Extracto
Las propiedades quimioprotector de sulforafano (SF), derivados de los vegetales crucíferos, se reconoce ampliamente que surgen de su potente inducción de xenobióticos-metabolización y enzimas antioxidantes. Sin embargo, se sabe mucho menos sobre el impacto de la ciencia ficción sobre la eficacia de la terapia del cáncer a través de la modulación de enzimas que metabolizan los fármacos. Para identificar las proteínas moduladas por una baja concentración de SF, se trataron células HT29 de cáncer de colon con 2,5 M SF. cambios de abundancia de proteínas se detectaron mediante el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular. Entre 18 proteínas que se encuentran a ser significativamente hasta reguladas, aldo-ceto reductasa 1C3 (AKR1C3), bioactivar el ADN de entrecruzamiento profármaco PR-104A, se caracterizó adicionalmente. Preacondicionamiento células HT29 con SF redujeron la CE
50 de la PR-104A de 3,6 veces. El aumento de la citotoxicidad PR-104A estaba vinculada a la abundancia AKR1C3 y actividad, tanto inducida por SF en una forma dependiente de la dosis. Este efecto fue reproducible en una segunda línea de células de cáncer de colon, SW620, pero no en otras líneas celulares de cáncer de colon, donde la abundancia y actividad AKR1C3 estaban ausentes o apenas detectables y no podía ser inducida por SF. Curiosamente, SF no tuvo influencia significativa sobre la citotoxicidad PR-104A al no canceroso, inmortalizado líneas celulares epiteliales de colon humanas que expresan niveles bien altos o bajos de AKR1C3. En conclusión, la respuesta mejorada de la PR-104A después de acondicionamiento previo con SF fue evidente sólo en las células cancerosas, siempre que AKR1C3 se expresa, mientras que su expresión en células no cancerosas no han suscitado una respuesta. Por lo tanto, un subconjunto de los cánceres pueden ser susceptibles a los tratamientos de los componentes y de profármacos derivados de alimentos combinados con ningún daño a los tejidos normales
Visto:. Erzinger MM, Bovet C, Hecht KM, S Senger, Winiker P, N Sobotzki , et al. (2016) El sulforafano Preacondicionamiento sensibiliza a las células del cáncer de colon humanos hacia el bioreductive contra el cáncer profármaco PR-104A. PLoS ONE 11 (3): e0150219. doi: 10.1371 /journal.pone.0150219
Editor: Douglas Thamm, Universidad del Estado de Colorado, Estados Unidos |
Recibido: 26 Octubre, 2015; Aceptado 10 de febrero de 2016; Publicado: 7 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Erzinger et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos se encuentran dentro del papel y presenta su información de apoyo
Financiación: Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (136.247), www.snf.ch.
Conflicto de intereses: los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
medicamentos contra el cáncer a menudo se asocian con efectos secundarios graves que limitan el potencial de dosificación, por lo tanto, profármacos que requieren bioactivación en las células diana son perseguidos activamente como una estrategia para promover selectividad terapéutica [1]. Para diferenciar aún más entre las células diana y no diana, en particular para profármacos activados por enzimas, un enfoque alternativo novela es a las células cancerosas condición previa con cantidades no tóxicas de un compuesto bioactivo natural para mejorar selectivamente de forma segura sensibilidad a los medicamentos [2]. Estos compuestos a menudo hasta de regular las enzimas metabolizadoras de fármacos que bioactivar drogas, por lo tanto, a pesar de las exposiciones bajas, que pueden afectar significativamente los resultados de la terapia [3]. A diferencia de las interacciones fármaco-fármaco, rara vez se han abordado los cambios modulada por los alimentos en el metabolismo de fármacos que influyen en la eficacia de los fármacos en la terapia del cáncer.
