Extracto
Dachshund humano homólogo 1 (
DACH1
) es un componente importante de la determinación de la retina de genes red. La pérdida de expresión DACH1 se encontró en mama, próstata, pulmón, endometrio, colorrectal y carcinoma hepatocelular. Para explorar la expresión, regulación y función de
DACH1 Hoteles en cáncer de esófago humano, 11 líneas celulares de cáncer de esófago, 10 casos de mucosa normal del esófago, 51 casos de diferentes grados de displasia y 104 casos de cáncer escamoso esofágico primario eran empleada. PCR específica de metilación, inmunohistoquímica, transferencia de Western, citometría de flujo, se utilizaron pequeños RNAs de interferencia, las técnicas de formación de colonias y ratones de xenoinjerto modelo. Hemos encontrado que
DACH1
expresión estaba regulada por región del promotor hipermetilación en líneas celulares de cáncer de esófago. 18,8% (6 de 32) de grado 1, el 42,1% (8 de 19) de grado 2 y grado 3 displasia (ED2,3), y el 61,5% (64 de 104) de cáncer de esófago se metilado, pero no se encontró metilación en 10 casos de mucosa esofágica normal. La metilación se incrementó en tendencia progresión durante la carcinogénesis de esófago (
P
& lt; 0,01).
DACH1
metilación se asoció con una pobre diferenciación (
P Hotel & lt; 0,05) y el estadio tumoral tarde (
P Hotel & lt; 0,05). Restauración de
DACH1
expresión inhibió el crecimiento celular y la señalización de TGF-β activado en KYSE150 y KYSE510 células.
DACH1
suprimió el crecimiento tumoral de células de cáncer de esófago humano en ratones de xenoinjerto. En conclusión,
DACH1
frecuencia es metilado en el cáncer de esófago humano y la metilación de
DACH1
está implicada en la primera etapa de la carcinogénesis de esófago. DACH1 expresión está regulada por la región del promotor hipermetilación.
DACH1
suprime el crecimiento del cáncer de esófago mediante la activación de la señalización de TGF-β
Visto:. Wu L, Herman JG, Brock MV, Wu K, Mao G, Yan W, et al. (2014) El silenciamiento
DACH1
Para promover el crecimiento del cáncer de esófago por el inhibidor de TGF-β señalización. PLoS ONE 9 (4): e95509. doi: 10.1371 /journal.pone.0095509
Editor: Dajun Deng, Hospital del Cáncer y el Instituto de la Universidad de Pekín, China
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: March 26, 2014; Publicado: 17 Abril 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de: el Programa Nacional de Investigación básica (973 Programa No. 2012CB934002, 2010CB912802), de alta tecnología Nacional de I & amp; D del Programa (Programa 863 Nº SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303), Programa Especial Instrumento Nacional clave Científica de China ( subvención Nº 2011YQ03013405) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (subvención No. 81121004, 81071953, 81161120432, 81072169, 81172422, 81261120395). Las direcciones URL de los sitios web de los financiadores son: Programa Nacional de Investigación Básica: http://www.973.gov.cn/Default_3.aspx; Nacional de I-alta tecnología & amp; D Programa: http://www.863.gov.cn/; Programa Especial Instrumento Nacional Clave Científica de China: http://www.most.gov.cn/index.htm; Fundación Nacional de Ciencias de China: http://www.nsfc.gov.cn/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. JGH es un consultor para MDxHealth, sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer de esófago es la quinta enfermedad más maligna y ha sido clasificada como la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en china. [1] El carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) es el tipo histológico predominante de cáncer de esófago, y representa aproximadamente el 90% de los casos de cáncer de esófago en el norte y centro del. [2] A pesar del desarrollo de terapias multimodales, la supervivencia global 5 años permanece por debajo de 20%. [3] Los mecanismos de la carcinogénesis de esófago siguen sin estar claros. alteraciones genéticas y epigenéticas múltiples fueron considerados como factores importantes para el desarrollo de cáncer de esófago [4] - [6]
Dachshund homólogo 1 (
DACH1
), un componente importante de la red de genes Determinación de la retina. , se expresa ampliamente en las células epiteliales. Reducción de expresión DACH1 se asoció con un mal pronóstico en cáncer de mama, próstata, pulmón, endometrio, colorrectal y el cáncer hepático. [7] - [13] La expresión de DACH1 fue regulada por el promotor hipermetilación en la región de endometrio, colorrectal y cáncer hepatocelular. [11] - [13]
DACH1
suprimida carcinoma hepatocelular humano mediante la activación de la señalización de TGF-β. [13] Mientras que los cambios epigenéticos y la función de
DACH1
en CECA humana siguen sin estar claros. En este estudio, se analizaron principalmente los cambios epigenéticos y el mecanismo de DACH1 sobre la carcinogénesis de esófago.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los protocolos de estudio fueron aprobados por la Ética se obtuvo, y el consentimiento informado por escrito de los participantes: Comité del hospital general del EPL de china (20090701-015 número de permiso). Todos los procedimientos de investigación con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital General del EPL de China (Número de Permiso: 2013-X8-40) y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki 1975 y era compatible con las normas de buena práctica clínica y los requisitos reglamentarios locales.
