Extracto
Antecedentes
La interrupción del nucléolo a menudo conduce a la activación de la vía supresora de tumores p53 a través de la inhibición de MDM2 que está mediada por un conjunto limitado de proteínas ribosomales incluyendo Rpl11 y RPL5. Los efectos de la pérdida de proteína ribosomal en las células de mamífero en cultivo no se han investigado a fondo. A continuación se caracteriza la respuesta al estrés celular causado por el agotamiento de la proteína ribosomal S9 (RPS9).
Metodología /Principales conclusiones
El agotamiento de RPS9 alteración de la producción de ARN ribosomal 18S y la actividad de p53 inducida. Se promovió la diferenciación morfológica dependiente de p53 de U343MGa Cl2: 6 células de glioma como se evidencia por la expresión intensificada de la proteína ácida fibrilar glial y profundos cambios en la forma celular. células de osteosarcoma U2OS muestran una respuesta senescencia limitada con el aumento de expresión de los marcadores de respuesta al daño del ADN, mientras que las células de carcinoma cervical HeLa se sometieron a la muerte celular por apoptosis. Desmontables de Rpl11 deteriorado fenotipos dependientes de p53 en los diferentes RPS9 agota cultivos celulares. Es importante destacar que, desmontables de RPS9 o Rpl11 también inhibió notablemente la proliferación celular a través de mecanismos independiente de p53. Rpl11 unión a MDM2 se mantuvo a pesar de la disminución de los niveles de proteína nucleolar estrés Rpl11 siguientes. En esta configuración, Rpl11 era crítico para mantener la estabilidad de la proteína p53, pero no se requiere estrictamente para la síntesis de la proteína p53.
Conclusiones
p53 juega un papel importante en la restricción inicial de la proliferación celular que se produce en respuesta a la disminución del nivel de RPS9. Nuestros resultados no excluyen la posibilidad de que otras moléculas de estrés detección nucleolar actúan aguas arriba o en paralelo para Rpl11 para activar p53. La inhibición de la expresión de ciertas proteínas ribosomales, como RPS9, podría ser una manera eficaz para reiniciar los procesos de diferenciación o para inducir la senescencia o apoptosis en células de proliferación rápida del tumor
Visto:. Lindström MS, Nister M (2010) Silencing de la proteína ribosomal S9 provoca una multitud de respuestas celulares inhibir el crecimiento de células de cáncer posteriores a la activación de p53. PLoS ONE 5 (3): e9578. doi: 10.1371 /journal.pone.0009578
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 28 Enero, 2010; Aceptado: 11 Febrero 2010; Publicado: 8 de Marzo, 2010
Derechos de Autor © 2010 Lindström, nistro. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue posible gracias al apoyo financiero de ML de los cimientos de Åke Wiberg, el Instituto Karolinska de los fondos y la fundación de la Bergvall Magnus. ML es un receptor de un premio de beca de la Sociedad Sueca del Cáncer (Cancerfonden). El trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de MN, con el apoyo de la Sociedad Sueca del Cáncer, la Sociedad del Cáncer en Estocolmo, el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Sueca del Cáncer Infantil y el Hospital de la Universidad Karolinska FoUU. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ribosoma la biogénesis es un proceso muy complejo en el que cientos de diferentes proteínas cooperan en la síntesis de ARN ribosomal (ARNr), procesamiento, ensamblaje de subunidades del ribosoma y el transporte [1]. Los nucleolos son los sitios reales para la biogénesis de ribosomas, pero estas estructuras también han sido implicados en otros procesos celulares tales como el control del ciclo celular, la replicación viral, la señalización mitogénica, la exportación nuclear de p53, y diferenciación de células madre, revisado en las referencias [1] - [4]. Durante la última década, la conexión entre la proteína p53 supresor de tumores, el nucléolo y la biogénesis de ribosomas se ha consolidado. La expresión de mutantes negativos dominantes de la proteína nucleolar Bop1 dio lugar a defectos en el procesamiento de rRNA desencadenar la detención del ciclo celular p53 inducida por [5]. p53 menudo se activa después de silenciamiento de las proteínas nucleolares o ribosomal (R-proteínas), y los ejemplos incluyen RPL23 [6], RPS6 [7], nucleostemin, [8] y TIF1A [9]. Por otra parte, inhibidores de la síntesis o procesamiento de rRNA tales como actinomicina D y 5-fluorouracilo también activan p53 [10]. En conjunto, estas condiciones se denominan como el estrés o nucleolar ribosomal. La creciente evidencia de una serie de modelos de ratones demuestra la existencia de este punto de control dependiente de p53
in vivo
. Un modelo de ratón reveló que la biogénesis de ribosomas se deteriora después de la eliminación condicional de un alelo de
RPS6
[11]. Curiosamente, la letalidad embrionaria que se produjo durante la gastrulación en estas
RPS6
+/-
embriones fue causado por un punto de control dependiente de p53 en lugar de una disminución general de la capacidad de traducción [11]. deficiencia rpl22 detenido selectivamente el desarrollo de células T alfa /beta-linaje, una respuesta mediada por la activación de p53 [12]. A su vez, la pérdida de p53 restaura el desarrollo de los timocitos rpl22 deficientes.
