OMIR-29c) con sobreexpresión de los genes miARN-29c. El nivel medio de miRNA-29c en OMIR-29c fue de 0,45 (expresado como log
10 (2
-ΔCt)), que era más alto que el nivel medio de los genes miARN-29c en el control negativo (CN) por clon 2.82 veces. Como se muestra en la Fig. 1B, la tasa de proliferación de OMIR-29c fue sólo 58,7% de la tasa de NC después de 24 h (
P =
0.006). Debido a que algunos de los genes miARN-29c previstos están relacionados con la progresión del ciclo celular y el crecimiento celular, se evaluó si los genes miARN-29c influyó en el ciclo celular por citometría de flujo. Nuestros datos muestran que OMIR-29c aumentó significativamente la acumulación de la población de células G2 (19,4% en OMIR-29c
vs
14,7% en NC,
P =
0,02;. La Fig. 1C) , aumentó ligeramente la acumulación de la población G1 /G0 (47,1% en OMIR-29c
vs
. 43,1% en Carolina del Norte,
P = 0,43
), y la disminución de la acumulación de la S- población de fase (33,48% en OMIR-29c
vs
. 42.21% en Carolina del Norte,
P
= 0,14). Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de los genes miARN-29c inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon debido a la disminución de la fase S y la inducción de la detención G2.
Mediante el análisis de proliferación con la transición transfectadas con los genes miARN-29c miARN (miARN-29c mímica ) o el control negativo (CN, mirVana miARN gráfico) en Lovo, SW480 y células SW620, se encontró que la tasa de proliferación de miARN-29c células de sobreexpresión fueron significativamente hasta el 50,9% (Lovo) y el 51,9% (SW480) de la tasa de Carolina del Norte después de 24 h (
P = 0,016 y 0,009
, respectivamente, Fig. S1). Sin embargo, la tasa de proliferación de SW620 no se mostró significativamente diferentes (hasta 92,4%) en los miARN-29c células de sobreexpresión. En consecuencia, además de CaCo2, miARN-29c también sería suprimir el crecimiento de líneas celulares de cáncer de colon:. Lovo y SW480, SW620, pero no
Efectos de la sobreexpresión de los genes miARN-29c sobre la migración celular
los datos del ensayo de transwell (Fig. 1D) indicaron que OMIR-29c muestra la migración más lenta que hizo NC por 56% (
P
& lt; 0,0001). La inhibición de la migración se evaluó también en un ensayo de cicatrización de heridas en el que la anchura de la herida era 800 micras. Las anchuras de las lagunas en Carolina del Norte y OMIR-29c fueron de 100 y 180 micras a las 24 h, respectivamente, y fueron 0 y 100 micras, con 48 h, respectivamente. Estos resultados sugirieron que la migración celular se redujo significativamente en OMIR-29c. Estos ensayos mostraron consistentemente que la migración celular se redujo drásticamente cuando miARN-29c se sobreexpresa (Fig. 1F).
Efectos de la sobreexpresión de los genes miARN-29c en células tumorales invasión
Los datos de la invasión de Matrigel ensayo no mostró diferencias significativas entre la OMIR-29c y clones NC en relación con su capacidad de invasión. Este hallazgo sugiere que la sobreexpresión de los genes miARN-29c no afectó la invasión de las células tumorales (
P =
0,349, Fig. 1E).
efecto de la sobreexpresión de los genes miARN-29c en ratones desnudos
a fin de validar el efecto anti-tumoral en los genes miARN-29c, se examinó el efecto de la sobreexpresión de los genes miARN-29c sobre el crecimiento tumoral
in vivo
. Después de la inyección subcutánea de la OMIR-29c y clones NC en el cuello de los ratones desnudos, las masas tumorales se hicieron palpable 7 días después de la inoculación y se les permitió crecer hasta el final de tercera semana (Fig. 2A). Los ratones que recibieron células OMIR-29c tuvo significativamente más pequeños bultos de cáncer que hicieron los que recibieron células NC (
P = 0,018
; Fig. 2B y 2C). Los datos de Ultra Sensitive Estrategia de Imagen Molecular confirmó la sobreexpresión de los genes miARN-29c en el clon OMIR-29c 3 semanas después de la siembra de células tumorales a través de la detección de la fluorescencia verde
proteína (Fig. 2D). Los resultados de la
in vivo
experimento proporcionado apoyar aún más el hecho de que la sobreexpresión de los genes miARN-29c resultados en una reducción de la proliferación de tumores en animales de experimentación.