muestras de tejidos humanos y líneas celulares primarias
Un total de 104 casos de carcinoma de células escamosas de esófago primario se recogieron como tejido fresco congelado, del hospital general del EPL de china. Todas las muestras se clasifican por etapa TNM, incluyendo la etapa I (N = 5), la etapa II (N = 66), la etapa III (N = 32), y de la etapa IV (N = 1). Cincuenta y un casos de displasia esofágica se recogieron como muestras incluidas en parafina, incluyendo 32 casos de displasia de grado 1 (ED1), 11 casos de displasia de grado 2 (ED2) y 8 casos de displasia de grado 3 (ED3). Diez casos de mucosa esofágica normal (NE) se recogieron mediante biopsia bajo endoscopia del Hospital General del EPL de China. Entre 104 muestras de cáncer, estaban disponibles con tejido adyacente emparejado 30 casos de bloques de parafina. Once líneas celulares humanas CECA (KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510, TE1, TE3 y TE8) fueron incluidos en este estudio. Se describieron Todas las líneas celulares CECA anteriormente [14] - [17], y se mantuvieron en RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal 10% y antibióticos. El Comité de Ética del Hospital General del EPL chino aprobó este estudio (Permiso Número: 20090701-015)., Y se obtuvo el consentimiento informado por escrito antes de la recogida de muestras y líneas celulares de tejido
5-Aza-2' desoxicitidina tratamiento, aislamiento de RNA y transcripción reversa-PCR
líneas celulares CECA semi-cuantitativos se partieron de baja densidad (30% de confluencia) 12 horas antes del tratamiento. Las células fueron tratadas con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-AZA) (Sigma-Aldrich) a una concentración de 2 mM en el medio de crecimiento, que se intercambió cada 24 h para un total de tratamiento de 96 h. Al final del ciclo de tratamiento, se recogieron las células y el ARN total fue aislado por el reactivo Trizol (Invitrogen). Semi-cuantitativa PCR con transcripción inversa (RT-PCR) se realizó como se describe anteriormente [12].
bisulfito de modificación, PCR específica de metilación y bisulfito de Secuenciación
El ADN genómico de líneas celulares CECA y primaria tejidos CECA se prepararon por el método de la proteinasa-K. PCR específica de metilación (MSP) y bisulfito de secuenciación (BSSQ) se realizaron como se ha descrito anteriormente. [18], [19] cebadores MSP y cebadores BSSQ [12] fueron diseñados de acuerdo con las secuencias genómicas alrededor del sitio de inicio de la transcripción en la isla CpG de
DACH1
gen (GenBank NM_080759.4) región promotora y sintetizados (BGI )) para detectar alelos no metilados (U) y metilado (M.
