Extracto
XB130 es una proteína adaptadora recientemente descrito que fue reportado para promover el crecimiento del tumor de tiroides, pero su papel en la progresión de otros tipos de cáncer, como el cáncer gástrico (CG) sigue siendo desconocido. De acuerdo con ello, se investigó la asociación entre la expresión XB130 y el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico. Los sujetos fueron 411 pacientes con cáncer gástrico en estadios I a IV. XB130 expresión fue examinado en especímenes quirúrgicos de GC. El análisis de Kaplan-Meier y el modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para evaluar la importancia pronóstica de XB130 para la supervivencia y la recurrencia. Además, se establecieron las células transfectadas de manera estable con GC XB130 ARN de horquilla corta para analizar el efecto de XB130 sobre la sensibilidad a la quimioterapia. Los resultados muestran que tanto XB130 mRNA y expresión de la proteína fueron detectables en los tejidos gástricos normales. El tiempo de supervivencia global de los pacientes en estadio IV y el periodo libre de enfermedad después de la resección radical de GC en pacientes en estadio I-III fueron significativamente más corto cuando la tinción inmunohistoquímica para XB130 fue baja que cuando tinción fue alta (ambos
p & lt
; 0,05). XB130 expresión también predijo la sensibilidad del tumor a varios agentes de quimioterapia. La viabilidad de las células tanto SGC7901 y células de tipo salvaje XB130-silenciado fue suprimida por 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino y el irinotecán en una forma dependiente de la dosis, pero cisplatino e irinotecán eran más sensibles frente a las células GC-silenciado sXB130 y 5-FU mostró una mayor sensibilidad a las células de tipo salvaje. Cuando se tratan con 5-FU, los pacientes con alta expresión de los tumores XB130 tenían una tasa de supervivencia mayor que aquellos con tumores de expresión bajos. Estos hallazgos indican que la reducción de la expresión de proteínas XB130 es un biomarcador pronóstico de supervivencia más corta y una mayor tasa de recurrencia en pacientes con GC, así como para la respuesta a la quimioterapia
Visto:. Shi M, Huang W, L Lin , Zheng D, Q Zuo, Wang L, et al. (2012) El silenciamiento de XB130 se asocia con el pronóstico y la quimiosensibilidad del cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (8): e41660. doi: 10.1371 /journal.pone.0041660
Editor: Zilong Wen, Universidad de Hong Kong de Ciencia y Tecnología, China
Recibido: Marzo 31, 2012; Aceptado: 24 Junio 2012; Publicado: 23 Agosto 2012
Copyright: © Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Proyectos de Investigación básica Key (2012CB945100, a WL y YL), el Programa de Selección de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, china (S2011030003134, a WL y YL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los oncogenes y anti-oncogenes tienen un papel vital en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico (CG), y la heterogeneidad genética se ha demostrado influir en el pronóstico notablemente. Por lo tanto, en busca de nuevos genes y proteínas con valor potencial como herramientas de diagnóstico o pronóstico es importante, y la orientación nuevos oncogenes es otro enfoque prometedor para la terapia del cáncer.
XB130 es una proteína adaptadora recientemente identificados que se expresa fuertemente en el bazo y la tiroides de los seres humanos, al tiempo que muestra la expresión débil en el riñón, cerebro, pulmón y páncreas [1]. XB130 se ha detectado en el carcinoma de tiroides folicular y papilar, así como en líneas celulares de carcinoma de pulmón humano [2]. Aunque su expresión se redujo en el carcinoma de tiroides, XB130 se encontró que era un promotor de tumores [2]. Se ha informado de que XB130 no sólo tiene un papel en la proliferación celular, la supervivencia, la motilidad y la invasión [2], [3], [4], pero también está implicado en la transducción de señales [1]. XB130 está regulada por Rac y por el citoesqueleto [3], y está implicado en la activación de c-Src [1] y la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) /Akt [4], que a su vez regulan la función del citoesqueleto [3]. Estas vías de señalización también se han demostrado tener un papel esencial en el desarrollo y progresión de GC [5], [6], [7]. Por lo tanto, podría ser un papel de XB130 en GC también. Sin embargo, ninguna investigación sobre este adaptador de proteínas recién descubierto se ha hecho en el campo de la gastroenterología hasta ahora. En este estudio, la hipótesis de que la expresión XB130 podría estar asociado con la supervivencia y /o la recurrencia del tumor, así como con la quimiosensibilidad de GC.
