Extracto
Antecedentes
factor de crecimiento de queratinocitos receptor (KGFR) es una variante de empalme de la gen FGFR2 expresado en las células epiteliales. La activación de KGFR es un factor clave en la regulación de procesos fisiológicos en las células epiteliales, tales como la proliferación, la diferenciación y la curación de heridas. Las alteraciones de la señalización de KGFR se han relacionado con la patogénesis de diferentes tumores epiteliales. Ha sido también la hipótesis de que su ligando específico, KGF, podría contribuir al desarrollo de resistencia a 5-fluorouracilo (5-FU) en los cánceres epiteliales y tamoxifeno en el cáncer de mama estrógeno-positivo.
Metodología /Principales conclusiones
sirna se transfectó en una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT), una línea celular derivada de cáncer de mama (MCF-7) y un cultivo primario de queratinocitos (KC) para inducir la regulación por disminución selectiva de la expresión KGFR. Se observó una reducción fuerte y altamente específico de expresión en KGFR tanto ARN (reducción = 75,7%,
P
= 0,009) y el nivel de proteína. KGFR silenciado células mostraron una capacidad de respuesta reducida al tratamiento KGF como se evaluó mediante la medición de la tasa de proliferación (14,2% frente a 39,0% de las células de control,
P
& lt; 0,001) y la migración celular (24,6% frente al 96,4% del control células,
P
= 0,009). En las células transfectadas de manera simulada MCF-7, KGF contrarresta la capacidad de 5-FU para inhibir la proliferación celular, mientras que en KGFR células silenciadas KGF interfiere débilmente con 5-FU efecto antiproliferativo (11,2% frente a 28,4% de las células de control,
P
= 0,002). La capacidad de 5-FU para inducir la muerte celular se suprime por co-tratamiento con KGF, mientras que en KGFR células silenciadas 5-FU induce la muerte celular de manera eficiente incluso combinado para KGF, como se determina mediante la evaluación de la viabilidad celular. Del mismo modo, la capacidad del tamoxifeno para inhibir las células MCF-7 y la proliferación de los KC es altamente reducidas por el tratamiento con KGF y está completamente restaurada en KGFR silenciados células (12,3% frente al 45,5% de las células de control,
P Hotel & lt; 0,001) .
conclusiones /Importancia
Estos hallazgos sugieren que la inhibición selectiva de la vía de KGF /KGFR puede proporcionar una herramienta útil para mejorar la eficacia de las estrategias terapéuticas para ciertos tumores epiteliales.
Visto: Rotolo S, S Ceccarelli, Romano M, L Frati, Marchese C, Angeloni a (2008) el silenciamiento de crecimiento de queratinocitos receptor del Factor Restaura 5-fluorouracilo y tamoxifeno eficacia en las células cancerosas Responsive. PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10.1371 /journal.pone.0002528
Editor: Stefan Maas, Lehigh University, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de mayo de 2008; Aceptado 27 de mayo de 2008; Publicado: 25 Junio 2008
Derechos de Autor © 2008 Rotolo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de la MIUR, Cofin de 2005, y desde la concesión Regione Lazio emitida por Progetto di Ricerca Finalizzata 2005. los donantes no estaban directa o indirectamente involucrados en el diseño o la realización del estudio en cualquier parte.
Conflicto de intereses los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factor de crecimiento de queratinocitos receptor (KGFR /FGFR2-IIIb) es una proteína tirosina quinasa que pertenece a la familia del factor de crecimiento de fibroblastos. receptores (FGFR). KGFR representa una variante de empalme transcripción del gen FGFR2 y se expresa en las células epiteliales de diferentes órganos. La isoforma empalmados alternativamente, conocido como FGFR2-IIIc, se encuentra en las células de los linajes mesenquimales [1], [2]. KGFR juega un papel clave en el control de crecimiento epitelial y la diferenciación, la realización de sus efectos biológicos de una manera paracrina [3] a través de unión de alta afinidad a sus ligandos específicos, a saber, el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF /FGF7), FGF10 y FGF22 [4 ]. Entre ellos, KGF actúa no sólo como un potente mitógeno para los queratinocitos humanos primarios, sino también la promoción de su programa de diferenciación [5] y protegerlos contra la inducción de la apoptosis [6], [7]. Por otra parte, KGF está involucrado en tanto experimentales [8], [9] y
in vivo
[10] modelos de curación, estimulando la migración de los queratinocitos [11], [12] y la inducción de reorganización del citoesqueleto de actina, por lo tanto, la herida el aumento de la motilidad de las células epiteliales [13].