La inmunohistoquímica (IHC)
tinción inmunohistoquímica para DACH1 se realizó en secciones seriadas de espesor 4 micras derivados de los bloques de parafina dehído-fijo formales utilizando anticuerpo contra DACH1 (dilución 1:500, Proteintech) como se describe anteriormente. [12] La intensidad de la tinción y la extensión de la zona manchada fueron clasificados de acuerdo con el sistema de puntuación semicuantitativo alemán, que también fue descrito anteriormente [12].
Construcción del plásmido y transfección
La
DACH1
vector de expresión fue un regalo del doctor Cvekl. El
DACH1
vector de expresión y los elementos de unión a Smad (SBE) -4 plásmido informador Luc fueron descritos anteriormente. [20]
DACH1
fue también subclonaron en pLenti6-GFP vector. Traslado construcciones de vector y la mezcla de empaques ViraPower se cotransfectaron 293FT células para obtener lentivirus de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). a continuación, se añadió a lentivirus KYSE510 y KYSE150 células, y por sceened Blasticidina (5 mg /ml, Invitrogen) para generar
DACH1
células expresados de forma estable. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se utilizó para la transfección del plásmido. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación.
Ensayo de viabilidad celular
DACH1
células expresados de forma estable y no expresada de control fueron sembradas en placas de 96 pocillos (3 × 10
3 células /pocillo), y la viabilidad celular se midió diariamente durante 96 horas utilizando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratorie) según las instrucciones del fabricante. Los resultados se representan como la media ± SD. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Formación de Colonias Ensayo
DACH1
células expresaban de forma estable y no expresada de control (5 x 10
2 células /así) se sembraron en 2 ml de medio de crecimiento completo. El medio y los reactivos se cambian una vez a las 72 horas. Después de 2 semanas de incubación, las células se fijaron con 75% de etanol durante 30 minutos y se tiñeron con violeta de cristal 0,2% (Beyotime) durante 20 minutos y contando. Para cada experimento, el ensayo de formación de colonias se realizó tres veces.
Citometría de flujo Análisis
Para el análisis del ciclo celular, el kit de detección de Ciclo Celular (KeyGen Biotech) fue utilizado según las instrucciones del fabricante. Cada muestra se analizó por citometría de flujo con un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) utilizando un láser de 488 nm. Los histogramas se analizaron para los compartimentos del ciclo celular utilizando ModFit versión 2.0 (Verity Software House). Para el análisis de la apoptosis, la Anexina V-FITC kit de detección de apoptosis (KeyGen Biotech) se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
DACH1 Tumbes por siRNA
Cuatro pequeños RNAs de interferencia (siRNA) seleccionados de segmentación
DACH1 Opiniones y ARNi negativo Duplex de control se utilizaron en este estudio, y las secuencias fueron descritos anteriormente. [12] RNAi oligonucleótido o RNAi control negativo Duplex (GenePharma) se transfectó en las células utilizando Lipofectamine KYSE140 RNAiMAX reactivo (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Dual-Luciferase reportero de ensayo
KYSE510 y KYSE150 células (3 × 10
3) fueron sembradas en placas de 96 pocillos, se incubaron durante 24 horas y se transfectaron con una combinación apropiada de la reportero, plásmidos de expresión y vector de control, incluyendo plásmido reportero SBE4-luc (20 ng /pocillo ), control de vectores pRL-TK (2 ng /pocillo) como reportero de control interno, y cantidades crecientes de
DACH1
plásmido exprssion. Las células se privaron de suero durante 36 horas y después se estimularon con o sin TGF-β1 (Peprotech) durante 12 horas antes del ensayo de luciferasa. las actividades relativas de luciferasa se midieron con el sistema reportero de ensayo Dual Luciferase (Promega) según las instrucciones del fabricante. Para cada experimento, el ensayo de informador de luciferasa se realizó tres veces. Se realizaron
preparación proteína y análisis de transferencia Western
aislamiento de proteínas y Western blot como se describió anteriormente. [12] Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: DACH1 (Proteintech); c-Myc, p21, fosfo-Smad3, cyclinD1 (Cell tecnología de señalización); CDK4 (afinidad); fosfato Smad2 (Millipore); cyclinE1, CDK2, Smad2 y Smad3 (Bioworld Tecnología); ß-actina (Beyotime). Las transferencias se visualizaron utilizando un aumento de quimioluminiscencia (Pierce Bioscience).