Los isotiocianatos, como el sulforafano (SF) se derivan de las verduras crucíferas, son biodisponibles en el colon [ ,,,0],4], y modular la expresión génica de un gran número de xenobióticos-metabolización y enzimas antioxidantes [4-6]. En gran medida, este proceso está mediado por el factor relacionado-2 factor de transcripción factor nuclear eritroide 2 (Nrf2) [7]. La influencia de SF en la transcripción de genes y la expresión de la proteína se ha caracterizado en modelos de roedores y líneas celulares humanas de origen de tejido diferente [8-18], incluidos los cuatro estudios, con enfoques proteómicos [14, 16-18]. SF reacciona con residuos de cisteína de la Nrf2 represor Keap1, lo que resulta en la translocación nuclear de Nrf2 y de unión del factor de transcripción al ADN [7]. La expresión génica está afectado principalmente por genes que codifican para enzimas que metabolizan xenobióticos [14-18] de fase II y enzimas de desintoxicación, sino también enzimas NADPH-regeneración celular, antioxidantes, o. La mayoría de las aplicaciones de traslación de SF objetivo para explotar el potencial para la desactivación de la regulación electrófilos y especies reactivas de oxígeno en las células sanas o pre-malignas para la prevención del cáncer [15, 19].
Mientras SF o altos niveles de Nrf2 pueden contribuir a quimio-resistencia [7, 20], también se ha observado la relación opuesta, con diferencias clave son el mecanismo de acción del fármaco y características de las células [21]. ejemplos más conocidos implican una función terapéutica directa de SF de una manera similar a la droga, sin embargo, existe un conocimiento limitado respecto a las influencias de las concentraciones no tóxicas, bajos de SF potencialmente alcanzados por la dieta. Un proceso de especial relevancia es la forma en la activación transcripcional de enzimas activadoras de la droga puede promover la acción de profármacos de cáncer. En este sentido, se ha observado que cuando las células cancerosas (TD47D de mama) fueron tratados con SF, NAD (P) H: quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), un activador de la mitomicina C (MMC), se indujo y las células fueron sensibilizados a MMC [22]. En un estudio de seguimiento, fumarato de dimetilo se utiliza como inductor NQO1, y los resultados iniciales fueron confirmados SF
in vivo
. Es importante destacar que no hubo aumentos observados en las toxicidades adversas, motivando un mayor estudio de la forma en la inducción enzimática dieta puede tener un impacto relevante actividad profármaco [23]. Estos datos, junto con la biodisponibilidad establecido de SF en el colon humano, nos sugieren la relevancia de la caracterización de cambios en todo el proteoma en células de cáncer de colon humanas expuestas a dosis no tóxicas de SF usando etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC) [24], un enfoque de etiquetado metabólico que permite la cuantificación de miles de proteínas con alta precisión y sensibilidad [25].
PR-104A es el metabolito profármaco de la dinitrobenzamida mostaza pre-profármaco PR-104 (Fig 1) [26-29]. En estudios anteriores, la enzima reductasa aldo-ceto (AKR) 1C3 se ha establecido para mediar la activación aeróbica de la PR-104A [29, 30]. Esta enzima es un miembro de la superfamilia de enzimas AKR, compuesto de las enzimas reductasa ketosteroid que regulan la producción de andrógenos, estrógenos, progestinas y [31] y su expresión está regulada por la Nrf2 /Keap1-vía [29]. PR-104 ha estado involucrado en una serie de los primeros ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer [32-35], sin embargo, no se ha informado de un posible efecto beneficioso de la expresión de la enzima inducida químicamente sobre la citotoxicidad PR-104A.
En vivo
, PR-104 se hidroliza a PR-104A, que se reduce aún más a los metabolitos que se forman ICL citotóxicos.
para determinar la influencia de una baja concentración de SF que podría ser explotado para la modulación de la eficacia del fármaco, se analizaron los cambios en todo el proteoma sobre SF preacondicionamiento en células de cáncer de colon HT29 por SILAC [24]. Sobre la base de estos datos, formulamos la hipótesis de que la actividad PR104A puede ser promovido en las células cancerosas. Por lo tanto, hemos probado el impacto de SF preacondicionamiento sobre la citotoxicidad PR-104A en estas y varias otras líneas celulares de cáncer de colon establecido y comparación con las células inmortalizadas pero normales diploides humanas de colon epiteliales (HCEC) como un modelo para el tejido de colon sano. Una gama de datos de la captación celular, la abundancia de la enzima, la actividad en diferentes tipos de células y knock-down ensayos sugieren un modelo que implica la sensibilización promovido-SF sobre la base de un aumento de la abundancia de proteínas AKR1C3 y la actividad, y las características celulares que favorecen la interacción positiva.
