Extracto
La proteína tirosina quinasa-7 (PTK7) es una tirosina quinasa del receptor catalíticamente inactiva (RTK). PTK7 está regulada positivamente en muchos cánceres humanos comunes, como el cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico y la leucemia mieloide aguda. La razón de esta regulación no se conoce todavía. Para explorar el papel funcional de PTK7, la expresión de PTK7 en células HCT 116 se examinó el uso de pequeña interferencia (siRNA) mediada por silenciamiento génico. Después de la transfección, el siRNA suprimido con éxito PTK7 ARNm y la expresión de proteínas. El derribo de PTK7 en células HCT 116 inhibió la proliferación celular en comparación con grupos de control y la apoptosis inducida. Además, esta apoptosis se caracteriza por la disminución potencial de membrana mitocondrial y la activación de la caspasa-9 y -10. La adición de un inhibidor de la caspasa-10 totalmente bloqueado esta apoptosis, lo que sugiere que la caspasa-10 puede jugar un papel crítico en la apoptosis inducida por PTK7-desmontables, aguas abajo de la mitocondria. Estas observaciones pueden indicar un papel para PTK7 en la proliferación celular y la apoptosis de las células y pueden proporcionar una vía potencial terapéutico para el tratamiento de una variedad de cánceres
Visto:. Meng L, Sefah K, O'Donoghue MB, Zhu G, Shangguan D, Noorali A, et al. (2010) El silenciamiento de PTK7 en células de cáncer de colon: la caspasa-10 dependiente de la apoptosis a través mitocondrial Camino. PLoS ONE 5 (11): e14018. doi: 10.1371 /journal.pone.0014018
Editor: Zhongjun Zhou, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 de julio de 2010; Aceptado: 28 Octubre 2010; Publicado: 16 de noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH), la Agencia#R01GM066137 (http://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las tirosina quinasas receptoras (RTK) componen una clase de proteínas de señalización transmembrana que transmiten señales extracelulares en el interior de la célula. Regulación deficiente de las RTK juega un papel importante en el desarrollo y /o progresión de muchas formas de cáncer [1]. La proteína tirosina quinasa-7 (PTK7), que también se conoce como carcinoma de colon quinasa-4 (CCK4), es un miembro relativamente nuevo y estudiado poco de la superfamilia RTK. Contiene un dominio extracelular con siete bucles similares a inmunoglobulina, un dominio transmembrana, y un dominio tirosina quinasa catalíticamente inactiva [2], [3]. Sin embargo, como resultado de una sustitución de aminoácidos dentro del dominio catalítico, es un PTK7 pseudokinase sin actividad de tirosina quinasa catalítica detectable [1], [4]. Se identificó originalmente como una línea celular de cáncer de colon derivada de gen expresado, pero no se expresa en tejidos adultos de colon humano [2]. Por el contrario, altos niveles de expresión PTK7 se observan en los dos puntos de ratón fetal [1], [2], [4]. La expresión de PTK7 es de hasta regulado en muchos cánceres humanos comunes, incluyendo cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer gástrico y la leucemia mieloide aguda [2], [5], [6], [7], [8], [9] . Recientemente, PTK7 fue identificado como un nuevo regulador de la polaridad WNT o plana de células no canónica (PCP) de señalización [10], [11]. PTK7 también parece desempeñar un papel importante en la formación del tubo, la migración, invasión de endotelios y la angiogénesis en las células HUVEC [12]. Sin embargo, el papel funcional de PTK7 en la proliferación celular y la apoptosis aún no está claro.
Muerte celular
Aptotosis está programado, típicamente mediada por una familia de cisteína proteasas conocidas como caspasas [13]. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas, ya sea con un largo (caspasa-8, -9 y -10) o un corto (caspasa-3, -6 y -7) prodominio [14], [15]. Estas últimas proteasas escinden una serie de proteínas intracelulares esenciales que conducen a la muerte celular [16].