Resultados
XB130 expresión en tejidos normales gástricas y GC
a diferencia de los informes anteriores, se confirmó que XB130 se expresa constitutivamente en tejidos normales del hígado humano, colon, bazo y estómago (Figura 1a). La inmunohistoquímica se realizó para evaluar la expresión XB130 en sus 411 pares de secciones en parafina procedentes de GC y sus tejidos no tumorales adyacentes. Se encontró que XB130 se expresa predominantemente en el citoplasma en el tejido gástrico normal, mientras que se downregulated significativamente en los tejidos de GC. Hemos clasificado aún más los GCs en positivos (XB130 de alta expresión con puntaje ≥3) y negativos (baja expresión con score & lt; 3) con las puntuaciones de tinción (Figura 1b). La incidencia de casos positivos y negativos XB130 en estadio I-III GC eran de ninguna diferencia, pero la porción de negativos XB130 fue mayor en estadio IV y en los grupos de recurrencia después de la cirugía (Figura 1c). Se detectó mRNA nivel cuantificado de XB130 en estadio IV muestras de resección paliativa y redujo significativamente en los GC avanzada (Figura 1d). Del mismo modo, la reducción de la expresión de proteínas de XB130 en GC avanzada también se verificó por transferencia de Western (Figura 1e)
.
(a) El gen XB130 se expresa en el hígado humano, bazo, colon y estómago. (B) Imágenes representativas de XB130 inmunotinción de proteínas en el tejido de GC y el tejido no tumoral adyacente. (C) Incidencia de la GC-XB130 y XB130 negativo-positivo en estadios I-III (n = 263) y estadio IV (n = 148). (D) En el estadio I-III GC después de la resección radical, expresión XB130 mRNA fue significativamente menor en el tejido tumoral que en el correspondiente tejido no tumoral adyacente cuantificado por fluorescencia PCR
(p
& lt; 0,01, n = 9 por grupo
)
. (E) Expresión de la proteína XB130 por la etapa I-III GC (T) de manera significativa se reduce en comparación con que por el tejido gástrico normal (N) en el Western Blot (
p
& lt; 0,01, n = 6 por grupo) . Las muestras en (a), (d) y (e) eran tejidos frescos de pacientes con estadio I-III GC que recibieron cirugía de resección radical, mientras que las muestras en (b) y (c) eran de pacientes con estadio I-IV GC como se describe en la sección de método.
baja expresión de XB130 se correlaciona con mal pronóstico
en el análisis del total de 411 casos de CG en estadio I-IV, acumulados tasa de supervivencia de los pacientes XB130 con tinción negativa fue significativamente menor que los que tienen una tinción positiva (Figura 2a). En los pacientes con estadio IV GC que perdieron la oportunidad de curación de la cirugía, que mostró la tasa de supervivencia significativamente menor en el grupo negativo XB130 (Figura 2b). La mediana de tiempo de supervivencia global de los pacientes en fase avanzada fue mayor en el grupo positivo XB130 que en el grupo negativo (16,7 frente a 8,5 meses, HR para el grupo negativo fue 1,72, p = 0,011, Tabla 1). En aquellos pacientes en estadio I-III GC que recibieron cirugía resecar radical, la supervivencia libre de enfermedad en el grupo positivo XB130 era más alto que el grupo negativo (p & lt; 0,05; Figura 2c), mientras que la mediana de tiempo hasta la recurrencia fue de 36 y 24 meses en grupos positivos y negativos, respectivamente (Tabla 1, HR para los pacientes negativos era 1,2, p = 0,022). Estos hallazgos indican que la baja expresión de XB130 se asocia con una supervivencia más corta y la más alta recurrencia en pacientes con cáncer gástrico
.