Materiales y Métodos
Materiales
medio de cultivo celular y los suplementos fueron de Invitrogen (Life Technologies) y los productos químicos de Sigma Aldrich, si no se especifica lo contrario. Las soluciones madre de R-sulforafano (LKT Laboratories) y PR-104A (Proacta) se prepararon en DMSO, clorambucil en etanol. NADPH era de Calbiochem. Coumberone fue generosamente proporcionado por el Prof. Dalibor Sames (Universidad de Columbia, Nueva York, EE.UU.) y SN34037 por el Prof. Bill Wilson y el Dr. Adrian Blaser (Centro de Cáncer de Auckland Sociedad de Investigación de la Universidad de Auckland, Nueva Zelanda). EN-TARGETplus humano AKR1C3 siRNA (SmartPool) y ON-TARGETplus piscina no director siRNA se obtuvieron de Dharmacon (Thermo Scientific). Se utilizó lipofectamina RNAiMAX reactivo de transfección (Life Technologies) para la transfección de siRNA de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Células y condiciones de cultivo
HT29 Se obtuvieron células de la Leibniz-Institut DSMZ GmbH en enero de 2012. células SW620, SW480, HCT116 y GP2d, que se describe en [36, 37], se obtuvieron del Instituto de Biología Molecular de Investigación del cáncer (Universidad de Zurich, Suiza) en octubre de 2013 y visado de la compañía Microsynth (Balgach, Suiza) utilizando tándem corto repetir de perfiles en enero de 2015. HT29, se cultivaron las células SW620 y GP2d en DMEM, SW480 células se cultivaron en células medianas y HCT116 RPMI-1640 se cultivaron en medio de McCoy. Todos los medios se complementaron con 10% (v /v) de suero bovino fetal y 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. HCEC clones se obtuvieron en agosto de 2011 (HCEC1CT) y agosto de 2013 (HCEC2CT) y se cultivaron en condiciones se informó anteriormente, pero bajo la normoxia [38]. Todas las líneas celulares con regularidad se han confirmado para ser libres de micoplasma. Para los experimentos de SILAC, se cultivaron células HT29 en lisina y arginina DMEM libre (Silantes) que fue bien complementado con lisina 0,219 mM (Lys0) y arginina 1,14 mM (arg0) para el medio de la luz (L), mientras que el medio pesada (H) se complementó con mM [
13 C
6
15 N
2] 0,219 lisina (Lys8) y 1,14 mM [
13 C
6
15 N
4] - arginina (Arg10). Para una incorporación completa de los aminoácidos marcados con isótopos, las células fueron cultivadas durante un total de 24 duplicaciones de la población de células (seis pasajes, duplicaciones de la población de células 4 cada uno) en un medio de SILAC antes del experimento. 24 h después de la siembra, las células cultivadas en medio luz SILAC se trataron con 0,1% (v /v) de DMSO y las células cultivadas en medio SILAC pesada fueron tratados con 2,5 M SF durante 48 h. Todas las muestras de células se prepararon por triplicado.
Protein Extraction
Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, y se incubaron a 4 ° C durante 15 min con tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris 50 mM HCl, EDTA 1 mM, pH 7,4) que contienen inhibidores de la proteasa (Complete Mini, Roche Diagnostics). El lisado se sometió a ultrasonidos y se centrifugó, la concentración de proteína determinada por ensayo de BCA (Thermo Fisher Scientific), y las muestras se almacenó a -80 ° C.
SILAC
La digestión de proteínas, el análisis de espectrometría de masas de muestras de SILAC y análisis de la bioinformática se realizó mediante la adaptación de los métodos estándar (ver más información sobre el método establecido para este estudio en S1 Apéndice).