dos principales vías de la apoptosis han sido identificados. La vía intrínseca (vía de las mitocondrias) implica una disminución en el potencial de membrana mitocondrial y liberación de citocromo
c
[17], que activa la caspasa-9 a través de la apoptosome. Entonces, la caspasa-9 inicia una cascada de caspasas proteolítica que mata las células. La vía extrínseca (vía del receptor de muerte) implica la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). En respuesta a la unión de TNF ligando, estos receptores de membrana reclutan y activan moléculas adaptadoras caspasa-8 en la induce a la muerte complejo de señalización (DISC). Caspasa-8 activa, ya sea directamente las caspasas efectoras posteriores, como la caspasa-3, o se conecta a través de la vía intrínseca escisión de BCL-2 dominio de interacción (BID) a hacer una oferta truncado (tBid) [18].
el gen de la caspasa-10 está unido al gen de la caspasa-8 en el locus del cromosoma humano 2q33-34 [19]. Sin embargo, las funciones fisiológicas de la caspasa-10 siguen siendo poco conocidos, aunque se cree que desempeñan un papel en la vía del receptor de muerte. También se informó de la caspasa-10 para ser activado aguas abajo de las mitocondrias en la apoptosis inducida por fármacos citotóxicos de las células tumorales [20]. Adquiridos inactivación de las mutaciones de la caspasa-10 se han identificado en células tumorales de pacientes con tumores sólidos [21], [22], [23]. Recientemente, se demostró la caspasa-10 a desempeñar un papel en la apoptosis inducida por paclitaxel, un fármaco contra el cáncer, a través de una proteína asociada a Fas con el dominio de muerte (FADD) mecanismo dependiente de [24].
El término interferencia de ARN (RNAi) fue utilizado por primera vez por el fuego
et al.
[25] en su trabajo sobre
Caenorhabditis elegans
. RNAi es un mecanismo celular por el cual los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) (19-23 nucleótidos de longitud) provocan la degradación de ARNm específico [25], [26]. Se ha demostrado que siRNAs pueden silenciar la expresión de genes afines a través de la vía de RNAi en células de mamífero [27]. Las propiedades de RNAi, incluyendo especificidad de la diana del gen estrictas y la simplicidad de diseño y ensayo [28], se han ampliado en gran medida su potencial para estudios mecanísticos de las proteínas, así como para los enfoques terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, incluyendo el cáncer [29], [30 ].
en este estudio, se utilizó un siRNA dirigidos mRNA PTK7 humano para la inhibición máxima de la expresión PTK7 con el fin de investigar el papel de PTK7 en la apoptosis y la proliferación. El derribo de PTK7 en células HCT 116 inhibió la proliferación celular y la apoptosis inducida. Además, esta apoptosis se caracteriza por la disminución potencial de membrana mitocondrial y la activación de la caspasa-9 y -10. La adición de un inhibidor de la caspasa-10 totalmente bloqueado esta apoptosis, lo que sugiere que la caspasa-10 puede jugar un papel crítico en la apoptosis inducida por PTK7-desmontables aguas abajo de la mitocondria. Por lo tanto, estas observaciones pueden indicar un papel para PTK7 en la proliferación celular y la apoptosis de las células
Materiales y Métodos
Materiales
medios de McCoy 5A se adquirieron de ATCC.; suero bovino fetal (FBS) (inactivado por calor) se adquirió de GIBCO, y penicilina-estreptomicina se adquirió de Cellgro. Micro-FastTrack Kit 2.0 se adquirió de Invitrogen. Un kit colorimétrico bromodesoxiuridina (BrdU) era de BD Pharmingen. IScript One-Step RT-PCR Kit con SYBR Green era de Biorad. cóctel inhibidor de proteasa (mezcla de 4- (2-aminoetil) fluoruro de bencenosulfonilo (AEBSF), E-64, bestatina, leupeptina, aprotinina, y sodio EDTA) de tripano y 0,4% de azul fueron de Sigma. El kit de ensayo de proteína era de Bio-Rad. Los anticuerpos contra la caspasa-9 y β-actina fueron de Señalización Celular Tecnología. Anticuerpo contra la caspasa-10 era de Millipore. Anticuerpo contra PTK7 era de Abnova. De cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP de anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo anticuerpo secundario conjugado con HRP se adquirieron de Cell Signaling Technology. La apoptosis Vybrant Kit de Ensayo#2, 4 × tampón NuPAGE LDS muestra, 4-12% de geles NuPAGE Bis-Tris, tampón de ejecución 20 × MOPS NuPAGE SDS y tampón de transferencia NuPAGE 20 × eran de Invitrogen. membrana de transferencia Immobilon-P fue de Millipore. SuperSignal West Dura sustrato extendido-Duración y restauración más tampón de transferencia Western desprendimiento eran de Thermo Scientific. películas de rayos X eran de ISCBioExpress. JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-yoduro tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine) se adquirió de Anaspec. Caspasa-9 inhibidor (Z-LEHD-FMK), inhibidor de la caspasa-3 (Z-DEVD-FMK), inhibidor de la caspasa-8 (Z-IETD-FMK), inhibidor de la caspasa-familia (Z-VAD-FMK), caspasa 1 inhibidor (Z-YVAD-FMK), caspasa-10 inhibidor (Z-AEVD-FMK) y la caspasa-2 inhibidor (Z-VDVAD-FMK) fueron adquiridos de BioVision. Caspasa-10 fluorométrico proteasa Kit de ensayo era de Millipore.