(a) En todos los pacientes con 411 (estadios I-IV): GC, la tasa de supervivencia acumulada de la XB130- grupo negativo fue significativamente menor que la del grupo positivo (
p
& lt; 0,0001). (B) En 148 pacientes con cáncer gástrico en etapa IV, el grupo XB130-negativo tuvieron una tasa de supervivencia acumulada significativamente menor que el grupo positivo (
p
= 0,01). (C) En los pacientes con estadio I-III GC tratados mediante resección radical, la supervivencia libre de enfermedad acumulada fue significativamente menor para el grupo XB130-negativo que el grupo positivo (
p = 0,019
).
valor pronóstico de otros parámetros clínico
La influencia de otros parámetros clínico sobre la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad fue incluido en la tabla 1 y la figura 3. Además de XB130, resultados de análisis de la función de supervivencia de Kaplan-Meier en pacientes en etapa IV agrupados por los factores conocidos tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) de concentración, grado diferencial, metástasis, ascitis y la quimioterapia demostraron una influencia significativa en la supervivencia acumulada (Figura 3 a-e ). En un análisis de regresión de Cox univariante en pacientes recibió tratamiento radical, hemos observado que el escenario también fue un factor pronóstico significativo de recurrencia (Tabla 1)
Las cifras están etiquetados de la siguiente manera:. Supervivencia acumulada de los pacientes con GC con ( a) el antígeno carcinoembrionario (CEA) ≤5 mg /L o & gt;. 5 g /L, el grado (b) diferencial diferente (DIF), (c) con (M
1) o sin (M
0 .) la metástasis, (d) con o sin ascitis, (e) con o sin quimioterapia
En un análisis multivariado de regresión de Cox, hemos observado que XB130, CEA, la quimioterapia y la ascitis (todos p & lt; 0,01) fueron factores independientes para predecir HR para la muerte en los pacientes en la fase IV, mientras que XB130 (p = 0,044) y la etapa (p & lt; 0,000) fueron factores independientes para predecir HR de recurrencia después de la resección radical de GC en pacientes en la etapa I-III (Tabla 2).
quimioterapéuticos sensibilidad en respuesta a XB130 silenciar
con el fin de averiguar el potencial terapéutico en la orientación XB130, se evaluó la viabilidad celular de SH-XB130 en respuesta a 5-FU, cisplatino e irinotecán. La viabilidad de las células en los grupos SH-XB130 y de tipo salvaje fueron tanto suprimida por los tres agentes quimioterapéuticos en una manera dependiente de la dosis. Respectivamente, comparar con sh-XB130, control de tipo salvaje mostró más sensible a 5-FU se manifiesta por una viabilidad celular significativamente menor (Figura 4a), mientras que cisplatino (Figura 4b) e irinotecán (Figura 4c) se demostró ser más eficaz en SH- grupo XB130 que en el control de tipo salvaje.
(a) las células expuestas a 5-FU mostró mejor viabilidad en el grupo SH-XB130 que en el grupo scramble (n = 3-4 para cada concentración en cada grupo). (B) La viabilidad celular en el grupo SH-XB130 se reduce drásticamente por la exposición a cisplatino (n = 5-10 a cada concentración en cada grupo). (C) Irinotecan también redujo la viabilidad celular en el grupo SH-XB130 (n = 3-4 para cada concentración en cada grupo).
* p
Restaurant & lt; 0,05,
† p Restaurant & lt; 0,01,
‡ p Restaurant & lt; 0,001 frente a células de tipo salvaje a la concentración correspondiente. (D) los pacientes XB130-negativo tuvieron una tasa de supervivencia más baja cuando se tratan con 5-FU (Fu = 1).
El análisis de supervivencia en pacientes que reciben terapia GC 5-FU
Ordenada por XB130 negativo y positivo, se evaluó la terapia de 5-FU en los pacientes en estadio IV GC en un estudio retrospectivo. Tratado por 5-FU, los pacientes con tinción positiva XB130 disfrutaron de una tasa de supervivencia mayor que el grupo negativo (Figura 4d). En consecuencia, XB130 positivos con la terapia de 5-FU tuvieron el tiempo de supervivencia global más larga mediana (Figura 4d). Ya que había pocos pacientes tratados con cisplatino o irinotecán, la influencia del nivel de expresión XB130 sobre los efectos terapéuticos clínicos no se compararon en este estudio.