Se han encontrado mutaciones en diferentes r-proteínas en pacientes que sufren de un síndrome conocido como anemia de Diamond-Blackfan (DBA, MIM#105650), caracterizados por eritropoyesis defectuosa, anomalías congénitas y un mayor riesgo de cáncer [13], [14]. El gen
RPS19
es frecuentemente mutado en DBA [15], pero las mutaciones también se han encontrado en
RPS24
,
RPS17
,
RPL35A
,
RPL5
,
Rpl11
, y
RPS7
[16], [17]. Los modelos animales de DBA se han creado en ratones y pez cebra [18], [19]. Se encontró que la pérdida de
Rps19
es letal embrionaria [20].
Rps19
deficiencia perjudica la biogénesis ribosomal y activa p53 en el pez cebra, y la supresión de p53 y deltaNp63 puede aliviar el fenotipo Rps19 deficientes en este modelo [18]. La pérdida de otros r-proteínas en el pez cebra, como RPS8, Rps11 y rps18 también desencadenó una respuesta p53 [18]. El papel de p53 en ratones DBA sigue sin estar claro, pero es notable que los ratones portadores de mutaciones en
rps19
y
RPS20
tiene un recuento bajo de eritrocitos que se pueden restaurar por la deficiencia de p53 [21].
¿Cómo se activa p53 tras el estrés nucleolar? Varios grupos han demostrado que R-proteínas (Rpl11, RPL5, RPL23 y RPS7) son liberados del nucléolo durante el estrés y luego unirse MDM2 activando de esta manera p53 [6], [22] - [29]. Se encontró posteriormente que el aumento de traducción de 5 'oligopyrimidine terminal (TOP) mRNAs, incluyendo la de
Rpl11
, se produce en respuesta a 40S ribosomal interrumpidos biogénesis subunidad lo que conduce a un aumento en la producción de Rpl11 [30]. De hecho, después de la pérdida de RPS6 o RPL24 el supresor de tumores p53 se activa de una manera dependiente de Rpl11 [30], [31]. Mientras que disminuyó la expresión de algunas proteínas r-p53 puede activar como parte de una respuesta de estrés celular, también es evidente que algunas otras r-proteínas tienen un papel directo y más específicas en
p53
la traducción del ARNm. Haploinsuficiencia de un subconjunto de r-proteínas en el pez cebra se vincula con el desarrollo de tumores de la vaina nerviosa periférica tumores [32]. Curiosamente, estos tumores de la vaina nerviosa no producen la proteína p53, a pesar de la presencia de
p53
ARNm [33]. Por otra parte, Rpl26 juega un papel en la mejora
p53
la traducción del ARNm durante la respuesta al daño del ADN mediante la interacción directa con ambas proteínas MDM2 y
p53
ARNm [34]. Por lo tanto, r-proteínas tienen un papel más dinámico en la regulación de la vía p53 supresor de tumores que antes se pensaba, revisado en [35] - [37].
Recientemente, RPS9 fue identificado como una novela B23 (NPM /nucleofosmin ) que interactúan las proteínas [38]. Disminución de los niveles de RPS9 se asociaron con la acumulación de células en G
1 /(G
0) y la inducción de p21 en células de osteosarcoma U2OS [38]. Aquí nos dispusimos a investigar más a fondo las diferentes respuestas de estrés celular causado por la pérdida de RPS9. El agotamiento de RPS9 provocó una rápida pérdida de la piscina proteína nucleolar, alteración de la producción de 18S ribosomal RNA maduras y activación de la vía supresora de tumores p53. Hemos encontrado que la combinación de una vía de la biogénesis de ribosomas y p53 activación defectuosa como resultado inesperadamente fuerte respuesta anti-proliferativos en las líneas celulares de tumores humanos en que se sometieron a la senescencia, diferenciación o apoptosis tras el agotamiento de RPS9.