Cell Cultura y
HCT 116 se obtuvieron células (carcinoma de colon) de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células HCT 116 p53 nula fueron proporcionados por el Dr. Bert Vogelstein (El Centro Johns Hopkins Kimmel Cancer). Las células se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (inactivado por calor) y 100 IU /ml de penicilina-estreptomicina.
ARN de interferencia
HiPerFect reactivo de transfección, HP- Validado siRNA específico para PTK7, llamado PTK7 siRNA (sentido: 5'-CGGGATGATGTCACTGGAGAA-3 '), y un siRNA no específicos (de AllStars negativo siRNA control) fueron adquiridos de Qiagen. Las células HCT 116 fueron transfectadas con siRNA por el reactivo de transfección HiPerFect. En el día 1, se recogieron las células en fase de crecimiento exponencial y se suspendieron en medio de crecimiento. Las células se dividieron en cuatro grupos y se trataron con PTK7 siRNA, un siRNA no específica como control negativo, vehículo HiPerFect solamente, o se dejaron sin tratar. Para cada transfección, una suspensión de células 500 l se transfectó con 25 nM de ARNsi utilizando reactivo de transfección 4 l en placas de 24 pocillos. Las células se mantienen en condiciones normales de cultivo y se recogieron 2, 3 o 4 días después de la transfección para el análisis.
citometría de flujo Análisis
Después de la transfección con ARNip como se ha descrito anteriormente, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces en PBS, y se contaron usando un hemocitómetro. Partes alícuotas de 5 × 10
5 células se incubaron con un exceso de phycoerythring (PE) marcado con anti-PTK7 en 200 l de tampón de unión (PBS que contiene 5 mM MgCl
2, 4,5 mg /ml de glucosa, 0,1 mg /mL tRNA de levadura, 1 mg /ml de BSA y 20% de FBS) en hielo durante 30 min. Las células fueron lavadas dos veces con 1 ml de tampón de unión y se suspendieron en 0,3 ml de tampón de unión. La fluorescencia se determinó con un citómetro FACScan (Becton Dickinson Sistemas Immunocytometry, San Jose, CA). Marcado con PE anti-IgG se utilizó como control negativo.
RT-PCR cuantitativa
mRNA total a partir de células tratadas con diferentes siRNAs se extrajo con Micro-FastTrack Kit 2.0 de acuerdo con las instrucciones del fabricante . PCR en tiempo real se realizó en el ARNm (50 ng) con iScript One-Step Kit RT-PCR utilizando SYBR Green con un Biorad iCycler. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de 50 l por triplicado. Los cebadores para PTK7 humano fueron adquiridos de Qiagen (QT00015568). parámetros de PCR fueron las siguientes: 50 ° C durante 30 min, 5 min de la activación de Taq a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de PCR: 95 ° C x 30 s, 57 ° C x 60 s, y 72 ° C x 60 s. La cantidad relativa de ARNm diana se normalizó a GAPDH ARNm. La especificidad fue verificada por análisis de curvas de fusión. Los medios y los errores estándar de al menos tres repeticiones de cada experimento se calculan. La significancia se determinó mediante la prueba t, p value≤0.05 indicado por un asterisco.
Detección de número de celular por exclusión de azul de tripano Ensayo
Durante cuatro días después del tratamiento, se prepararon suspensiones de células por tripsinización, y las células se resuspendieron en 1 ml de medio. Para 25 l de la suspensión de células, 25 l de 0,4% se añadió azul de tripano, y las células se contaron usando un hemocitómetro.