Recientemente, ha habido un creciente interés sobre el papel potencial de las alteraciones de KGF /KGFR de señalización en la tumorigénesis epitelial. El aumento de expresión KGFR mRNA se ha detectado en una amplia gama de tumores de origen epitelial, tales como pulmón, colon, gástrico, de páncreas y próstata. En algunos casos, tal incremento en la expresión parece estar asociada con la transformación celular y, tal vez, malignas progresión [14]. Además, la administración de KGF se ha demostrado que aumenta la motilidad celular en los receptores de estrógenos (ER) células tumorales de mama positivo [15], [16], para ser potencialmente implicados en la progresión del cáncer de mama y metástasis [17] y para mejorar el potencial invasivo de líneas celulares de carcinoma gástrico derivado sobreexpresan KGFR [18].
Otros estudios llevaron a la hipótesis de que KGF puede ejercer la actividad antiapoptótica en ciertas células cancerosas, así como la inhibición de la apoptosis inducida por el fármaco quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU ) [19] - [22]. El desarrollo de las células cancerosas de resistencia a los agentes quimioterapéuticos tradicionales, tales como 5-FU, se observa con frecuencia y sigue siendo un obstáculo importante para el éxito del tratamiento del cáncer y una causa importante de la recurrencia del tumor después de la quimioterapia [23].
Además, se ha sugerido que las alteraciones de las vías de participación de los FGF y receptores afines podrían representar uno de los mecanismos de resistencia a tamoxifeno que finalmente se desarrolla en muchos cánceres de mama ER-positivo [24] - [27]. Sin embargo, esta hipótesis no está completamente comprobado y el papel específico que desempeña la gran familia del FGF está lejos de ser comprendido.
El enfoque basado en la regulación por disminución selectiva de las proteínas implicadas en procesos celulares correlacionados con la progresión tumoral representa una frontera prometedor para el tratamiento del cáncer. La transfección de pequeños ARN de interferencia (siRNAs específicos) es una poderosa herramienta para lograr una caída de genes específicos y representa una potente estrategia terapéutica para el tratamiento de varias enfermedades, como infecciones virales, trastornos neurológicos y cáncer [28].
El exclusivo especificidad de la diana de ARNip contra el ARNm relevantes de la enfermedad es un requisito previo esencial para la utilización de esta tecnología. En este estudio, se downregulated selectivamente KGFR ARNm y la expresión de proteínas en tres líneas de células epiteliales, queratinocitos HaCaT, MCF-7 de células de cáncer de mama y queratinocitos primarios en cultivo (KCS), por un nuevo enfoque del diseño de siRNA, basados en la utilización de endonucleasas de DICER ARN de doble cadena de sustrato 27-mer para activar la interferencia de ARN (ARNi). Esta técnica proporciona una eficacia y mayor duración de RNAi mejorada en comparación con siRNAs 21-mer tradicionales, lo que permite el uso de concentraciones más bajas de RNAi en las células diana, lo que reduce en gran medida los efectos secundarios. Además, permite la focalización de los sitios que son refractarios a la supresión con siRNAs 21-mer [29].
Se analizaron los efectos de KGFR siRNA sobre las características biológicas, parámetros como la viabilidad celular, la proliferación, la apoptosis y la migración de las líneas celulares ensayadas. Por último, se evaluó si la regulación a la baja de la expresión KGFR es capaz de inhibir la 5-FU y la resistencia a tamoxifeno inducida por KGF en cultivos celulares.