In vivo
tumorigenicidad
DACH1
estable expresó KYSE510 células y el control no expresada (4 × 10
6 células en 0,2 ml de solución salina) tamponada con fosfato fue inyectada por vía subcutánea en el flanco dorsal de 5 semanas de edad, hembra BABL ratones /c desnudo, respectivamente; cada grupo incluía 5 ratones. El tamaño del tumor se midió cada 5 días durante 4 semanas desde 5 días después de la implantación, y se determinó el volumen del tumor con la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = [longitud (mm)] x [anchura (mm) ]
2/2. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital General del EPL de China (Número de Permiso: 2013-X8-40). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Análisis estadístico
Los datos recogidos de múltiples experimentos independientes se presentan como la media ± SEM, y se analizaron utilizando
t
test de Student. DACH1 nivel de expresión entre el cáncer de esófago y muestras de tejidos adyacentes emparejados se compararon mediante la prueba de Wilcoxon signed-rank. coeficiente de correlación de Spearman se calculó para la evaluación de la correlación entre la expresión y la metilación de DACH1. La relación entre las características clínico-patológicas y el estado de metilación DACH1 se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. Un
p valor Red de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 15.0.
Resultados
Expresión DACH1 está regulada por la región promotora hipermetilación en CECA líneas celulares
DACH1 expresión estaba regulada por el promotor de la región hipermetilación en colorrectal humano y carcinoma hepatocelular. [12], [13] Para explorar la regulación de los
DACH1
en CECA, la expresión y el estado de metilación de
DACH1
fueron detectados por RT-PCR y MSP en líneas celulares de cáncer de esófago. Como se muestra en la figura 1A, se encontró que la pérdida de expresión DACH1 en KYSE150, KYSE510, TE1 y células TE3, se apareció la expresión DACH1 reducida en las células TE8, y no se detectó expresión de DACH1 en KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 y KYSE410 células . resultados MSP se muestran en la figura 1B.
DACH1
era completamente metilado en KYSE150, KYSE510, TE1 y células TE3, parcialmente en TE8, y no metilado en KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 y KYSE410 células. MSP resultados fueron validados mediante la secuenciación de bisulfito (BSSQ) en KYSE150, KYSE510, TE8 y KYSE140 células (Fig. 1C). Los resultados anteriores indican que la región del promotor hipermetilación se correlaciona con la pérdida /reducción de los
DACH1
expresión. Reexpresión /aumento de la expresión de
DACH1
fue inducida por 5-aza-2'- desoxicitidina (5-AZA) en
DACH1
metilado líneas celulares de cáncer de esófago (KYSE150, KYSE510, TE8, Fig. 1A). Estos datos sugieren que
DACH1
expresión está regulada por el promotor región de metilación en líneas celulares CECA.
(A)
DACH1
nivel de expresión detectado por RT-PCR en células de cáncer de esófago líneas. (B) El estado de metilación de la región promotora; IVD:
in vitro
ADN metilado, utilizado como control metilación; NL: normal de ADN de linfocitos de sangre, que se utiliza como control no metilación; U: alelos no metilados; M: metilado alelos. (C) BSSQ de
DACH1
región promotora (-426 pb a -140 pb) en KYSE150, KYSE510, TE8 y KYSE140 células; Flecha de doble punta: MSP producto de PCR, que abarca 130 pb. Los símbolos en negro: sitios CpG metilados; círculos abiertos: sitios CpG no metilados.
DACH1 está metilado frecuentes en el cáncer de esófago humano
Para estudiar más a fondo el estado de metilación de
DACH1
durante el desarrollo de la CECA humana, 10 casos de mucosa esofágica normal fue de 51 casos de diferentes grados de displasia y 104 casos de la CECA primaria fueron detectados por MSP. Como se muestra en la figura 2A y 2B, el 18,8% (6 de 32) del esófago displasia de grado 1 (ED1), 42,1% (8 de 19) de grado 2 y grado 3 displasia (ED2,3), y el 61,5% (64 de 104) de cáncer de esófago invasiva (CE) se metilado, pero fue metilado ninguno de los 10 casos de mucosa esofágica normal. La frecuencia de
DACH1
metilación se incrementó en la tendencia progresión durante la carcinogénesis de esófago (
P Hotel & lt; 0,01).