AKR1C3 actividad
coumberone sustrato AKR1C se utilizó como sonda de la actividad junto con una AKR1C3 específica inhibidor (SN34037) por modificación del método descrito en [30]. En placas de 96 pocillos para cada muestra, se añadieron 40 g de proteína total de tampón de ensayo (tampón de 100 mM KPO4 [pH 7] que contiene 250 mM NADPH) con o sin 1 SN34037 mu M, y se incubaron 60 min, 37 ° C. La reacción se inició con coumberone (30 mM final; [v /v] DMSO 5%). La emisión de fluorescencia, debido a la formación de coumberol, a 510 nm (385 nm de excitación) se registró en un lector de placas PRO M200 infinito (Tecan) a 37 ° C. AKR1C3 actividad se calculó como ΔRFU /min durante 60 minutos (el metabolismo coumberone completa en la figura S1). Las mediciones realizadas por duplicado con los triplicados biológicos; análisis estadístico (valores medios, la prueba t de Student) realizó utilizando GraphPad Prism 6.
Análisis Western Blot
Los lisados celulares se separaron en gel de NuPAGE® 4-12% Bis-Tris a 200 V durante 45 minutos en 1X NuPAGE® MES SDS funcionamiento de amortiguación (Life Technologies) y se transfirieron electroforéticamente a membrana Amersham Hybond-P PVDF (GE Healthcare) a 30 V durante 60 min en tampón de transferencia NuPAGE® 1X (Life Technologies). Las membranas de PVDF se bloquearon con 5% -leche-TBST a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con anticuerpo anti-AKR1C3 policlonal de conejo (1: 2'000, Thermo Scientific), seguido de incubación con anticuerpo anti-conejo IgG HRP (1: 5'000, GE Healthcare). La proteína se detectó mediante un Pierce® ECL Western Blot sustrato (Thermo Scientific). membranas tratadas se expusieron a película de rayos X. La membrana fue despojado, se incubaron con anticuerpo anti-actina (1: 1'000, Sigma Aldrich) y se analizaron de nuevo. Las bandas de proteína se cuantificó con el software ImageJ [39], y se ajustaron para el control correspondiente actina carga
Droga citotoxicidad
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (HT29, HCEC, SW480:. 1 '500 células /pocillo; SW620: 1'000 células /pocillo; HCT116: 500 células /pocillo; GP2d: 5'000 células /pocillo). 24 h más tarde las células se expusieron a 2.5 M SF (HCT116 excepción: 1 M) que corresponde a un IC
10 o 0,1% (v /v) de DMSO. Después de 48 h, se eliminó el medio y se añadieron concentraciones crecientes de fármaco en medio fresco. 24 h después se sustituyó el medio por medio fresco. 72 h más tarde la viabilidad celular se ensayó usando el Cell CellTiter-Glo® luminiscente de viabilidad de ensayo (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El experimento se realizó por triplicado. Todos los valores de luminiscencia se normalizaron respecto a las células tratadas con vehículo. Las curvas de dosis-respuesta se ajustaron mediante una función de regresión no lineal en GraphPad Prism análisis 6. estadístico se realizó mediante la prueba F adicional de suma de cuadrados para probar si las curvas de dosis-respuesta en el control y las células pretratadas-SF estadísticamente diferentes entre sí.
PR-104A citotoxicidad con células siAKR1C3
HT29 fueron sembradas en placas de 6 pocillos (90'000 células /pocillo) y dejó que se unieran. 24 h más tarde fueron expuestos a siAKR1C3 (120 pmol) y 2,5 M SF o 0,1% de DMSO al mismo tiempo. Después de 48 h, se eliminó el medio y se añadieron tres concentraciones de PR-104A (0, 25, 100 M) en medio fresco. 4 h después de la adición del fármaco, se retiró el medio y un ensayo de supervivencia clonogénico se realizó de acuerdo con protocolos estándar [40]. Después de dos semanas de incubación, las colonias se tiñeron con tinción de Giemsa y se contaron. Como control, se utilizó la orientación no-siRNA (120 pmol). El experimento se realizó por triplicado. Los análisis estadísticos (prueba t no apareado con corrección de Welch) se realizaron utilizando GraphPad Prism 6.