Resultados
La inhibición de la expresión de ARNm de siRNAs KGFR
No hay reglas claras que regulen siRNA selección del lugar de destino para las secuencias de ARNm específicos. Sin embargo, dentro de una sola secuencia de ARNm diferentes moléculas de siRNA muestran una variabilidad dramático en términos de eficacia y especificidad de silenciamiento de genes. Aquí hemos utilizado programas de Laboratorio y basados en la web, de acuerdo con los criterios anteriormente descritos (http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), para seleccionar tres siRNAs dirigidos contra secuencias del gen FGFR2. Se sabe que los mismos códigos de genes para dos transcritos alternativos, designados como KGFR /FGFR2-IIIb y FGFR2-IIIc, que difieren por un tramo divergente de 49 aminoácidos en su dominio extracelular y muestran diferentes características de unión a ligando. Por lo tanto, para darse cuenta de una caída específica de la transcripción KGFR, se seleccionaron secuencias siRNAs dirigidos dentro del exón 8 del gen FGFR2, que está empalmado sólo en la isoforma KGFR (fig. 1A). Todas las secuencias de siRNAs se introdujeron en una explosión de búsqueda para asegurarse de que no había ninguna homología significativa con otros genes. Como en relación con la expresión relativa de las dos isoformas FGFR2 en nuestros modelos experimentales, las células HaCaT se han demostrado previamente para expresar la variante FGFR2-IIIc de FGFR2 en dos órdenes de magnitud menor cantidad que la variante FGFR2-IIIb de empalme [30]; en células MCF-7, se muestra previamente para expresar ambas isoformas [31], hemos demostrado que la expresión FGFR2-IIIb es considerablemente mayor que la de FGFR2-IIIc (11 veces mayor) (Fig. 1B). La capacidad de cada siRNA diseñado y de un conjunto combinado de los tres dúplex para reducir específicamente los niveles de mRNA KGFR, sin afectar a la expresión de la isoforma FGFR2-IIIc, se ensayó en células HaCaT MCF-7 y. Las transfecciones transitorias se utilizan para entregar cada siRNA y las células incubadas con el vector liposomal solo (transfección simulada) se utilizaron como control. La concentración óptima para la transfección de siRNA fue determinado experimentalmente para ser 5 nM (datos no mostrados), de acuerdo con las observaciones recientes que indican mecanismos tóxicos, efectos fuera de la meta y la estimulación de la respuesta inmune inducida por altas dosis de sintética RNAi
in vitro Opiniones y
in vivo
[32]. La capacidad de los diferentes siRNAs para reducir la cantidad de KGFR mRNA se estimó por Q-RT-PCR. En células MCF-7 también se evaluó la especificidad de los siRNAs diseñado. niveles KGFR y FGFR2-IIIc de ARNm se normalizaron a los niveles de ARNm de beta-actina. 48 h después de la transfección, las células MCF-7 transfectadas con el conjunto agrupado de siRNA-1, -2 y -3 expresó una cantidad estadísticamente significativa reducido de KGFR mRNA en comparación con las células transfectadas de manera simulada (0.243 veces, la reducción = 75,7%,
P
= 0,009) (Fig. 2A). Un efecto menos evidente se obtuvo por transfección con los dúplex individuales: siRNA-1 (0,613 veces, la reducción = 38,7%,
P = 0,168
), siRNA-2 (0.405 veces, la reducción = 59,5%,
P = 0,068
) y siRNA-3 (0,406 veces, la reducción = 59,4%,
P = 0,061
) (Fig. 2A). Por el contrario, ni los siRNAs individuales ni el siRNA-piscina mostraron ningún efecto inhibidor sobre los niveles de ARNm de FGFR2-IIIc (siRNA-1: 0,902 veces, la reducción = 9,8%,
P
= 0,71; siRNA-3: 0.914 veces, reducción = 8,6%,
P
= 0,36; si-ARN-3: 0,943 veces, la reducción = 5,7%,
P
= 0,52; siRNA-piscina: 1.028 veces, diferencia = 2,8% ,
P
= 0,85) (Fig. 2B).
(A) dibujo esquemático que representa el splicing alternativo de FGFR2-IIIc y KGFR /FGFR2-IIIb. El recuadro (*) indica la secuencia de ADNc (nucleótidos 1590 a 1698) correspondiente a todo el exón 8, con las secuencias dirigidas por los tres siRNAs (cajas grises). (B) Los niveles de expresión y KGFR FGFR2-IIIc ARNm se determinaron por Q-RT-PCR, y normalizado a ß-actina niveles de mRNA. KGFR mRNA en células MCF-7 se determinó como se pliegue con respecto a FGFR2-IIIc mRNA. El gráfico muestra el rango intercuartil de tres experimentos independientes (cajas), sus medias (barras punteadas horizontales) y el 95% intervalo de confianza (IC) (bigotes). Se utilizó
t
prueba de Student bilateral para comparar KGFR frente expresión FGFR2-IIIc: *
P Hotel & lt; 0,001. Los informes de tablas que se acompañan significan nivel de expresión, error estándar (SE), y el IC del 95% para cada muestra ensayada.