DACH1
metilación se asoció con una pobre diferenciación (
P Hotel & lt; 0,05) y el estadio tumoral tarde (
P Hotel & lt; 0,05) significativamente. No se encontró asociación entre el
DACH1
metilación y la edad, el género, la metástasis o tamaño del tumor (
P Hotel & gt; 0,05, Tabla 1). Los resultados anteriores indican que
DACH1
metilación es un evento temprano de la carcinogénesis de esófago y la metilación de
DACH1
se acumula durante la progresión del cáncer de esófago. La expresión de DACH1 se evaluó por inmunohistoquímica (IHC) en 30 casos de cáncer de esófago emparejado y muestras de tejido adyacentes. La expresión se redujo significativamente en las muestras de cáncer (
P
. & Lt; 0,01, Fig 2C y 2D). Se sugiere que
DACH1
es un posible supresor tumoral en el cáncer de esófago. Para ver si la expresión DACH1 estaba regulada por la metilación del ADN en el cáncer primario humano, se analizó la asociación de DACH1 expresión y la región del promotor hipermetilación. La reducción de expresión se encontró en 19 casos de tejido de cáncer y 15 casos se metilado (Fig. 2E). Reducción de expresión DACH1 se asoció con la región promotor hipermetilación significativamente (
P
& lt; 0,01). Estos resultados sugieren que la expresión está regulada por DACH1 región del promotor hipermetilación en CECA primaria humana.
(A) Los resultados representativos de MSP
DACH1
estado de metilación en la mucosa normal del esófago (NE), displasia esofágica ( ED) y el cáncer de esófago (CE). (B)
DACH1
frecuencia de metilación en el NE, ED1, ED2 y ED3, y EC. La frecuencia de metilado
DACH1
se trazaron de acuerdo con el grado histológico y se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado. **,
P Hotel & lt; 0,01. Resultados (C) Representante de IHC para la expresión DACH1 en el cáncer esofágico primario (izquierda) y los tejidos adyacentes (derecha); fase superior, X200; fase inferior, X400. (D) el nivel de expresión DACH1 en 30 casos corresponde cáncer primario y muestras de tejidos adyacentes; diagrama de caja: representa el nivel de expresión DACH1; línea horizontal: representar el nivel medio; la línea superior e inferior de las cajas representan el 75% y el 25% nivel de expresión, respectivamente; las barras verticales representan diferentes niveles de expresión. **,
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con muestras de tejidos adyacentes mediante el uso de la prueba de Wilcoxon signed-rank. (E) La asociación de
DACH1
metilación y la pérdida /reducción de expresión en 30 casos la CECA. **,
P
. & Lt; 0,01, coeficiente de correlación de Spearman
Restauración de Expresión DACH1 suprime el crecimiento del cáncer de esófago tanto
in vitro y en
in vivo
Para ver el efecto de
DACH1
sobre la proliferación celular CECA, KYSE510 y KYSE150 con células que expresan establemente
DACH1
o vector vacío fueron establecidos por transducción de lentivirus. La viabilidad celular y la formación de colonias se analizaron en
DACH1
células expresados de forma estable y el control no expresado. Re-expresión de
DACH1
inhibe la proliferación celular (
P
& lt; 0,01, Fig 3A.) Y la formación de colonias (
P
& lt; 0,05, Fig 3B). En estas líneas celulares. La función de
DACH1
en cáncer de esófago también se estudió en modelo de xenoinjerto de ratones (Fig. 3C). El tamaño del tumor fue menor en
DACH1
expresó KYSE510 células que en el control (104.23 ± 21.38 mm
3 vs 494.65 ± 81.98 mm
3
P Hotel & lt; 0,01, Fig . 3D), y el peso del tumor fue menor en
DACH1
expresó KYSE510 células que en el grupo control (78 ± 28 mg vs 182 ± 37 mg,
P
. & lt; 0,01, figura 3E ). La expresión de DACH1 fue validado por IHC en xenoinjerto (Fig. 3F). Estos resultados sugieren que
DACH1
suprime el crecimiento del cáncer de esófago tanto
in vitro
y
in vivo
.