Resultados
rápido agotamiento de RPS9 Nucleolares Tras la transfección de siRNA
para fusionar r-proteínas con GFP ha demostrado ser una herramienta útil para visualizar mejor la localización y la facturación de r-proteínas en las células humanas [39], [ ,,,0],40]. U2OS células que expresan GFP-RPS9 habían sido establecidos previamente [38]. En estas células la proteína de fusión RPS9-GFP fue localizado en el nucleolo y el citoplasma. Para entender mejor la dinámica de RPS9 en relación con fenotipos desmontables, usamos células RPS9-GFP U2OS combinados con interferencia de ARN para visualizar desmontables de RPS9 en las células vivas (Figura 1A). La transfección de células U2OS con RPS9 siRNA indicó una rápida rotación de nucleolar RPS9-GFP. Ya 24 horas después de la transfección de una mayoría de las células mostró una pérdida notable de nucleolar RPS9-GFP (Figura 1B). A las 72 horas después de la transfección, la mayoría de las células tenían una señal de GFP detectable solamente en el citoplasma. Utilizando inmunotransferencia RPS9-GFP se detectó como una única banda del tamaño esperado que se disminuyó a siRNA transfección con dos siRNAs RPS9 diferentes#1 y#2, mientras que desmontables con oligo#0 era ineficaz en comparación con el control de siRNA, siCtrl (Figura 1C). La piscina de la proteína GFP-RPS9 citoplasmática se mantuvo durante varios días, de acuerdo con la estabilidad de los ribosomas citoplasmáticos conocidos de mamíferos. Hemos sido capaces de agotar completamente las células de reactividad GFP citoplasmática, que podría ser debido al hecho de que el silenciamiento con siRNA no es 100%, o que una pérdida total de RPS9 no es compatible con la proliferación celular sostenida. Para confirmar aún más la distribución celular de RPS9, las células U2OS se tiñeron con un anticuerpo producido contra RPS9 humana, como se describe [38], y se observó una tinción nucleolar y citoplásmica idénticos. La piscina nucleolar de RPS9 endógeno podría ser rápida y eficazmente silenciado en células U2OS similares a la de RPS9-GFP (Figura S1A), y esto se confirmó por inmunotransferencia (Figura S1B). En resumen, hemos obtenido un agotamiento completo y específico de RPS9 nucleolar utilizando siRNA.
(A) Eficiencia de la caída RPS9-GFP en células U2OS que expresan de forma estable RPS9-GFP utilizando tres diferentes siRNAs dirigidos RPS9 humano. Fotos de células que expresan GFP-RPS9 se tomaron después de 48 horas. (B) Porcentaje de células que expresan U2OS detectable RPS9-GFP en el nucleolo en diversos puntos temporales después de la transfección de ARNsi RPS9-1 o siCtrl. (C) Igual número de células de experimento en (A) se recogió y extractos de células enteras preparada en tampón que contenía 2% de SDS. lisados de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos específicos para EGFP, PCNA, β-actina, y Rpl11 como se indica en la figura.
La inducción de una respuesta limitada senescencia en células U2OS
Interrupción del nucleolo se ve a menudo después de la exposición de las células a una variedad de agentes químicos y físicos que inhiben la transcripción o procesamiento de rRNA [10]. Una inspección minuciosa de nucleolos reveló que permanecieron intactas en respuesta al tratamiento con siRPS9, de acuerdo con estudios en RPS6 [11], [30]. Sin embargo, hemos observado que en nucleolos RPS9 agotan U2OS células fueron contrastadas, redondo, y la fase de alta densidad que en siCtrl células que indican una reorganización de la estructura del nucléolo (Figura S2A) tratados. centros fibrilar denso nucleolar estaban en unas pocas células re-localizados a la periferia del nucleolo como se revela por tinción para fibrillarin, un marcador del compartimiento fibrilar denso del nucleolo. Estos nucleolos se parecían a los nucleolos agrandados observados en las células U2OS agotando de nucleostemin [8], una proteína nucleolar implicados en la biogénesis de ribosomas [41].