Discusión
XB130 es un recientemente clonado 130 kDa adaptador se ha informado de proteínas y que se expresa predominantemente en la tiroides y los tejidos de bazo validados por transferencia de Northern y juega un papel multifuncional en la supervivencia celular, la proliferación, la invasión de tumor de tiroides [2], [3], [4], pero su ARNm y la expresión de proteínas en otros tejidos no ha sido confirmada por PCR en tiempo real, transferencia de Western o inmunohistoquímica. En este artículo, en primer lugar, dio pruebas de que XB130 ARNm y proteína también se expresaron constitutivamente en tejido gástrico normal y relativamente más baja expresión en células de GC. Estos resultados están en contraste con los informes anteriores de que XB130 mRNA fue apenas detectable en otros tejidos excepto la tiroides y el bazo [1], [4], en parte, ya que sólo utilizan el norte de mancha para su confirmación. expresión XB130 se reduce en el tumor de la tiroides, pero sigue siendo completamente claro si XB130 es un biomarcador de pronóstico de otros tumores malignos tales como cáncer gástrico (GC) [2]. Con el fin de confirmar que XB130 participa en la progresión de la GC, habíamos analizado la supervivencia o la recurrencia en 411 pacientes con cáncer gástrico y señaló que la baja expresión XB130 predijo una supervivencia más baja y más alta recurrencia. Además, se evaluó la sensibilidad quimioterapéutico basar en la expresión XB130 por primera vez, y los experimentos celulares y estudio retrospectivo clínico indicó que la regulación por disminución de XB130 aumenta la sensibilidad de drogas a cisplatino e irinotecán y disminuye la sensibilidad de drogas a 5-fluorouracilo.
Dado la carcinogenicidad en los informes anteriores [2], [8], [9], XB130 debe considerarse como otro oncogénico de una proteína supresora de tumores, aunque se necesitan más estudios para probar si también es el caso de GC. Entonces, ¿cómo explicar el significado clínico de nuestra observación clínica de que XB130 regulación a la baja predice una supervivencia global baja en GC avanzada y una mayor tasa de recurrencia en pacientes tratados por cirugía de resección radical? De hecho, se sabe que la tumorigénesis puede resultar de alteraciones de múltiples genes y las proteínas, mientras que XB130, la proteína adaptador con más de un dominio funcional, puede ser afectada por varios factores de aguas arriba y aguas abajo. Por lo tanto, es demasiado pronto para juzgar si un gen o una proteína es oncogénico o no sólo basándose en su expresión en muestras clínicas, aunque este último no insinuar algunas pistas. En realidad, regulación a la baja de XB130 en GC se puede considerar un ajuste compensatorio, debido a que algunos supresores tumorales podrían ser movilizados para resistir XB130 durante la progresión de la GC. Del mismo modo, se informó de que la expresión de p53 supresor de tumores fue mayor en GC-pobremente diferenciado que en bien diferenciados los [10], mientras que en los cánceres gástricos tempranos con bajos niveles de apoptosis, el aumento de expresión de Bcl-2 y p53 era más probable para promover la metástasis [11], [12].
XB130 puede ser un proto-oncogén, que conserva en el tejido normal. Este tipo de proto-oncogenes pueden contribuir a mantener las funciones físicas de la renovación celular y la migración hacia arriba en estómago normal. Mientras tanto, hay otro conjunto de regulación de los genes que impiden la normal de las células proliferación excesiva y metaplasia. Sin embargo, una vez que se disequilibrated el equilibrio Microecological, la proliferación celular y la metástasis está fuera de control, en consecuencia, conduce a la carcinogénesis [13]. Esta teoría clásica del proto-oncogén puede dar una explicación aceptable por qué el tejido normal con tal expresión de alto XB130 sigue siendo "sano". Se sabe que muchos genes y vías de señalización desempeñan papeles pro-oncogénicos o anti-oncogénicos en una manera dependiente del contexto, por lo que no es raro que el mismo gen puede ejercer efecto diferente en las diferentes etapas o en diferentes tipos de tejidos del desarrollo del cáncer [ ,,,0],14], [15], [16]. En el presente estudio, a pesar de que no toque a las funciones de XB130 en tejido gástrico normal, este tema es interesante, así y necesita más investigación.