(A) Curvas de crecimiento representan CCK-8 Ensayo resultados de
DACH1
células expresadas y no expresadas, cells.Points media de cuatro experimentos independientes; bares, SEM. **,
P Hotel & lt; 0,01,
t de Student
. (B) Los resultados representativos de la formación de colonias en
DACH1
expresada y no expresada KYSE510 y líneas celulares KYSE150. Columnas, con una media de cuatro experimentos independientes; bares, SEM. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente a los controles mediante el uso de
t
test de Student. (C) Los representantes de los resultados de los xenoinjertos de tumores en ratones desnudos para células KYSE510
DACH1
ha expresadas y no expresadas. curvas (D) de crecimiento representan el tamaño del tumor en
DACH1
los ratones y las células expresadas KYSE510 no expresadas xenoinjertos en el tiempo diferentes. Puntos, con una media de 5 ratones; . Bares, SEM *,
P Hotel & lt; 0,01,
t de Student
. (E) Los resultados representativos del peso del tumor en
DACH1
los ratones y las células expresadas KYSE510 no expresadas xenoinjertos en el tiempo diferentes. Columnas, con una media de 5 ratones; bares, SEM. *,
P Hotel & lt; 0,01,
t de Student
. (F) su Representante DACH1 expresión resultados detectados por IHC para
DACH1
xenoinjerto expresada y células KYSE510 no expresadas. DACH1 expresión se encontró en
DACH1
expresó KYSE510 xenotrasplante de células. (derecho). Ampliación: fase superior, X200; fase inferior, X400.
Restauración de DACH1 Expresión Mayor G
1 Fase Reducido células fase S
El efecto de
DACH1
el ciclo celular fue analizadas por citometría de flujo en las líneas celulares KYSE510 y KYSE150. Como se muestra en la figura 4A, la proporción de células en fase G1 fue 51.05 ± 2.28% y 38.56 ± 1.64% en
DACH1
líneas celulares KYSE510 no expresadas expresada y (
P Hotel & lt; 0,05). La proporción de la fase S fue 25.72 ± 0.99% y 37.09 ± 1.49% en
DACH1
líneas celulares KYSE510 no expresadas expresada y (
P Hotel & lt; 0,05). La proporción de células en fase G1 fue 65,46 ± 2,84% y 44,41 ± 2,87% en
DACH1
líneas celulares KYSE150 expresadas y no expresadas (
P Hotel & lt; 0,05). La relación de la fase S fue 12,34 ± 0,10% y 32,06 ± 1,32% en
DACH1
líneas celulares KYSE150 no expresadas expresada y (
P
& lt; 0,01). Estos resultados sugieren que
DACH1
aumenta la fase G1 y la reducción de células en fase S en el cáncer de esófago
(A) La citometría de flujo resultados muestran:. La distribución de fase celular en DACH1 no expresada y expresaron KYSE510 y KYSE150 células . Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SEM. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01,
t de Student
. (B) Western blot resultados muestran: expresión de G1 /S punto de control de genes en DACH1 no expresada relacionado y expresó KYSE510 y KYSE150 células, β-actina se utilizó como control de carga
El aumento de expresión de CDK2. , CDK 4, cyclinD1 y cyclinE1 por lo general representa la promoción del ciclo celular de la fase G1 a la fase S. Como se muestra en la figura 4B, la expresión de CDK2, CDK 4, cyclinD1 y cyclinE1 se redujeron al parecer en
DACH1
expresó KYSE510 y KYSE150 células en comparación con las células no expresadas. Se sugiere que
DACH1
suprime la proliferación celular mediante la inhibición de G
1 /S de control en el cáncer de esófago. El efecto de
DACH1
sobre la apoptosis celular también se analizó mediante citometría de flujo en las líneas celulares KYSE510 y KYSE150, pero ningún cambio apoptosis se encontró antes y después de la restauración de
DACH1
expresión en estas dos líneas celulares (datos no mostrados).