Desmontables de acumulación inducida RPS9 de células en G
1 y el aumento de la niveles de p21 en células U2OS [38]. Un examen más cuidadoso de las células reveló que una fracción aparece una senescencia más bien "graves" fenotipo parecido con un citoplasma groseramente expansión que nos lleva a investigar más a fondo esta respuesta particular (Figura 2A). El agotamiento de RPS9 indujo un aumento en el número de células y células con focos nucleares de proteínas sustrato fosfo-ATM /ATR (Figura 2B y C) positivos γ-H2A.X. El análisis reveló un aumento de la senescencia asociados β-galactosidasa-positivo (SA-β-gal) U2OS células a partir de células positivas de 0,4% en las células siCtrl, al 7% en las células transfectadas siRPS9 (Figura 2D).
(A ) Las imágenes de contraste de fase revela la morfología de las células de osteosarcoma U2OS humanas transfectadas con siRNA dirigidos RPS9 o p53. (B-C) Aumento de la expresión de daño en el ADN y los marcadores de estrés de replicación en células U2OS agotadas de RPS9 y se analizaron 72 horas después de la transfección de siRNA. células U2OS se fijaron y tiñeron con un anticuerpo hacia γ-H2AX y un anticuerpo sustrato fosfo-ATM /ATR. (D) La cuantificación de células U2OS positivo SA-β-gal en cultivos agotados de RPS9. Se muestra es un experimento representativo de dos. (E) Las células fueron transfectadas con siCtrl, RPS9, Rpl11, p53, p21 o siRNA como se indica. Las células se incubaron con BrdU en 24 horas después de la transfección durante 24 horas y después las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos anti-BrdU y la media de las células BrdU positivas se muestra (%). (F) Co-agotamiento de Rpl11, p53 o p21 parcialmente deteriorado RPS9 inhibición mediada por caída de la proliferación celular. U2OS células fueron transfectadas con siCtrl, siRPS9, sip53, sip21 o siRPL11 en combinaciones como se indica. La concentración final de siRNA fue de 100 nm en cada caso y la indemnización se hizo con siCtrl. Las células se contaron 72 horas después de la transfección y se muestra es la media y SEM de tres experimentos diferentes realizados por triplicado en ocasiones independientes y normalizado a siCtrl ajustado a 100%. (G) Co-desmontables de Rpl11 inducción atenuada de proteínas p21 y MDM2 causada por desmontables de RPS9. células U2OS fueron transfectadas con combinaciones de siRNA como se indica. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia y la expresión de p53, MDM2, p21, Rpl11, RPL5 y RPS9 se determinó como se indica. El lisado de proteínas de cada muestra se dividió por tres manchas diferentes y cada sondeó con actina como control de carga. (H) U2OS células fueron transfectadas con siRPS9-1 o siRPL11-2 durante 48 horas o tratados con 5 nM actinomicina D durante 18 horas después de lo cual se recogieron las células directamente en SDS al 2% que contiene tampón de lisis. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia utilizando anticuerpos hacia Rpl11 o RPS9 (w.c.e = extracto de células enteras). (I) Co-inmunoprecipitación de MDM2 y Rpl11 en células U2OS transfectadas con siRNA dirigidos RPS9. MDM2 se inmunoprecipitó con anticuerpo N20 seguido por la detección con monoclonal SMP14 o un anticuerpo monoclonal hacia Rpl11. Tenga en cuenta, que se utilizaron diferentes tiempos de exposición para Rpl11 IP y borrones de entrada. (J) células U2OS se transfectaron con siRPS9-1 solo o en combinación con siRPL5-2 durante 72 horas, después de lo cual se recogieron las células y el nivel de p21 como una lectura de la actividad de p53 se analizaron por inmunotransferencia.