Ensayo de proliferación de
La proliferación celular se estudió usando un bromodesoxiuridina colorimétrico (BrdU ) kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primero, las células fueron transfectadas con siRNA. Después de 48 h de tratamiento, se añadió 10 mM solución de BrdU al medio. El medio se desechó después de 2 h, y las células se fijaron y permeabilizaron con BD Cytofix /Cytoperm Buffer de 30 min a temperatura ambiente. Después de la eliminación de Cytofix /Cytoperm Buffer, las células se incubaron con 100 l de DNasa diluido (diluido a 300 g /ml en PBS) durante 1 hora a 37 ° C para exponer incorporado BrdU. Las células se resuspendieron luego en 50 l de adición de diluido BD Perm /Wash Buffer marcado con FITC anti-BrdU y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las células se incubaron con 20 l de la solución de 7-AAD. Las muestras se analizaron por citometría de flujo. Se calcularon las medias y los errores estándar de al menos tres repeticiones de cada experimento. La significancia se determinó mediante la prueba t; ap value≤0.05 se indica mediante un asterisco.
anexina V /yoduro de propidio doble tinción Ensayo
anexina V /yoduro de propidio (PI) de doble tinción se realizó usando el Vybrant Apoptosis Ensayo Invitrogen kit#2. Las células se lavaron dos veces en tampón PBS enfriado con hielo y se centrifugaron a 900 rpm durante 3 min. Los pellets se resuspendieron en tampón de unión a una densidad de 10
6 células /ml. Una solución de la muestra (100 l) era doble teñidas con 5 l Anexina V /Alexa Fluor 488 y 2 l 100 mg /ml PI. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 min, se añadió 400 l de tampón de unión, y las células se analizaron por citometría de flujo.
Los análisis Western Blot
Después de HCT se transfectaron 116 células con siRNA para PTK7 12 h, 24 h, 30 h, y 48 h, las células enteras se recogieron y se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Luego, las células se lisaron en tampón de radioinmunoprecipitación (NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, y EDTA 2 mM) en presencia de proteinasa cóctel de inhibidores durante 20 min en hielo. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 min a 4 ° C, y el contenido de proteína en el sobrenadante se midió usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad. Cincuenta microgramos de proteínas del sobrenadante se mezclaron con 4 x tampón de muestra NuPAGE LDS y se calentó a 70 ° C durante 10 min. Las proteínas se separaron en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris con 1 × NuPAGE MOPS SDS funcionamiento de amortiguación y luego electrotransferred a una membrana de transferencia de PVDF con tampón de transferencia NuPAGE al 50 V durante 1 h. Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% en tampón PBS que contiene 0,2% de Tween 20 (PBST) durante 2 h a temperatura ambiente. Las membranas se probaron con anticuerpos primarios en PBST que contiene leche en polvo desnatada al 5% durante la noche a 4 ° C. Después de tres lavados sucesivos con PBST para 10 min, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón o anticuerpo IgG anti-conejo de cabra en PBST que contenía leche en polvo desnatada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados sucesivos con PBST para 10 min, las señales de las proteínas se desarrollaron con un kit de Duración de sustrato SuperSignal West Dura Extended y se transfieren desde la membrana a películas de rayos X. La carga de proteína se normalizó mediante el sondeo de la misma membrana con el anticuerpo anti-actina. Para la detección de β-actina, las membranas utilizadas anteriormente se empaparon en Restaurar Plus Western Blot Stripping Buffer a temperatura ambiente durante 30 min y se hibridaron con la actina anti-β.
Medición de la membrana mitocondrial Potencial
Tinte se utilizó JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-yoduro tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine) para determinar potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m), la pérdida de las cuales se considera como un paso crucial en la vía de la apoptosis. HCT 116 células fueron transfectadas con siRNA durante 48 h o 72 h, después de lo cual las células se lavaron con PBS frío y se tiñeron mediante la incubación con 2 M de JC-1 durante 20 min a 37 ° C. A continuación, el potencial de membrana mitocondrial se detectó mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo a 590 nm.