Si XB130 patrón de expresión puede servir como un marcador sustituto de predicción de la quimioterapia la respuesta, sino que también proporcionaría una explicación para el pronóstico. Actualmente, fluoropirimidina derivados basados en platino y regímenes de combinación a base de compuestos han sido aceptados como tratamiento de primera línea convencional para GC [17], mientras que el irinotecan, un inhibidor de topoisomerasa I, se emplea como tratamiento de segunda línea [18], y cisplatino tiene ha utilizado ampliamente en el tratamiento de avanzado, no resecable GC [19]. En la presente investigación, los estudios de quimioterapia sensibilidad que basan en el nivel de expresión XB130 se llevaron a cabo. En las células de GC, XB130 knockdown indica mejor capacidad de respuesta a cisplatino e irinotecán, pero con menos sensibilidad a 5-FU. Nuestros datos clínicos mostraron una supervivencia global menor en los pacientes tratados con 5-FU con baja expresión de XB130, lo que sugiere que XB130 regulación a la baja reduce la capacidad de respuesta a 5-FU, que puede ser otra explicación para el mal pronóstico en pacientes con baja expresión de XB130 en este estudio. Nuestros resultados en la línea celular GC implican que en los GC avanzada, la mayoría de los cuales se caracterizan por una baja expresión XB130, pueden beneficiarse más de cisplatino e irinotecán distinto de 5-FU. Dado el fondo genómico heterogéneo tal como la diferente expresión de XB130 en GC, es posible que algunas poblaciones podrían beneficiarse de irinotecan y /o cisplatino ya que sugirió en nuestro experimento celular, y vale la pena para análisis adicionales. Otras investigaciones prospectivas pueden determinar si los patrones de expresión XB130 se pueden emplear para ayudar a estratificar los pacientes en diferentes regímenes de tratamiento multimodal
.
En resumen, nuestro estudio ha proporcionado primera evidencia de que la existencia XB130 en tejido gástrico y GC por primera vez . Verificamos que la sensibilidad quimioterapéutico basar la evaluación de la expresión XB130 fue dirigida en primer lugar, lo que indica que los pacientes de bajo XB130 de expresión pueden ser sensibles a cisplatino e irinotecán, sin embargo, pruebas de alto nivel requiere. El potencial clínico de este estudio incluye (1) XB130 puede actuar como biomarcador pronóstico GC por su baja expresión que implica para los resultados desfavorables; (2) Dado que XB130 GC bajo expresadas son sensibles a cisplatino e irinotecán superior a 5-fluorouracilo en nuestro estudio de sensibilidad de quimioterapia, la evaluación de la expresión XB130 puede ayudar a guiar la medicación clínica en GC.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de tejido
Todos los 411 pacientes fueron diagnosticados histológicamente en el hospital Nanfang, Universidad médica del Sur (Guangzhou, Guangdong, china) desde 2000 hasta 2011. el estadio del tumor se define de acuerdo a la 7ª edición de la AJCC Cancer Staging Manual del 2010. las muestras para fines de diagnóstico fueron tomadas con el consentimiento de cada paciente. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur. El tiempo medio de seguimiento para todos los pacientes (IC del 95%: de 55,5 a 63,5) 59,5 meses. Las características y XB130 expresión clínica de todos los pacientes del GC se describen en la Tabla 1. Los pacientes de fase CG I-III se realizaron resección radical, mientras que los pacientes en estadio IV recibieron operación paliativa.
Antes de inmunohistoquímica análisis, el muestras de tejido primarios incluidos en parafina se cortaron en secciones de 4 micras de espesor, y se montaron en portaobjetos de vidrio. Nueve pares de tejidos normales y tumorales de cáncer adyacente de pacientes con cáncer gástrico en etapa IV se recogieron al azar para cuantitativa en tiempo real PCR y seis pares de Western blot.
La inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo utilizando el sistema Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) y de conejo anti-XB130 Ab (1:100; Abnove) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para la evaluación XB130, la sección de tejido fue escaneada por completo para asignar las puntuaciones. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (negativo), 1 (débil), 2 (medio) o 3 (fuerte). El grado de tinción se puntuó como 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), o 4 (76% -100%), de acuerdo con los porcentajes de las áreas teñidas positivamente en relación a toda la zona de carcinoma (o sección completa para las muestras normales). La suma de las puntuaciones de intensidad y extensión de tinción se utilizó como las puntuaciones de tinción final (0-7) para XB130. Para el propósito de la evaluación de supervivencia, se consideraron tumores que tienen una puntuación final de tinción de ≥3 a ser positivo. XB130 inmunotinción fue evaluada de forma independiente por dos individuos cegados a los parámetros clínicos.
fluorescencia PCR cuantitativa
ARN total fue extraído utilizando el kit de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). a continuación, se obtuvo la transcripción inversa de ADNc con iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los datos de ARN se presentan en relación con la limpieza de genes β-actina utilizando el método ΔΔCt. PCR rutina también se realizó para examinar la XB130 expresión en diferentes órganos de humanos y de ratón (secuencias de cebador en la Tabla S1).