Para demostrar formalmente el papel de p53 en la mediación de la inhibición de la proliferación celular U2OS que p53 y RPS9 co-agotado resultante en una reversión del fenotipo de senescencia (Figura 2A y D). Además, Rpl11, p53 o p21 co-agotamiento en las células tratadas-siRPS9 aumento de la incorporación de BrdU en estos cultivos a las 24 horas después de la transfección (Figura 2E), junto con un rescate de la morfología senescencia similar (Figura S3). Quisimos saber cómo este "escapar" de G
1 detención relacionada con el crecimiento celular en el largo plazo, por lo que también investigó la proliferación celular en un momento posterior. Se encontró que siRPS9 cultivos tratados habían crecido 36% (± 9,2), mientras que siRPS9 + sip53 células tratadas habían crecido 52% (± 6,5) en comparación con siCtrl según se evaluó 72 horas después de la transfección (Figura 2F). El silenciamiento de Rpl11 restauró el recuento de células con el nivel observado en las células co-transfectadas con siRPS9 y sip53, pero no pudo restaurar el número de células a la observada en cultivos siCtrl, por lo tanto siRPS9 + siRPL11 tratada células habían crecido 56% (± 4,4) en comparación a siCtrl (Figura 2F). Esto indicó que el silenciamiento de RPS9 o Rpl11 también indujo supresión de la proliferación celular de una manera independiente de p53. Esto fue confirmado por ozono en RPS9 emparejados fibroblastos WI38 y WI38-E6, así como en células de osteosarcoma SAOS2 que carecen de p53 (Figura S1D).
regulación de la respuesta de p53 Desencadenada por la pérdida RPS9 en células U2OS
La disminución de la expresión de RPS9 en células U2OS no marcadamente cambiar los niveles de p53, como se muestra antes de [38], pero indujo un aumento de la proteína p21 que era dependiente de p53 (Figura 2G). La inducción de p21 fue notablemente afectada por las células co-transfección con Rpl11 siRNA (Figura 2G). Desmontables de Rpl11 usando siRPL11-1 dio como resultado niveles más bajos de p53, MDM2, y, en particular, p21, también en condiciones normales en células U2OS (Figura 2G, carril 6). Curiosamente, el agotamiento de RPS9 condujo a niveles más bajos de Rpl11 NP40 soluble (Figura 2G, carril 2), pero la fracción de Rpl11 unido a MDM2 sigue siendo el mismo y no disminuyó (Figura 2I). Queríamos saber si la reducción de Rpl11 también podría ser visto en extractos de células enteras y por lo tanto U2OS células fueron transfectadas con siRPS9 o incubadas en 5 nM actinomicina D durante 18 horas. Esta concentración de actinomicina D bloquea selectivamente la actividad de ARN Pol I y evita la biogénesis de ribosomas. Pudimos confirmar los resultados obtenidos cuando se utiliza el tampón de lisis más suave también en extractos de células enteras que muestran por lo tanto disminución de los niveles totales de Rpl11 (Figura 2H). La mayor parte de los estudios en el campo se han basado en el silenciamiento Rpl11 usando uno de siRNA particular, así que nos pareció de importancia para comparar con Rpl11 RPL5. Se encontró que el agotamiento de RPL5 podría bloquear la inducción de p21 idéntica a Rpl11 en las células RPS9 empobrecido (Figura 2J). El silenciamiento de Rpl11 con morfolinos induce una respuesta de apoptosis dependiente de p53 en el pez cebra [42], y que, por tanto, no quiero descartar que Rpl11 y RPL5 pérdida puede, en cierta medida induce la actividad de p53 o participar relacionados con las vías de p53
in vivo
. También hicimos otra observación del experimento en la figura 2G. En primer lugar, la caída de Rpl11 causó una disminución en el nivel de proteína RPL5 en la misma medida como para Rpl11 (Figura 2G, carril 6). Esto es presumiblemente porque 28S rRNA no se procesa de manera eficiente en Rpl11 o rpl5 células deficientes [43] conduce a un exceso de subunidad grande r-proteínas que se degrada rápidamente [44]. Recientemente se ha demostrado por otros grupos que el agotamiento de una r-proteína individual de uno Resultados de subunidades de ribosomas en la baja regulación de otras proteínas de la misma subunidad [45]. Este hallazgo podría tener implicaciones en cuanto a porqué la regulación de MDM2 por varias proteínas ribosomales parece ocurrir de manera no redundante, pero esto no puede ser la única explicación, porque entonces nos encontraríamos con que desmontables de casi todos los r-proteína puede bloquear p53 de estabilización que no vemos. En resumen, llegamos a la conclusión de que se requiere Rpl11 para la inducción eficaz de respuestas dependientes de p53 en células U2OS RPS9 agotado.
¿Es Rpl11 Requerido para p53 mRNA de traducción tras el estrés Nucleolares?