caspasa-10 de medición de actividad
Actividad de la caspasa-10 se midió usando el kit de la caspasa-10 Fluorometic Ensayo de Proteasa . Brevemente, las células fueron transfectadas con siRNA PTK7, y después se cosecharon 24 h o 48 h las células. Dos millones de células se resuspendieron en tampón de lisis frío y se incubaron en hielo durante 10 min. Después, se añadieron 50 l de 2 × tampón de reacción y 5 l de la 1 mM sustrato AEVD-AFC (50 mM de concentración final) a cada muestra. Después de incubación a 37 ° C durante 2 h, las muestras se analizaron utilizando un lector de microplacas equipado con un filtro de excitación 400 nm y un filtro de emisión de 505 nm. Se calcularon las medias y los errores estándar de al menos tres repeticiones de cada experimento. La significancia se determinó mediante la prueba t, p value≤0.05 se indica mediante un asterisco.
Resultados
La inhibición de la expresión PTK7 por PTK7 siRNA
La expresión de PTK7 en HCT 116 , células de carcinoma de colon humano, se investigó mediante citometría de flujo (Fig. 1A, sin tratar) y Western blot (Fig. 1B, 0 h). La comparación de la señal de fluorescencia de marcado con PE anti-PTK7 a marcado con PE anti-IgG de ratón muestra claramente que PTK7 se expresa en células HCT 116.
(A) La citometría de flujo ensayo para la unión del marcado con PE anti-PTK7 con células HCT 116 (curvas grises). Las curvas negras representan la unión de anti-IgG-PE fondo. La concentración del anticuerpo en el tampón de unión era 2 g /l. (B) Análisis de transferencia Western de PTK7 en las células HCT 116 transfectadas por PTK7 siRNAs. La membrana se desnudó y se volvió a sondear por el anticuerpo β-actina como control de carga. (C) La supresión de la expresión de mRNA en PTK7 HCT 116 células por PTK7 siRNAs. Las células se recogieron después de 48 h de tratamiento. RT-PCR se realizó usando cebadores específicos de genes. La cantidad de expresión de mRNA PTK7 se normalizó con el grupo no tratado. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student:. P & lt; 0,05
La expresión de PTK7 fue derribado usando orientada PTK7 siRNA y la citometría de flujo resultados para las células diana fueron comparados con aquellos expuestos al único vehículo, siRNA inespecífico o sin tratar, como se muestra en la Fig. 1A. Después de 48 horas, el pico de anti-PTK7-EP en HCT 116 transfectadas con PTK7 siRNA se movió de nuevo a la cima de la proteína de control de fondo, anti-IgG-PE, lo que indica que el nivel de expresión PTK7 en HCT 116 células transfectadas con PTK7 siRNA disminuido en gran medida. Al mismo tiempo, no hubo cambio correspondiente en el ARNsi de control o los grupos tratados con vehículo, lo que indica que ni el reactivo de transfección HiPerFect ni la expresión PTK7 siRNA no específica afectada. Cuando la expresión PTK7 se probaron después de 12 h, 24 h, 30 h y 48 h de la transfección mediante Western blot (Fig. 1B), los resultados mostraron claramente que el nivel de expresión PTK7 disminuyó después de 48 h de la transfección. Además, el ARNm total se extrajo de los no tratados, vehículo, siRNA no específica, y los grupos PTK7 siRNA. Como se muestra en la Fig. 1C, PTK7 siRNA inducida por la reducción del 75-80% de PTK7 mRNA en células HCT 116. Estos resultados indicaron que tanto la proteína PTK7 y los niveles de expresión de mRNA se redujeron en gran medida por PTK7 siRNA. Esto demostró la función y la eficiencia de PTK7 siRNA y proporciona una base sólida para nuestro estudio del papel funcional de PTK7.
células HCT 116 siRNA tratada con la viabilidad y la proliferación de PTK7
El efecto de la supresión PTK7 en la viabilidad de las células HCT 116 se investigó contando el número total de células vivas cada día después de la transfección. Como se muestra en la Fig. 2A, el número de células HCT 116 en vivo transfectadas con siRNA PTK7 se demostró que era significativamente diferente de la de los grupos no tratados en el día 4. Este hallazgo demostró una inhibición significativa de la viabilidad celular en las células HCT 116 tratados con PTK7 siRNA. Para confirmar que la disminución de la viabilidad celular resultó de supresión de PTK7, los mismos ensayos se realizaron con células HCT 116 transfectadas con siRNA no específica o tratados sólo con vehículo. Los resultados mostraron que la muestra tratada con siRNA PTK7 contenía el menor número de células. Aunque las células tratadas con siRNA inespecífico tratado con vehículo y tenían el número de células más pequeñas que las células no tratadas, hubo un número significativamente menor número de células en la muestra tratada con siRNA PTK7.
Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. (A) Se contó el número de células vivas al día durante 4 días utilizando azul tripán. (B) la incorporación de BrdU en relación con las células no tratadas detectadas por citometría de flujo. Las células se incubaron con 10 M BrdU durante 2 h después de 48 h de tratamiento. La cantidad de incorporación de BrdU se normalizó con el grupo no tratado. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student: p & lt; 0,05. (C) la aparición de apoptosis en células HCT 116 detectados por tinción con anexina V /PI en los días 1-4 después de la transfección. Las células se tiñeron negativo tanto para anexina V y PI fueron considerados sanos.
Para determinar el efecto de la supresión de PTK7 sobre la proliferación celular HCT 116, un experimento de incorporación de BrdU se realizó para medir la síntesis de ADN. Después de 48 h de transfección, las células se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos y se incubaron con 10 mM de BrdU durante 2 h. Las células fueron fijadas, y se detectó la incorporación de BrdU usando un anticuerpo anti-BrdU marcado con FITC (Fig. 2B). El silenciamiento de PTK7 inhibió significativamente la incorporación de BrdU en las células HCT 116, lo que sugiere un efecto directo de la proteína PTK7 sobre la proliferación de células HCT 116.
Aumento de la apoptosis de siRNA tratada con PTK7 células HCT 116
Un Anexina V /PI tinción experimento se llevó a cabo para estudiar la posibilidad de que la anulación de PTK7 podría afectar a la apoptosis de las células HCT 116. La fosfatidilserina (PS) está situado en la cara interna de la membrana celular en las células sanas. Durante la apoptosis, la PS se convierte transloca a la superficie exterior de la membrana celular, y el ensayo de Anexina V /PI detecta la PS en la superficie exterior. Los resultados en la Figura 2C muestran que el grupo PTK7 siRNA mostró aumento significativo de las células apoptóticas en el día 4 en comparación con no tratados, el vehículo y los grupos de control siRNA no específicos.
Los cambios en el potencial de membrana mitocondrial y la activación de la caspasa-9 en HCT 116 células tratadas con PTK7 siRNA
Para estudiar el mecanismo a través del cual derribando PTK7 induce la apoptosis en las células HCT 116, el efecto de derribar PTK7 en potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m) se determinó por fluorescencia microscopía (Fig. 3A) y citometría de flujo (Fig. 3B). Tinte JC-1 se utilizó como indicador. En las células sanas, las mitocondrias polarizadas tienen una carga negativa, que permite JC-1 tinte con carga positiva deslocalizada para entrar en la matriz mitocondrial y acumularse allí. Cuando se supera la concentración crítica, JC-1 forma J-agregados, y las células se vuelven de color rojo fluorescente (FL2). En las células apoptóticas, el potencial de membrana mitocondrial se colapsa, y JC-1 no se puede acumular dentro de las mitocondrias. En estas células apoptóticas, JC-1 permanece en el citoplasma en una forma monomérica fluorescente verde (FL1). Después de las células HCT 116 fueron transfectadas con siRNA o control tal como se describe anteriormente y se incubaron durante 48 h o 72 h, la disminución de ΔΨ
se observó M en células HCT 116 transfectadas con PTK7 siRNA. Después de 72 h de la transfección, el porcentaje de células con mitocondrias polarizada fue del 90%, 87% y 88% para las células en los no tratados, el vehículo y los grupos de siRNA no específicos, respectivamente. Sin embargo, sólo el 35% de las células totales en el grupo PTK7 siRNA tenía mitocondrias polarizadas. Esta tendencia se observó incluso a las 48 h, cuando sólo 58% de las células habían polarizado mitocondrias. Estos datos sugieren que la disfunción mitocondrial estuvo involucrado en la apoptosis inducida por PTK7 caída.
(A) Fluorescencia de detección microscópica de potencial de membrana mitocondrial en las células HCT 116 tratados. (B) La citometría de flujo de detección de potencial de membrana mitocondrial en las células HCT 116 tratadas. (C) La activación de la caspasa-9 implicados en la apoptosis inducida por derribando PTK7. La membrana se desnudó y se volvió a sondear por el anticuerpo β-actina, como control de carga.