(A, B) MCF-7 células fueron transfectadas de forma simulada o transfectadas con 5 nM siRNA -1, -2, -3, o con un conjunto agrupado de ellos, y el ARN total fue extraído a 48 h después de la transfección. Los niveles de KGFR (A) y la expresión de ARNm FGFR2-IIIc (B) se determinaron por Q-RT-PCR, y los niveles de ARNm de beta-actina normalizados. KGFR (A) o FGFR2-IIIc (B) de ARNm en las células siRNA transfectadas se determinaron como veces con respecto a la expresada en las células transfectadas de manera simulada. Para cada tratamiento, los gráficos muestran el rango intercuartil de tres experimentos independientes (cajas), sus medias (barras punteadas horizontales) y el 95% intervalo de confianza (IC) (bigotes). Se utilizó
t
prueba de Student bilateral para comparar siKGFR-transfectadas frente a las células transfectadas de manera simulada: *
P = 0,009
. Las tablas que se reportan nivel de expresión, error estándar (SE), y el IC del 95% para cada muestra ensayada significar.
Por lo tanto, todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo mediante la transfección del ARNsi-piscina, que coincide los criterios adoptados comúnmente de eficiencia siRNA (& gt; 70% de reducción en el ARNm diana). Por otra parte, ya que la piscina muestra una alta especificidad para KGFR isoforma, se hará referencia como siKGFR en el resto del manuscrito.
Evolución temporal de KGFR siRNA mediada por silenciamiento
Para evaluar la duración y la eficacia de KGFR silenciamiento, hemos realizado experimentos de tiempo en las células HaCaT transfectadas con siKGFR, la determinación de la cantidad de mRNA KGFR por Q-RT-PCR a las 6, 24, 48, 72 y 96 h después de la transfección (Fig. 3A). Se observó una reducción de la expresión de ARNm KGFR 24 h después de la transfección, en comparación con las células transfectadas de manera simulada (1.127 frente a 2.730 veces, diferencia = 58,7%,
P Hotel & lt; 0,001), mientras que la eficacia completa se logró en el 48 y 72 h (1.127 frente a 4.779 veces, diferencia = 76,4%,
P Hotel & lt; 0,001 y 1,079 frente a 4,463 veces, diferencia = 75,8%,
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente) a partir de la transfección . 96 h después de la transfección, se observó una fuerte disminución de la expresión KGFR también en el control. Sin embargo, en las células transfectadas, regulación a la baja de la expresión KGFR seguía siendo significativa (1.215 frente a 1.963 veces, diferencia = 38,1%,
P = 0,017
). Sobre la base de los resultados del curso de tiempo y de acuerdo con informes anteriores que muestran que el pico de expresión de la proteína KGFR se alcanza a las 72 h después de la hambruna [30] Se decidió realizar todos los experimentos posteriores a las 72 h después de la transfección siKGFR.
células (a) HaCaT fueron falsamente transfectadas o transfectadas con 5 nM siKGFR, y el ARN total se extrajo de las células transfectadas 6, 24, 48, 72 y 96 h más tarde. Los niveles de expresión de ARNm KGFR se determinaron por Q-RT-PCR, y los niveles de ARNm de beta-actina normalizados. La cantidad de KGFR mRNA en cada punto de tiempo se expresó como veces de nivel KGFR ARNm con respecto al punto de tiempo de 6 h. Para cada punto de tiempo, el gráfico muestra el rango intercuartil de tres experimentos independientes (cajas), sus medias (barras punteadas horizontales) e IC del 95% (bigotes). Los informes de tablas que se acompañan significan nivel de expresión, error estándar (S. E.), y el IC del 95% para cada muestra ensayada. de Student bilateral
t
prueba se utilizó para comparar siKGFR-transfectadas frente a las células transfectadas de manera simulada: *
P Hotel & lt; 0,001 (24 h); **
P Hotel & lt; 0,001 (48 h); †
P Hotel & lt; 0,001 (72 h); ‡
P = 0,017
(96 h). células (B) HaCaT fueron falsamente transfectadas o transfectadas con 5 nM siKGFR. 24 h después de la transfección, las células se trataron con 20 ng /ml KGF para 48 h. Los niveles de expresión de ARNm KGFR se determinaron por Q-RT-PCR, y los niveles de ARNm de beta-actina normalizados. La cantidad de KGFR mRNA se expresó como veces de los niveles de ARNm de KGFR con respecto a las células transfectadas de manera simulada no tratados. El gráfico y el informe de la mesa de los mismos conjuntos de datos como en (A) para cada muestra ensayada.