¿Cómo Rpl11 p53 control? La unión de Rpl11 y RPL5 directamente a la proteína MDM2 conduce a la estabilización de p53 a través de la inhibición de MDM2 E3 ubiqutin actividad ligasa [46]. Sin embargo, otros informes indican también un papel crítico para el R-proteínas en
p53
la traducción del ARNm [33], [47]. Por otra parte, la importancia de la interacción entre MDM2 y Rpl11 /RPL5 en términos de posibles efectos sobre la
p53
la traducción del ARNm se ha mantenido un tanto confusa. Esto podría ser relevante para investigar desde MDM2 puede impulsar
p53
la traducción del ARNm como se ha descrito que se produzca en algunos lugares [48], [49]. De hecho, se sugirió que las interacciones entre Rpl11 /RPL5 y MDM2 pueden servir a un doble propósito de inhibir la actividad de la ligasa E3 MDM2, y promover
p53
ARNm traducción, al mismo tiempo [48], [49]. Por otro lado, MDM2 se une a e inhibe Rpl26 Rpl26 mediada por la estimulación de la traducción del ARNm de p53 [15]. Por lo tanto, decidimos volver a visitar p53 vida media y la degradación e investigar
p53
la traducción del ARNm tras el estrés nucleolar en células U2OS con y sin Rpl11. En primer lugar, se realizó un ensayo de vida media de la proteína p53 para confirmar el aumento de la estabilidad de p53 después de una dosis baja exposición actinomicina D para inducir estrés nucleolar. De hecho, un aumento robusto en la cantidad y la estabilidad de la proteína p53 se observó, y, esencialmente, muy poco, si alguno, la degradación de p53 se produjo en actinomicina D células tratadas durante la persecución 4 hora (Figura 3A). En contraste, la mayor parte de la proteína p53 en DMSO tratada células de control se degradó después de menos de una hora en cicloheximida (Figura 3A). A continuación, las células transfectadas con U2OS control o siRPL11 durante 24 horas y el próximo trataron todos los transfectantes con 5 nM actinomicina D durante la noche seguido de una persecución de CHX. La carga se ajustó para dar una cantidad comparable de partida de p53 para facilitar una comparación directa. p53 fue claramente más inestables en células U2OS Rpl11 empobrecido (Figura 3B). p53 residual estable en muestras siRPL11 en momentos posteriores, probablemente se deriva de una población de células que han respondido a la actinomicina D, pero que no han sido transfectadas con siRPL11. Seguidamente, razonó que las pequeñas moléculas que interrumpen la unión de p53-MDM2, bloquean la transcripción MDM2 o prevenir la degradación de p53 por el proteasoma lo que provoca la acumulación de p53 por "default" actuaría de forma independiente de cualquier interacción proteína ribosomal-MDM2. Por lo tanto, las células tratadas con U2OS Nutlin-3. El compuesto Nutlin-3 interrumpe la interacción p53-MDM2, pero no impide la unión de MDM2 a p53 mRNA [48], [49]. Células transfectadas con dos oligos RPL5 siRNA diferentes durante la noche seguido por tratamiento de células con 5 nM actinomicina D o 10 mM Nutlin-3 durante 18 horas adicionales (Figura 3C). Cada uno de los dos RPL5 siRNAs podría inhibir eficazmente la acumulación de p53 después de 5 nM actinomicina D, y, en particular, se disminuyó la inducción de p21 (Figura 3C, carril 3 y 4). Por el contrario, el efecto sobre los niveles de proteína p53 y p21 cuando se agota RPL5 en presencia de Nutlin-3 era marginal cuando se normaliza a la actina. Por lo tanto RPL5 no era necesario para la estabilización de p53, así como la inducción de MDM2 y proteínas p21, en Nutlin-3 células tratadas. El próximo querían ver si se requieren otros subunidad pequeña r-proteínas incluyendo RPS9 para la estabilización de p53 tras el tratamiento actinomicina D. Estamos agotados de células RPS6, RPS9, RPS17 y RPS24 pero silenciamiento de estas proteínas no bloqueaba la estabilización de la proteína p53 causada por la actinomicina D (Figura 3D). Esto demuestra que Rpl11 pero no RPS9 juega un papel crítico en la respuesta de p53 tras la actinomicina D tratamiento.