Una variedad de vías de señalización puede estar implicado en la apoptosis, y las mitocondrias desempeñan un papel importante. La disfunción mitocondrial provoca la liberación de citocromo
c
, que activa la caspasa-9, a su vez alimenta la apoptosis. La activación de caspasa-9 se detectó mediante transferencia Western después de las células HCT 116 fueron transfectadas con PTK7 siRNA y se cultivaron durante 12 h, 24 h, 30 h, y 48 h, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3C, se activó la caspasa-9 y participa en la apoptosis inducida por PTK7 caída.
Papel de la caspasa-10 en la apoptosis inducida por PTK7-desmontables
Para determinar si las caspasas median la apoptosis inducida por knock down de PTK7, las células se pretrataron con un inhibidor de pancaspase o uno de varios inhibidores de una sola caspasa-específicos. Rescate de las células de la apoptosis significaría que la caspasa inhibido estaba implicado en la muerte celular PTK7 deficientes. Después de pre-incubación de las células HCT 116 con 20 mM inhibidor pancaspase familiar a 37 ° C durante 3 h, las células fueron transfectadas con siRNA de 48 h. Después de la incubación durante 48 h, la viabilidad celular se ensayó usando Anexina V /PI (Fig. 4A). Las células pre-incubadas con el inhibidor de pancaspase familiar mostraron una buena viabilidad celular (80 ± 13%) después de la transfección con PTK7 siRNA, dentro de la incertidumbre de la viabilidad de las células del grupo de siRNA no específica (83 ± 7,5%). Mientras tanto, las células directamente transfectadas con siRNA PTK7 tenían significativamente menor viabilidad celular (36 ± 12%). inhibidor Pancaspase familiar bloqueó la actividad de caspasa y también bloqueó la apoptosis inducida por el derribo de PTK7, lo que indica que la apoptosis inducida por el derribo de PTK7 es dependiente de caspasas.
(A) la apoptosis inducida por derribar PTK7 era caspasa -dependiente. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student: p & lt; 0,05. (B) inhibidor de la caspasa-10 bloqueó por completo la apoptosis inducida por el derribo de PTK7. Datos: media ± S.D.. de tres experimentos independientes, * de la prueba t de Student: p & lt; 0,05
Para investigar qué caspasas desempeña el papel fundamental en este apoptosis, las células HCT 116 fueron tratadas previamente con un inhibidor de la caspasa-9 (Z. -LEHD-FMK), inhibidor de la caspasa-3 (Z-DEVD-FMK), inhibidor de la caspasa-8 (Z-IETD-FMK), inhibidor de la caspasa-familia (Z-VAD-FMK), caspasa-1 inhibidor (Z-YVAD -FMK), inhibidor de la caspasa-10 (Z-AEVD-FMK), caspasa-2 inhibidor (Z-VDVAD-FMK), o vehículo DMSO a 37 ° C durante 3 h, seguido de la transfección con PTK7 siRNA. Después de la incubación durante 48 h, la viabilidad celular se ensayó por Anexina V /PI usando citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 4B, la inhibición de la caspasa-10 bloqueó la apoptosis, con 79 ± 3% de células viables. Esto significaba que caspse-10 puede jugar un papel crítico en la ruta apoptótica inducida por el derribo de PTK7.