SF Uptake
concentraciones intracelulares SF en HT29 y las células HCEC1CT se midieron mediante el ensayo de ciclocondensación HPLC acoplada ( reacción con 1,2-bencenoditiol), como se describe anteriormente (más detalles en S1 Apéndice) [41].
resultados
Influencia de SF sobre la expresión génica en células de cáncer de colon HT29
SILAC se utilizó para investigar cambios en los niveles de abundancia de proteínas celulares tras el tratamiento con una baja concentración de SF en células de cáncer de colon HT29. Después del tratamiento con 2,5 M SF durante 48 h, que corresponde a un IC
10 en las células HT29 (S2 FIG); se identificaron 23 proteínas diferencialmente abundantes (Fig 2; Tabla 1). Se encontró un predominio de proteínas implicadas en los procesos metabólicos y redox celulares para ser enriquecido, y enzimas caracteriza anteriormente para mediar la activación de profármacos reductoras, tales como AKR1C3, PTGR1, y NQO1 estaban entre este grupo [22, 29, 42-44] . El mayor cambio veces fue evidente para ciclina D1-proteína de unión 1, un regulador negativo de la activación de la transcripción que implica los factores de transcripción E2F [45], mientras que varios metabólicos y proteínas redox de regulación regulados por el factor de transcripción Nrf2, incluyendo AKRs y un aldehído deshidrogenasa, se incrementó en un 4,6 veces o más. El gran cambio en la abundancia de AKR1C3 (7 veces), previamente implicado en la activación de PR-104A, invoca la posibilidad de sensibilización de drogas. Por lo tanto, nos centramos nuestros esfuerzos adicionales en la aclaración de cualquier interacción SF-PR104A y contribuciones de AKR1C3 como una base molecular. Una lista completa de todas las proteínas cuantificadas en el experimento SILAC, incluyendo su relación H /L normalizada, se proporciona en la Tabla S1.
2.653 proteínas (negro y gris) se cuantificaron y se prueba para la significación. Entre las 23 proteínas reguladas de manera significativa (negro), 18 fueron reguladas y 5 las reguladas en abundancia.
Para confirmar de forma independiente el aumento en la abundancia aparente AKR1C3 en el estudio de SILAC, Western se realizó análisis de transferencia y se encontró que AKR1C3 abundancia fue inducida en células HT29 de una manera dependiente de la dosis SF (Fig 3A). Para confirmar mayor actividad AKR1C3 en lisados de HT29, se utilizó una versión modificada de un método descrito previamente para medir la actividad específicamente AKR1C3 en células intactas, con la participación coumberone como sustrato para los cuatro miembros de la familia AKR1C, y el SN34037 inhibidor AKR1C3 específico [30 ]. Similar a los niveles de proteína, la actividad AKR1C3 aumentó de una manera dependiente de la dosis en las células HT29 (Fig 3A).
niveles de actividad AKR1C3 y proteínas se muestran en (a) para las células HT29 y en (e) para las células HCEC1CT tratada 48 h con SF o DMSO (control). Las barras representan los valores medios y las barras de error son los errores estándar. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareado con corrección de Welch. Los experimentos se realizaron por triplicado. (*:
p Hotel & lt; 0,05; RFU = unidades relativas de fluorescencia). La modulación de la viabilidad celular se muestra para HT29 en (b) y para HCEC1CT en (f) después de las células se incubaron 48 h con 2,5 M SF o 0,1% de DMSO (control) y se incubaron con concentraciones crecientes de PR-104A. Los datos mostrados son los valores medios ± SD de cuatro (HT29) o tres (HCEC1CT) réplicas biológicas. Se llevó a cabo una prueba F adicional de suma de cuadrados para probar si las curvas de dosis-respuesta estadísticamente diferentes entre sí. El p-valores resultantes muestran que la respuesta SF impacta significativamente fármaco en las células HT29, y no tiene ningún efecto significativo en las células HCEC1CT. (C) la supervivencia clonogénico ensayo que muestra aumento de la supervivencia de HT29 tratadas con siRNA contra AKR1C3 en comparación con células tratadas con no director siRNA después del tratamiento PR-104A para 4 h. Las células se pretrataron durante 48 h con 2,5 M SF junto con siRNA. Cada punto de datos representa tres experimentos independientes. Las barras de error muestran SD de la media. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareado con corrección de Welch; **:
p Hotel & lt; 0,01, ***:
p Hotel & lt; 0.001. (D) Transferencia Western que muestra los niveles de proteína AKR1C3 en células HT29 tratadas con siRNA no director o siAKR1C3 con o sin tratamiento simultáneo SF (= control de DMSO al 0,1%).