Los valores P
se determinaron utilizando
t
prueba de Student de dos caras: *
P = 0,003
frente a las células falsamente transfectadas no tratadas; **
P = 0,018
frente a las células transfectadas falsamente tratados con KGF. Se transfectaron las células (C) HaCaT y se trataron como en (B), y los niveles de expresión de la proteína KGFR se determinaron por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-bek policlonal. La misma mancha se probaron para la tubulina como control para la igualdad de la carga. La cantidad de proteína KGFR se evaluó mediante análisis densitométrico; los valores de un experimento representativo se estandarizaron a los niveles de tubulina, expresado como pliegue de proteínas KGFR con respecto a las células transfectadas de manera simulada no tratadas e informadas como un gráfico.
regulación a la baja de KGFR ARNm y proteínas expresión de siRNA en las células HaCaT KGF tratados
se sabe que el tratamiento de células epiteliales con KGF induce varios eventos, tales como la proliferación celular y la diferenciación a través de la unión a KGFR y la internalización del receptor acoplado a la reducción del nivel de expresión de ARNm KGFR . Por lo tanto, hemos examinado el efecto de siKGFR transfección en cultivos celulares en presencia de 20 ng KGF /ml. los niveles de mRNA y expresión de proteínas fueron probados por Q-RT-PCR y análisis de transferencia Western. Se observó una fuerte disminución de KGFR mRNA en células transfectadas con siKGFR en comparación con células transfectadas de manera simulada (0.232 veces, reducción = 76,8%,
P
= 0,003) (Fig. 3B). En presencia de KGF, se observó una modulación negativa de la expresión de KGFR también en células transfectadas de manera simulada. Sin embargo, la inhibición KGFR mRNA de siRNA era todavía evidente (0.265 frente a 0.598 veces, reducción = 55,7%,
P
= 0,018) (Fig. 3B). En el mismo conjunto de experimentos, los niveles de expresión de la proteína KGFR también se analizaron por Western blot. Como se muestra en la Fig. expresión 3C, KGFR se redujo significativamente en las células transfectadas con siKGFR en comparación con células transfectadas de manera simulada. El análisis densitométrico confirmó que siKGFR reduce la expresión de proteínas, tanto en las células no tratadas y tratadas con KGF, en más de un 50% con respecto a las células transfectadas de manera simulada (0,47 veces frente a 1 veces, la reducción de = 53% y 0,20 frente a 0,73 veces, la reducción = 72,6 %, respectivamente) (Gráfico Fig. 3C).
regulación a la baja de siRNA mediada KGFR inhibe la proliferación celular y la migración celular inducida por KGF
Para evaluar los efectos biológicos de KGFR silenciamiento, se analizó el capacidad siKGFR para afectar a la proliferación inducida por KGF mediante la realización de un ensayo de proliferación de la línea celular HaCaT. células cultivadas en placas se transfectaron con siKGFR y se cultivaron durante 48 h en medio estándar complementado o no con 20 ng /ml KGF. La proliferación celular se determinó contando las células positivas para el antígeno Ki67, que identifica células en ciclo, e informó en el gráfico como porcentaje de células positivas (Fig. 4A). Como era de esperar, en las células transfectadas de manera simulada se observó un aumento en las células HaCaT proliferación después del tratamiento KGF, en comparación con las células no tratadas (39% frente a 13,6%, 2,9 veces de incremento,
P
& lt; 0,001). La regulación a la baja de la expresión a través de KGFR siRNA específico abolió casi por completo el efecto de KGF en las células HaCaT proliferación, con una tasa de proliferación a nivel de fondo (14,2% frente a 39%, 2,7 veces de diferencia,
P
& lt; 0,001) (Gráfico Fig . 4A).
ensayo de proliferación
(A). Las células HaCaT, cultivadas en cubreobjetos, se transfectaron o transfectadas con 5 nM siKGFR simulacro. 24 h después de la transfección, las células se trataron con 20 ng /ml KGF para 48 h. A continuación, las células se fijaron y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal dirigido contra Ki67 (rojo). Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. Barra de escala, 10 micras. Los núcleos se visualizó usando 4 ', dihidrocloruro de 6-diamido-2-fenilindol (DAPI). El porcentaje de células Ki67 positivas se determinó contando el número de núcleos Ki67 positivas frente al número total de núcleos en diez diferentes áreas tomadas al azar de tres experimentos diferentes, expresado como valor medio ± IC del 95% y reportado como un gráfico.