Para confirmar la activación de la caspasa-10 en la apoptosis inducida por PTK7 caída, la procaspasa-10 niveles de proteína en la célula lisados transfectadas con siRNA PTK7 se examinaron mediante Western blot (Fig. 5A). Procaspasa-10 disminuyó después de 12 h de la transfección y se incrementó después de 30 h de la transfección. Además, como la relación entre la vía intrínseca y la vía extrínseca, se investigó la escisión de la oferta a tBid, y no había obvio tBid, lo que indica que no hubo transferencia de la señal de la vía extrínseca de la vía intrínseca. En otro experimento, la expresión PTK7 en HCT 116 fue inicialmente suprimido usando PTK7 siRNA, lo que resulta en la apoptosis en estas células. La capacidad de los lisados celulares para escindir los sustratos peptídicos (Ac-AEVD-AFC) se ensayó como un indicador de la actividad de la caspasa-10. Los resultados de la Figura 5B muestran un aumento significativo en la actividad de la caspasa 10 en las células tratadas con siRNA. PTK7
(A) Western blot de la procaspasa-10 y la subasta en HCT 116 células transfectadas por PTK7 siRNAs. La membrana se desnudó y se volvió a sondear por el anticuerpo β-actina, como control de carga. (B) Actividad de la caspasa-10 en las células HCT 116: sin tratar y tratados con vehículo, siRNA no específica y siRNA. Los resultados se expresaron como proporciones de la actividad de la caspasa-10 en células no tratadas. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student:. P & lt; 0,05
apoptosis inducida por PTK7 desmontables-participación La proteína p53 en
La proteína p53 se ha demostrado como una proteína supresora de tumores en los seres humanos [31] , y HCT 116 células expresan de tipo amplia p53. [32], [33] con el fin de estudiar la implicación de p53 en la apoptosis inducida por PTK7 caída, se utilizó p53 nula HCT 116 como la segunda línea de células para llevar a cabo PTK7 desmontables y otros experimentos relacionados. En primer lugar, el nivel de expresión PTK7 sin /con tratamiento siRNA se controló por citometría de flujo (Fig. 6A). Las células HCT 116 p53 nula expresan una alta cantidad de PTK7 en la membrana celular, pero después de 48 horas de PTK7 siRNA transfección, el pico para el anti-PTK7-EP en p53 nula HCT 116 cambiaron de nuevo a la cima del control de fondo proteínas, anti-IgG-PE. Esto indicó que el nivel de expresión en las células PTK7 116 p53 nulo HCT transfectadas con siRNA PTK7 se redujo en gran medida. A continuación, se muestra el número de células vivas de p53 nulo HCT 116 transfectadas con PTK7 siRNA a ser significativamente diferente de la de los grupos no tratados en el día 4, lo que demuestra una inhibición significativa de la viabilidad celular en las células 116 de p53 nulo HCT por tratamiento con PTK7 siRNA (Fig. 6B). Y en un experimento de incorporación de BrdU, el silenciamiento de PTK7 inhibió significativamente la incorporación de BrdU en las células HCT 116 de p53 nulo, lo que sugiere un efecto directo de la proteína PTK7 sobre la proliferación celular (Fig. 6C). Por otra parte, el experimento de tinción con anexina V /PI mostró que el HCT p53 nulo tratado con siRNA PTK7 116 mostró aumento significativo de las células apoptóticas y muertas en día 4 en comparación con no tratados, el vehículo y los grupos de control siRNA no específicos.
(a) la citometría de flujo ensayo para la unión del marcado con PE anti-PTK7 con HCT 116 células p53 nulo (curvas grises). Las curvas negras representan la unión de anti-IgG-PE fondo. La concentración del anticuerpo en el tampón de unión era 2 g /l. (B) El número de células HCT 116 p53 nulo en vivo fue contado en el día 4 después del tratamiento con vehículo, siRNA inespecífico y PTK7 siRNA. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student: p & lt; 0,05. (C) incorporación de BrdU en relación con las células no tratadas detectadas por citometría de flujo. p53 nulo HCT 116 células se incubaron con 10 M BrdU durante 2 h después de 48 h de tratamiento. La cantidad de incorporación de BrdU se normalizó con el grupo no tratado. Los datos son la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. * T de Student: p & lt; 0,05. (D) La apoptosis ocurrencia en células HCT 116 p53 nula detectados por tinción con anexina V /PI en los días 4 después de la transfección. Las células se tiñeron negativo tanto para anexina V y PI fueron considerados sanos y porcentaje se muestran en la figura.
La apoptosis inducida por PTK7 caída ha demostrado ser dependiente de la caspasa-10 de tipo salvaje en HCT 116. por lo que la vía de la apoptosis en HCT-p53 nula 116 inducida por PTK7 caída se procedió a investigar. JC-1 experimento se controló tanto por microscopía de fluorescencia (Fig. 7A) y citometría de flujo (Fig. 7B). Claramente, el potencial de membrana mitocondrial disminuye en las células p53 nulo HCT 116 tratados con PTK7 siRNA. Al mismo tiempo, un experimento de inhibidor de caspasa se llevó a cabo utilizando células HCT 116 de p53 nulo. Como se muestra en la Fig.