Restauración de DACH1 Expresión activa la señalización de TGF-β en CECA
Nuestro estudio anterior encontró que los
DACH1
realizó efecto anti-proliferación mediante la activación de TGF β señalización y la inhibición de la expresión de c-Myc en líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano. [13] Para determinar si la señalización de TGF-β está regulado por
DACH1
en CECA, se empleó ensayo indicador de luciferasa dual para examinar la actividad luciferasa SBE4 en líneas celulares y KYSE510 KYSE150. Como se muestra en la figura 5A, la actividad del promotor SBE4 se incrementó más de 3 veces en la KYSE510 y 2,6 veces en KYSE150 células después de la restauración de
DACH1
expresión, y la actividad se aumentó de una manera dependiente de la dosis por la restauración de
DACH1
expresión combinada con el tratamiento de TGF-β1. Para entender aún más el mecanismo de
DACH1
en la señalización de TGF-β, el nivel de Smad2 fosforilados (p-Smad2) y Smad3 fosforilada (p-Smad3), y sus objetivos de abajo, se evaluaron p21 y c-Myc en
DACH1
líneas celulares KYSE510 y KYSE150 no expresadas y manifestadas. El nivel de p-Smad2 no se cambió antes y después de la re-expresión de
DACH1
, mientras que el nivel de p-Smad3 se incrementó después de la re-expresión de
DACH1
. El nivel de p-Smad2 y Smad3 p-se incrementaron después de la adición de TGF-β1. p-Smad3 se incrementó al parecer, cuando se añade TGF-β1 a
DACH1
KYSE510 re-expresada y KYSE150 células. La expresión de genes aguas abajo eran diferentes. p21 fue hasta reguladas y c-Myc se redujo reguladas después de la re-expresión de
DACH1 gratis (Fig. 5B). Se sugiere que la señalización de TGF-β se activa por
DACH1
y TGF-β1 aumenta este efecto. A fin de validar el efecto de
DACH1
en la señalización de TGF-β, se empleó la técnica de siRNA desmontables. El nivel de p-Smad2 no cambió después de eliminar a
DACH1 Hoteles en
DACH1
expresó KYSE140 células, pero el nivel de p-Smad3 se redujo cuando derribando
DACH1
. Ambos p-Smad2 y Smad3-p se incrementaron después de la adición de TGF-β1. p-Smad3 se incrementó ligeramente mediante la adición de TGF-β1 de siRNA transfectadas KYSE140 células en comparación con sólo derribando
DACH1
. p21 reducida y el aumento de la expresión de c-Myc se encontraron después de eliminar a
DACH1 Hoteles en KYSE140 células (Fig. 5C y 5D). Los resultados anteriores sugieren, además, que la señalización de TGF-β se activa por
DACH1 Hoteles en cáncer de esófago humano.
(a) Elementos Smad vinculantes (SBE) -4 actividades Luc reportero en KYSE510 y KYSE150 células . Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, SEM. (B) El nivel de expresión de TGF-β señalización genes abajo en
DACH1
células expresadas y las células no expresado, β-actina se utilizó como control de carga. (C) La eficiencia de siRNAs dirigidos en
DACH1 Hoteles en KYSE140 células. (D) El nivel de expresión de TGF-β señalización genes abajo en
DACH1
-siRNA KYSE140 células y control de grupo, β-actina se utilizó como control de carga.