Los valores P
se determinaron utilizando
t
test de Student: *
P Hotel & lt; 0,001 frente a las células falsamente transfectadas no tratadas; **
P Hotel & lt; 0,001 frente al modelo de células transfectadas tratadas con KGF. (B, C) de curación de heridas ensayo. células HaCaT (B) y MCF-7 (C) se transfectaron como en (A). 48 h después de la transfección, se introdujo una zona libre de células (herida) en cultivos confluentes, como se describe en Materiales y Métodos. Las células fueron tratadas o no con 50 ng /ml de KGF y permitió migrar durante 24 h antes de la fotografía al microscopio de contraste de fase. Las imágenes son representativos de tres experimentos independientes. Las barras de escala, 10 m. La migración celular se evaluó mediante la repoblación de la herida original con las células: el porcentaje de área recuperado se midió por análisis de imagen y los valores en los gráficos son la media de tres placas para cada condición de CI ± 95%.
Los valores P se determinaron utilizando
de Student
t
prueba: (B) *
P Hotel & lt; 0,001 frente a las células falsamente transfectadas no tratadas; **
P Hotel & lt; 0,001 frente al modelo de células transfectadas tratadas con KGF. (C) *
P = 0,035
frente a las células falsamente transfectadas no tratadas; **
P = 0,009
frente a las células transfectadas falsamente tratados con KGF.
A continuación, analizó el impacto de KGFR silenciamiento sobre la migración celular, otro proceso celular compleja y estrictamente regulado fuertemente inducida por tratamiento KGF. Con este fin, se realizó un ensayo de cicatrización de heridas. 48 h después de la transfección con siKGFR una zona libre de células se introdujo en monocapas de células HaCaT, tal como se describe anteriormente [33]. Las células tratadas o no con 50 ng /ml de KGF, la concentración notificado a ser más eficiente en este ensayo [34], se les permitió migrar desde el borde de la herida durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 4B, la herida cierre estaba casi terminado 24 h después de la herida inicial en las células transfectadas falsamente tratados con KGF, mientras que las células transfectadas de manera simulada no tratados mostraron una migración limitada con respecto a T0 (96,4% frente a 23,1%, 4,2 veces de incremento,
P = 0,035
) (Gráfico Fig. 4B). La transfección con siKGFR la migración celular, inhibió inducida por KGF (Fig. 4B) y posteriormente se redujo el área recuperado de 96,4% de las células de control a 24,6%, 3,9 veces de diferencia,
P
= 0,009) (Gráfico Fig . 4B).
El mismo ensayo de curación de heridas también se realizó en células de cáncer de mama MCF-7, se sabe que son sensibles a KGF en términos de la motilidad [15], con resultados similares (Fig. 4C). tratamiento KGF promovió una fuerte repoblación, en comparación con la de las células transfectadas de manera simulada no tratados (83% frente a 29,6%, 2,8 veces de incremento,
P
& lt; 0,001). En KGFR silenciado células, la migración inducida por KGF casi fue abolida, en comparación con las células control (25,4% frente al 83%, 3,3 veces la diferencia,
P Hotel & lt; 0,001). (. Gráfico figura 4C)
Estos resultados sugieren que KGFR silenciamiento es eficaz en la inhibición de KGF efectos biológicos, tales como la estimulación de la proliferación celular y la migración, ya sea en los queratinocitos HaCaT o células epiteliales de cáncer de mama.
silenciamiento KGFR inhibe la restauración de la célula proliferación inducida por KGF a 5-FU estimulación
con frecuencia, las células cancerosas desarrollan resistencia a los fármacos quimioterapéuticos comunes, tales como 5-FU, la eficacia de la quimioterapia por lo tanto un reto [23]. Con el fin de investigar el papel de KGFR en el establecimiento de la resistencia a 5-FU, que transitoriamente derribado expresión KGFR por siRNA en la línea celular de cáncer de mama MCF-7.
La transfección con siKGFR se realizó en el presencia o no de 20 ng /ml de KGF, 25 mg /ml 5-FU o una combinación de ellos. En primer lugar, se evaluó la eficiencia de KGFR silenciamiento mediante el análisis de tanto los niveles de expresión de proteínas y mRNA.