OMIR-29c es el clon Caco2 estable overexpressing miARN-29c, y NC es el clon estable de control. (A) Fotografías de ratones nulos por vía subcutánea inyectados con células NC (
N = página 4, panel superior) o con células OMIR-29c (
N = página 4, panel inferior) se tomaron 21 días después de la inyección. (B) Los terrones tumorales fueron menores en el grupo OMIR-29c (panel inferior) que en el grupo NC (panel superior) después de 21 días. (C) El tumor (cm
3) curvas de crecimiento para OMIR-29c (- - -; gris) y las células NC (negro) -; más de 21 días (
P = 0,018
). (D) mediante la estrategia Ultra Sensitive Molecular Imaging, la actividad luciferasa en los bultos pueden ser escaneados sin invasión de las fotografías de los ratones nulos por vía subcutánea inyectados con células OMIR-29c tomadas 21 días después de la inyección.
que circula miARN expresión en pacientes con recaída precoz y no principios
suero preoperatorio niveles de miARN-29c fueron significativamente diferentes entre los primeros y no los primeros pacientes con recaída. La media de registro
10 (2
-ΔCt) fueron -3,841 en el grupo no-principios de recaída y -3,216 en el grupo de recaída temprana (Fig. 3A). los niveles de miARN-29c suero no fueron significativamente diferentes entre el grupo de sujetos sanos y el grupo de no-recaída temprana (
P = 0,256
), pero el miARN-29c aumentaron significativamente en pacientes con recaída primeros en comparación con el grupo de sujetos sanos y no temprana grupo recidivante (
P Hotel & lt; 0,0001 y
P = 0,012
, respectivamente). Basándose en los datos de suero, nuestro tamaño de muestra de 61 logra una potencia estadística de 83,1%. El análisis de la recurrencia temprana de la recaída (línea en blanco) y grupos sin fines de primeros recaída (línea gris) se evaluó mediante el método de Kaplan-Meier y los patrones de repetición que se muestra en la Fig. 3B.
(A) Los niveles de expresión de los genes miARN-29c circulantes están desreguladas en las muestras de suero de 23 sujetos sanos, 41 no anticipada y 20 pacientes tempranos de recaída CRC. Los niveles séricos de miARN-29c no fueron significativamente diferentes entre el grupo de sujetos sanos y el grupo de no-recaída temprana (
P = 0,256
). El nivel de expresión es significativamente mayor en las muestras de suero de pacientes con recaída temprana en comparación con el grupo de sujetos sanos (
P Hotel & lt; 0,0001) y no a principios de recaída grupo (
P = 0,012
). (B) El análisis de la recurrencia en pacientes con CRC se evaluó por el método de Kaplan-Meier y se muestran los patrones de la primera recaída (línea en blanco) y grupos no recayeron primeros (línea gris).
Discusión
el aumento de investigación sobre la función de miRNAs ha creado una nueva era en la que la tumorigénesis se puede entender mejor. Sin embargo, el papel de los miRNAs en la recurrencia de la CRC, en particular en CRC temprano en recaída, sigue sin estar claro. Recientemente, el uso de análisis computacional de los perfiles de expresión de ARNm, se informó de que los genes miARN-29c es un predictor de recaída temprana CRC [19]. En el presente estudio, hemos utilizado un mayor tamaño de la muestra para confirmar que la expresión de los genes miARN-29c en el tejido tumoral y el suero puede predecir la recurrencia temprana de CRC, y llevamos a cabo una serie de
in vitro
y
in vivo
estudios funcionales para aclarar aún más el papel de los genes miARN-29c en el CCR tumorigénesis.