Discusión
La expresión de DACH1 se redujo en mama, próstata, pulmón, endometrio, colorrectal y carcinoma hepatocelular, pero se incrementó en el cáncer de ovario. [7] - [13], [21] la expresión DACH1 estaba regulada por el promotor hipermetilación en la región de endometrio, colorrectal y carcinoma hepatocelular. [11] - [13] En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión DACH1 se redujo y la expresión de DACH1 estaba regulado por región del promotor hipermetilación en el cáncer de esófago humano. Habíamos informado de que muchos supresores tumorales fueron metilado con una tendencia progresión durante la carcinogénesis de esófago. [15], [16], [22], [23] En este estudio, se analizó el estado de metilación de
DACH1
en la mucosa normal del esófago, diferentes grados de displasia y cáncer invasivo.
DACH1
fue frecuentemente metilado en el cáncer de esófago y la frecuencia se incrementó con la progresión de la carcinogénesis de esófago de la mucosa esofágica normal al cáncer invasivo. Se sugiere que
DACH1
es un marcador de detección precoz del cáncer de esófago. La asociación de la mala diferenciación y el estadio tumoral con fines de
DACH1
sugiere que la metilación
DACH1
metilación puede servir como marcador pronóstico del cáncer de esófago.
DACH1
se considerado como un supresor de tumor o un oncogen en diferentes tipos de cáncer. [7] - [13], [21] En nuestro estudio,
fue encontrado DACH1
para suprimir el crecimiento del cáncer de esófago tanto
in vitro
y
in vivo
. La superfamilia TGF-β es un conjunto de citoquinas multifuncionales que regulan el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, la migración y la angiogénesis. [24] - [27] En las células epiteliales normales, la señalización de TGF-β implica en la activación transcripcional de la p21Cip1 inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, y la represión de la promotora del crecimiento factor de transcripción c-Myc. Cooperativamente, estas respuestas de genes median la detención del ciclo celular en la fase G1. [28] - [30] señalización de TGF-β juega un papel crítico pero paradoja en diferentes tipos de cáncer [31] - [33]. En el cáncer de mama, la señalización de TGF-β suprime el crecimiento celular en la etapa temprana y promover la invasión del cáncer en la etapa tardía. [34] Estudio previo de cáncer de mama mostró que DACH1 inhibido TGF-β señalización a través de Smad4 vinculante. [20] Mientras que en el cáncer hepatocelular, encontramos DACH1 activa la señalización de TGF-β mediante el aumento de p-Smad3. Se mejora la represión de la expresión de c-Myc y la proliferación celular. [13].
En apoyo de informe previo que DACH1 indujo la abundancia de proteínas p21 y antagoniza Myc inducida fenotipo oncogénico en el cáncer de mama [35], encontramos aquí que la expresión ectópica de DACH1 solo en las células de cáncer de esófago aumentó p21 y la disminución de c-Myc nivel de proteína (Fig. 5B). Por otra parte, DACH1 sinergizada con TGF-β para mejorar la inducción de p21 y la represión de c-Myc; correspondientemente, derribando DACH1 suprime la señalización de TGF-β en células KYSE140. la señalización de TGF-β puede diafonía con muchas otras vías. p53 y Smads interactuaron física y sinérgica coregulated TGF-β genes diana tales como p21 y p15. [36] Los estudios recientes demostraron que DACH1 asocia con p53 y la función de p53 mejorada para inducir la apoptosis e inhibir el crecimiento del tumor. Estudios posteriores mostraron que DACH1 compartida ocupación de -15% de genes p53-atado en la secuenciación del chip. [7], [9] Como DACH1 activa TGF-β de señalización (Fig. 5A) y la fosforilación inducida de Smad2 /3 (Fig. 5B), una posible explicación es la activación y estabilización de complejo de proteínas Smad2 /3 por DACH1 como p53 . Sin embargo, el mecanismo de detalle necesita ser probado.
En conclusión,
DACH1
está metilado con frecuencia en el cáncer de esófago humano y la metilación de
DACH1
está involucrado en la etapa temprana de esófago carcinogénesis. DACH1 expresión está regulada por la región del promotor hipermetilación.
DACH1
suprime el crecimiento de cáncer de esófago mediante la activación de la señalización de TGF-β.
Reconocimientos
Gracias Dr. Cvekl para proporcionar vectores de expresión DACH1.