Como se muestra en la Fig. 5A, el tratamiento con KGF de las células transfectadas de manera simulada reduce la expresión de mRNA KGFR en comparación con las células no tratadas, independientemente de la presencia de 5-FU en los cultivos celulares (0.555 veces, reducción = 44,5%,
P =
0.170 y 0.545 veces, la reducción = 45,5%,
P = 0,183
, respectivamente). Por otra parte, el 5-FU solo escasamente afectada la expresión de ARNm KGFR (0,911 veces, la reducción = 8,9%,
P = 0,711
). En cultivos transfectados-siKGFR, se observó un fuerte efecto sobre la expresión de ARNm (0.133 veces, reducción = 86,7%,
P
= 0,039), con variaciones modestas en respuesta a la presencia o ausencia de KGF y /o 5 -FU. Estos datos confirmaron que las células MCF-7 células reaccionan de manera similar a las células HaCaT en respuesta a KGFR silenciamiento. Además, los resultados obtenidos a nivel de ARN se confirmó mediante el análisis de expresión de la proteína, como se muestra en la Fig. 5B. El siRNA específico disminuyó significativamente la proteína KGFR en las células no tratadas, así como en KGF y /o las células tratadas con 5-FU, en un 60% -70% con respecto al mismo tratamiento en las células transfectadas de manera simulada (véase el Gráfico Fig. 5B).
células MCF-7 (a) fueron falsamente transfectadas o transfectadas con 5 nM siKGFR. 48 h después de la transfección, las células se trataron con 20 ng /ml de KGF, 25 mg /ml 5-FU o KGF más 5-FU durante 24 h. Los niveles de expresión de ARNm KGFR se determinaron por Q-RT-PCR, y los niveles de ARNm de beta-actina normalizados. La cantidad de KGFR mRNA en las células transfectadas con siKGFR se expresó como veces del nivel de mRNA KGFR con respecto a las células transfectadas de manera simulada no tratados. Para cada tratamiento, el gráfico muestra el rango intercuartil de tres experimentos independientes (cajas), sus medias (barras horizontales de puntos), y el IC del 95% (bigotes). Los informes de tablas que se acompañan significan nivel de expresión, error estándar (S. E.), y el IC del 95% para cada muestra ensayada.
Los valores P
se determinaron utilizando
t
test de Student: *
P = 0,039
frente a las células transfectadas de manera simulada no tratados. Se transfectaron (B) células MCF-7 y se trataron como en (A), y la cantidad de proteína KGFR se evaluó mediante análisis de transferencia Western con un anticuerpo policlonal anti-bek. Tubulina sirve como control de carga. La cantidad de proteína KGFR se evaluó mediante análisis densitométrico: los valores de un experimento representativo se estandarizaron a los niveles de tubulina, expresado como pliegue de nivel KGFR con respecto a las células transfectadas de manera simulada no tratados y se presenta como un gráfico
a continuación realizó un ensayo de proliferación de células MCF-7, transfectada con siKGFR o transfectadas de manera simulada y se cultivaron durante 48 h en medio estándar complementado o no con KGF, 5-FU o una combinación de ellos, como el anterior. La proliferación celular se evaluó contando las células positivas para el antígeno Ki67, e informó en el gráfico como porcentaje de células positivas (Fig. 6A). También en MCF-7 encontramos un aumento en la proliferación celular después del tratamiento KGF, en comparación con las células no tratadas (34,8% frente a 19,5%, 1,8 veces mayor,
P
= 0,004). Como era de esperar, el tratamiento con 5-FU reveló un efecto antiproliferativo (6,0% frente a 19,5%, 3,3 veces de diferencia,
P
& lt; 0,001), que fue casi completamente abrogada por la co-tratamiento con KGF (28,4% frente 6,0%, 4,7 veces la diferencia,
P Hotel & lt; 0,001). KGFR regulación a la baja de siRNA casi abolió efecto proliferativo KGF, tanto sola como en combinación con 5-FU (15,7% frente a 34,8%, 2,2 veces la diferencia,
P Hotel & lt; 0,001 y un 11,2% frente a 28,4%, 2,5 veces la diferencia ,
P = 0,002
, respectivamente) (Fig. 6A).