(A) U2OS células fueron tratadas con 5 nM actinomicina D durante 18 horas o DMSO solamente seguidas de una persecución de cicloheximida ( CHX) para estimar las tasas de degradación de proteína p53. Los lisados celulares de cada punto de tiempo se sometieron a inmunotransferencia y la expresión de p53 determinados en relación con los niveles de actina. (B) las células U2OS se transfectaron con siCtrl o siRPL11 durante la noche seguido por tratamiento con actinomicina D durante 18 horas. Esto fue seguido por Chase CHX como anteriormente durante el tiempo indicado. En este caso, la carga se ajustó para dar importes de partida comparables de análisis de p53 de facilitación de degradación que es más rápido en las células transfectadas Rpl11. células U2OS (C) fueron transfectadas con siRNAs RPL5 la orientación o con siCtrl. Las células se trataron después con Nutlin-3 (10 mM) o actinomicina D (5 nM) durante 18 horas. La membrana de transferencia se sondó para RPL5, MDM2, p53 y p21. (D) El agotamiento de las proteínas ribosomales RPS6, RPS9, RPS17 y RPS24 no impide la acumulación de p53 y la inducción de p21 tras el tratamiento actinomicina D, pero el agotamiento de Rpl11 lo hizo. células U2OS fueron transfectadas con siRNA indicada durante 18 horas seguido de tratamiento con actinomicina D (5 nM) durante otras 18 horas y los niveles de expresión de p53 y p21 se midió por inmunotransferencia. (E) la síntesis de p53 en actinomicina D células tratadas con o sin siRPL11. p53 total y Rpl11 se muestra por inmunotransferencia y p53 recién sintetizado se inmunoprecipitó con anticuerpo DO1 y se visualizaron por autorradiografía. El experimento se llevó a cabo 36 horas después de la transfección de ARNsi. (F) Evaluación de la traducción del ARNm de p53 en células U2OS empobrecido de Rpl11, RPS9, RPS9 + Rpl11, o en células tratadas con actinomicina D (5 nM) en presencia o ausencia de Rpl11 siRNA. Se muestra la cantidad de p53 sintetizada de nuevo durante 15 minutos con respecto a la cantidad total de p53, y se compara con el nivel de proteína en general como se detectó con Ponceau S. El experimento se llevó a cabo 36 horas después de la transfección de siRNA.
por último, hemos querido investigar la síntesis de nuevas proteínas p53 en condiciones de exposición actinomicina D o después de silenciar RPS9, en presencia o ausencia de siRPL11. Hemos marcado U2OS células durante 15 minutos y se utiliza para controlar la inmunoprecipitación de p53 p53 total y recién sintetizado, pero no encontramos ninguna indicación de que se requiere Rpl11 para la síntesis de la proteína p53 en este entorno experimental (Figura 3E y F). Un incremento marginal en la nueva proteína p53 se podía ver en la actinomicina D células tratadas (Figura 3E), pero la interpretación de esto es difícil porque la actinomicina D también puede estabilizar la piscina de p53 sintetizada de nuevo, y los niveles generales de traducción fue ligeramente mayor en esta muestra. Los resultados tomados todos juntos apoyar la idea de que Rpl11 controla predominantemente p53 en un nivel posterior a la traducción y que Rpl11 no sea estrictamente necesario para la síntesis de p53 en esta configuración experimental particular, sino un efecto de menor importancia adicional en la producción de p53 no se descarta.