in vitro, España se demostró que los genes miARN-29c inhibe la proliferación prominente cáncer de colon y la migración celular, pero no la invasión. La sobreexpresión de los genes miARN-29c puede detener el ciclo celular en la fase G2, que conduce a la inhibición de la proliferación celular. En ratones desnudos, las células de cáncer de colon que sobreexpresan los genes miARN-29c muestran una tasa de crecimiento significativamente más lento que hizo controlar las células cancerosas. Por otra parte, los niveles preoperatorios de miARN-29c se asociaron prominente con la recurrencia precoz postoperatoria. En consecuencia, nuestros resultados a partir de células, animales y estudios en humanos indican consistentemente que los genes miARN-29c ejerce un efecto anti-tumorigénesis, y puede ser un biomarcador útil para la predicción de la recidiva precoz en pacientes con CCR después de la operación.
estudios recientes han revelado que los genes miARN-29c está implicado en una variedad de procesos biológicos, incluyendo carcinogénesis de varios cánceres humanos tales como la leucemia linfocítica crónica [25], cáncer de pulmón [26], cáncer de próstata [27], y el cáncer de mama invasivo [ ,,,0],28]. Sin embargo, excepto nuestra reciente publicación [19], los estudios relacionados con el papel de los genes miARN-29c en el CCR patogénesis y la recurrencia son limitadas. El papel fundamental de los genes miARN-29c en la regulación de la expresión génica en la tumorigénesis aún no se ha explorado a través de perfiles de ARNm diana. factor de necrosis tumoral alfa de la proteína inducida por 3 (TNFAIP3), un regulador clave en la inflamación y la inmunidad, se ha encontrado que se correlaciona inversamente con los niveles de miARN-29c y fue identificado como un objetivo de los genes miARN-29c [29]. La sobreexpresión de los genes miARN-29c en células de carcinoma hepatocelular relacionado con el virus de la hepatitis B suprime eficazmente la expresión TNFAIP3 y la replicación del ADN del VHB, así como la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis [29]. miRNA-29c puede afectar a la tumorigénesis mediante el trabajo dentro de los confines de supresor tumoral conocido (es decir, p53) vías. El supresor de tumores p53, codificada por el
TP53
gen, es reconocido como el guardián del genoma humano, ya que regula muchos genes abajo para ejercer su función en la progresión del ciclo celular y la muerte celular. Kumar
et al
señalado que el ser humano
TP53
gen puede ser regulada negativamente por varios miRNAs:. MiARN-125b, miRNA-504, miARN-25, y los genes miARN-30d [30] . Un estudio reciente ha demostrado que los genes miARN-29 también está implicado en la ruta de p53 y los genes miARN-29 miembros de la familia (miARN-29a, miARN-29b, y los genes miARN-29c) se puede regular al alza los niveles de p53 e inducir la apoptosis de una manera dependiente de p53 suprimiendo directamente p85 alfa (la subunidad reguladora de PI3 quinasa) y Cdc42 (una GTPasa de la familia Rho [31]. Nuestro trabajo reciente sobre los genes miARN-29c sugirieron que DNMT3A, DNMT3B, y p53 están probablemente involucrados en la vía potencial de la CRC el desarrollo [19]. los estudios anteriores demuestran el papel de los genes miARN-29c en la supresión de la progresión del CRC o la repetición. del mismo modo, un estudio reciente indica que los genes miARN-29c era frecuentemente regulado por disminución en los tejidos afectados por el carcinoma de células escamosas de esófago, y los genes miARN-29c podría suprimir el crecimiento tumoral mediante la inducción del ciclo celular G (1) /G (0) arrestar principalmente a través de la modulación de la expresión de ciclina E [32]. del mismo modo, hemos demostrado que la sobreexpresión de los genes miARN-29c puede inhibir la proliferación de células de cáncer de colon mediante la reducción la acumulación de la población fase S
.
Nuestros datos indican que los genes miARN-29c inhibe prominente la proliferación y migración de células de cáncer de colon, pero no tiene efecto sobre la invasión de células.