() células MCF-7 a, cultivadas en cubreobjetos, fueron falsamente transfectadas o transfectadas con 5 nM siKGFR y 48 h más tarde que se trataron o no con 20 ng /ml de KGF, 25 mg /ml 5-FU o KGF más 5-FU. Después de 24 h, las células se fijaron y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal anti-Ki67. Los núcleos se visualizó usando 4 ', dihidrocloruro de 6-diamido-2-fenilindol (DAPI). La proliferación celular se evaluó como porcentaje de núcleos Ki67 positivas frente al número total de núcleos en diez diferentes áreas tomadas al azar de tres experimentos diferentes, expresado como valor medio ± IC del 95% y reportado como un gráfico.
Los valores P se determinaron utilizando
de Student
t
prueba: *
P = 0,004 y
**
P Hotel & lt; 0,001 frente sin tratar maqueta transfectadas Células; ***
P Hotel & lt; 0,001 frente a 5-FU-tratada células transfectadas de manera simulada; †
P Hotel & lt; 0,001 frente al modelo de células transfectadas tratadas con KGF; ‡
P = 0,002 frente
KGF más 5-FU tratados con células transfectadas de manera simulada. Se transfectaron (B) células MCF-7 y se trataron como en (A), y análisis de transferencia Western de la fosforilación de ERK estado se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal ERK-fosfo específico (p-ERK). Los niveles de ERK total fueron evaluados por Blot con un anticuerpo específico-ERK2. La cantidad de ERK activado se evaluó mediante análisis densitométrico: los valores de un experimento representativo se estandarizaron a los niveles totales de ERK, expresado como veces de la expresión de p-ERK con respecto a las células transfectadas de manera simulada sin tratar y se expresa como un gráfico
se sabe que la vía ERK /MAPK desempeña un papel importante en la proliferación celular y la supervivencia. Por lo tanto, se realizó un análisis de Western blot para evaluar la activación de ERK, mediante el uso de anticuerpos específicos, ya sea para la forma fosforilada de la molécula o dirigidos contra ERK total. Como era de esperar, en las células transfectadas falsamente la activación de ERK fue inducida significativamente por el tratamiento con KGF (7,5 veces). A la inversa, 5-FU fue capaz de disminuir los niveles de ERK fosforilado (2,5 veces), que fueron casi completamente restaurada por la administración de KGF junto con 5-FU (6,5 veces). En las células transfectadas con siKGFR, de acuerdo con los resultados anteriores, el efecto estimulante de KGF sobre la fosforilación de ERK se inhibió en gran medida (2 veces) (Fig. 6B).
Además, se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con cristal violeta, y su posterior absorbancia a 570 nm, lo que refleja variaciones en el número de células. 48 h después de la transfección, las células fueron tratadas con KGF, 5-FU o una combinación de ellos durante 24 h, como se describió anteriormente. A continuación, las células restantes se fijaron y se tiñeron con 1% de cristal violeta (Fig. 7A). Se comparó el efecto de KGF y 5-FU en el número de células, mirando a la influencia de KGFR silenciar en este proceso. En las células transfectadas de manera simulada tratamiento KGF fue capaz de aumentar el número de células (1,55 veces), 5-FU indujo una disminución de las células viables (0,45 veces), mientras que en presencia de KGF, 5-FU no fue efectivo (1,49 veces). Por otra parte, en las células transfectadas con siKGFR, 5-FU indujo la muerte celular como se esperaba (0,56 veces), mientras que el tratamiento con KGF no fue capaz de inducir un aumento del número de células (0,91 veces). En este caso 5-FU mantiene su capacidad para determinar la muerte celular incluso en presencia de KGF (0,49 veces) (. Graph Fig 7A).
MCF-7 células (A) se falsamente transfectadas o transfectadas con 5 nM siKGFR y 48 h más tarde fueron tratados o no con 20 ng /ml de KGF, 25 mg /ml 5-FU o KGF más 5-FU. Después de 24 h, se fijaron las células, se tiñeron con 1% de cristal violeta y se analizaron a una absorbancia de 570 nm. Los valores de un experimento representativo se expresaron como densidad óptica relativa y se presenta como un gráfico. (B) células MCF-7, cultivadas en cubreobjetos, se transfectaron y se trataron como en (A). Después de 24 h, se fijaron y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia con un anticuerpo dirigido contra la forma escindida de la caspasa-3. Los núcleos se visualizó usando 4 ', dihidrocloruro de 6-diamido-2-fenilindol (DAPI). [49].