Western Blot
Los tejidos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato ( PBS) y se lisaron con tampón de lisis de proteína durante 30 min. Se llevó a cabo la centrifugación, y el sobrenadante que contiene la proteína se retuvo. Los lisados de proteínas fueron separados electrophorectically en 10% de gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA). Entonces, inmunotransferencia se llevó a cabo mediante el uso de conejo anti-XB130 anticuerpo (PradoWalnut, CA, EE.UU.) y β-actina (Santa Cruz, CA). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante el método de quimioluminiscencia mejorada (Amersham) con un sistema de detección de Western Blot (Kodak Digital Science, Rochester, NY, EE.UU.) y se cuantificaron por v4.6.2 QuantityOne software de imagen.
Cultivo celular
Las células de línea de células SGC7901 se cultivaron en medio completo [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Hyclone)]. células transfectadas de forma estable se mantuvieron en medios con la presencia de puromicina (Sigma-Aldrich). Las células se incubaron a 5% de CO
2 a 37 ° C.
transfectadas establemente líneas celulares establecimiento
Tres shRNA secuencias diferentes de XB130 se clonaron en el plásmido pSuper-rretro-puromicina con enzima de restricción Bgl II, Hind III (New England Biolabs) y la ADN ligasa T4 (Takara). Tanto pSuper-rretro-puro-shXB130 y pSuper-rretro-puro se construyeron. pSuper-rretro-puromicina shXB130 combinado con el vector plásmido o vector de embalaje scramble como control negativo fueron empaquetados en virus utilizando el método de fosfato de calcio. SGC7901 células fueron transfectadas por plásmidos shRNA utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), que se repite tres veces. Las células fueron cultivadas como se ha mencionado anteriormente, y las colonias individuales fueron elegidos por el Western Blot y PCR cuantitativa de fluorescencia y se utilizaron para experimentos adicionales. Tres shRNA orientación XB130 y una rebatiña fueron diseñados (Tabla S2). Tanto el ARNm y la expresión de proteínas de XB130 (secuencia del cebador en la Tabla S1, expresión resultados en la Figura S1 A, B) fueron confirmados por PCR en tiempo real y Western Blot. eficiencia de infección por adenovirus se mostró en la Figura S1C y D.
La viabilidad celular análisis
tripsinizaron y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 0,2 × 10
4 /pocillo, las células se cultivaron y se observó a 1, 3, 5 y 7 días. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de metilo thiazolyltetrazolium (MTT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 570 nm, con 655 nm como longitud de onda de referencia. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
evaluación quimioterapéuticos sensibilidad en las células GC
Las células de control de tipo salvaje y SH-XB130 se cultivaron en el medio con 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino o irinotecan por diferentes concentraciones. Cuarenta y ocho horas más tarde, se evaluó la viabilidad celular.
El análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media ± SEM o mediana. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para las variables categóricas y la prueba t de Student para variables continuas. Las tasas de supervivencia y recurrencia se calcularon de acuerdo con el método de Kaplan-Meier. La significación estadística fue aceptada en un
p valor Red de menos de 0,05.
Apoyo a la Información
Figura S1.
validación del efecto de silenciamiento génico de pequeños ARN de horquilla de XB130 (sh-XB130) y la eficiencia de adenovirus infeccioso. XB130 downregulated modelos de la línea de células se confirmaron mediante PCR en tiempo real (A) y transferencia Western (b). Las células transfectadas por el vector scramble sirvieron como control negativo y un prototipo no transfectadas como control. La eficiencia infecciosa del adenovirus en 293FT células cultivadas se confirmó mediante microscopías normales (C) y de fluorescencia (d). Inserción en A es la curva de amplificación de PCR en tiempo real
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s001 gratis (PPT)
Tabla S1.
Primer secuencias en tiempo real o PCR rutina
doi: 10.1371. /journal.pone.0041660.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
secuencias de ARN-XB130 Sh
doi: 10.1371. /journal.pone.0041660.s003 gratis (DOC)