RPS9 silencios en deteriora Producción de 18S rRNA e induce p53 en células de glioma
hasta ahora, la mayoría de los estudios sobre la señalización de la proteína p53 ribosomal se han llevado a cabo en células U2OS y no queda claro si, o en qué medida, este mecanismo de regulación funciona en otros tipos de células. Se encontró que RPS9 endógeno podría ser silenciado de manera eficiente en U343MG y en células de glioma U87MG mientras que ningún cambio en la expresión RPS9 se observó en las células U1242MG sobre siRPS9 transfección (Figura 4A). Es de destacar, es el ya bajo nivel de RPS9 en las células no tratadas U1242MG. Una clara reducción en el número de células en los cultivos tratados con siRPS9 en relación con siCtrl cultivos tratados se observó para U87MG, U343MG, y U343MGa Cl2: 6 células, pero no para U1242MG (Figura 4B). Como control adicional especificidad, se verificó que el oligonucleótido RPS9 siRNA no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular de ratón NIH3T3 mientras que un siRNA oligo rps9 ratón inhibe eficazmente la proliferación de estas células (Figura S1c). Para evaluar el efecto de la caída RPS9 en la síntesis de 28S y 18S rRNA maduros etiquetamos desmontables y controlar U343MGa Cl2: 6 células con [
3H] -uridine durante 2 horas y se examinó el rRNA marcado y aislado después de la electroforesis en gel y transferencia a una membrana de nylon. Se encontró que en las culturas desmontables RPS9 muy poco 18S rRNA maduros se produjo durante el período de marcado (Figura 4C), sin embargo en general la síntesis de ARN celular continua (Figura 4D). Actinomicina D (5 nM) bloqueó eficazmente la síntesis y el etiquetado de rRNA (Figura 4C y D). En un experimento utilizando rRNA [
3H] -L-metionina de metilo para etiquetar recién sintetizado, se encontró que la producción de 18S rRNA fue claramente afectada (Figura 4E). Hubo una disminución marginal en la nueva síntesis de 28S rRNA. Además, el agotamiento de RPS9 en U343MGa Cl2: 6 células disminuyó la incorporación global de [
35S] metionina en la proteína naciente en un 30-50% (Figura 4F). El mecanismo de mantenimiento de la síntesis de rRNA en altos niveles a pesar de la activación de p53 que queda por determinar. Según lo sugerido por otros, esto podría ser un mecanismo compensatorio general, en respuesta a una deficiencia en los ribosomas [50].
(A) RPS9 desmontables eficiencia en líneas celulares de glioma U87MG, U343MG y U1242MG como se determinó por inmunotransferencia para RPS9 relativa a la actina. (B) Las líneas celulares del experimento realizado en (A), y U343MGa Cl2: 6 células, se transfectaron con siCtrl o siRPS9-1 y después de 72 horas, el número de células viables en relación con las células tratadas siCtrl establece en 100% se determinó por cada línea celular. Para este ensayo, un número igual de células se sembraron por triplicado en día 0, y cultivos transfectados en día 1, y luego se tripsinizaron y se contaron 72 horas más tarde. (C) El ARN total a partir del experimento en (C) se separó en un gel de agarosa-formaldehído 1%, se transfirieron a membranas de nylon y se sometieron a autorradiografía. 18S rRNA está indicado recientemente sintetizado, mientras que el nivel total de 18S rRNA transferido a la membrana se visualizó mediante tinción con azul de metileno. Actinomicina D a una concentración final de 5 nM se añadió 3 horas antes de etiquetado y sirvió como control para la inhibición de la transcripción de ARNr. (D) U343MGa Cl2: 6 células fueron transfectadas con siRNAs tal como se indica y después de 72 horas las células se marcaron con [
3H] -uridine durante otras 2 horas. incorporación radioactiva se midió mediante recuento de centelleo líquido y se expresa como cpm /g ARN total y luego se normaliza al nivel en las células transfectadas siCtrl establece en 100%. Los resultados presentados son promedios y SEM que representan tres experimentos diferentes. (E) U343MGa Cl2: 6 células transfectadas con siRPS9-1 o siCtrl durante 72 horas, se incubaron con [metil-
3H] -L-metionina durante 2 horas para etiquetar los precursores rRNA de nueva síntesis, seguido de aislamiento de ARN total. Igual cantidad de RNA total fueron siguiente separaron en un gel de agarosa-formaldehído 1%, se transfirieron a membranas de nylon, y se sometieron a autorradiografía. 18S rRNA recién sintetizados se indica (panel izquierdo) y el total de 28S y 18S rRNA transferida a la membrana se visualizó mediante tinción con azul de metileno (panel derecho). Un asterisco indica la acumulación aparente de un ARNr precursor intermedio. (F) U343MGa Cl2: 6 células transfectadas con siRNAs durante 72 horas como se indica se marcaron con metionina [
35S]. Las células fueron privadas de metionina y cisteína durante 30 min antes de la adición de metionina [
35S]. Después de 2 horas de etiquetado para los extractos de proteínas fueron preparados. incorporación radioactiva se midió mediante recuento de centelleo líquido y se expresa como cpm /mg de proteína total y luego se normalizó a las células de control establecidos en el 100%. Los resultados presentados son promedios y SEM que representan tres experimentos diferentes.