Impacto de la mediada por SF AKR1C3 inducción sobre la toxicidad del fármaco en células de cáncer de colon HT29
Hemos encontrado que por el preacondicionamiento de las células HT29 con 2,5 M SF durante 48 h, seguido de tratamiento con dosis crecientes de PR-104A, una disminución de 3,6 veces significativo en el CE
50 de la droga se observó (figura 3B; Tabla 2;
p Hotel & lt; 0,0001). Las concentraciones más altas de SF fueron probados para la preparación del vehículo, pero el aumento de la toxicidad del tratamiento previo en sí impidieron el uso adicional de estas concentraciones más altas de SF. Como control, esta interacción se comparó con la influencia de SF preacondicionamiento sobre la citotoxicidad de clorambucilo (CBL), un fármaco contra el cáncer que también forma de ADN entre hebras enlaces cruzados (ICL), pero no depende de bioactivación enzimática. Como era de esperar, la citotoxicidad de CBL se mantuvo sin cambios (Tabla 2).
Para confirmar si el aumento de los niveles de abundancia AKR1C3 debido a SF preacondicionamiento del HT29 son responsables del aumento de la citotoxicidad de la PR-104A, se realizó ARN la interferencia utilizando un conjunto de cuatro siRNAs contra el
AKR1C3
. Se utilizó un ensayo clonogénico para determinar la citotoxicidad de la PR-104A en las células HT29 después de preacondicionamiento simultánea con SF y siRNA contra
AKR1C3
(Fig 3C y 3D, S2 Tabla). Como control, se utilizó no siRNA dirigidos. Además, diferentes tiempos de incubación y las concentraciones de siRNA fueron probados para asegurar que la expresión inducida AKR1C3-SF fue reprimida por el siRNA contra
AKR1C3
en las condiciones descritas, y después de 48 horas de preacondicionamiento simultánea con SF y siRNA contra
AKR1C3
, los niveles de proteína fueron similares a los niveles en células HT29 sin tratar (datos no mostrados). Cuando la sobreexpresión inducida AKR1C3-SF fue regulada hacia abajo a través de la interferencia de ARN, se redujo la citotoxicidad de PR-104A, indicando que SF preacondicionamiento disminuye la concentración PR-104A requiere para lograr una citotoxicidad similares mediante la inducción de niveles de abundancia AKR1C3. Estos datos apoyan el vínculo establecido con anterioridad entre la abundancia y la eficacia AKR1C3 PR-104A [29, 30], y además confirma el mismo efecto en condiciones de inducción química, es decir, con SF.
Impacto de SF preacondicionamiento sobre la toxicidad de drogas HCEC en las células del colon no cancerosas
la promoción de la citotoxicidad de drogas en el tejido canceroso puede ser beneficioso si la misma interacción está ausente o reducida en homólogos sanos. Por lo tanto, la combinación de SF y PR-104A se investigó en una línea inmortalizada de células epiteliales de colon humano (HCEC) como modelo para el tejido no canceroso [38]. HCECs (HCEC1CT y HCEC2CT, de dos individuos diferentes) son células diploides no tumorigénicas que expresan epitelial, así como marcadores de células madre y se establecieron a partir de mucosa colónica normal. No llevan mutaciones en los genes de puntos calientes tales como
APC
,
KRAS
, o
TP53
[38]. los niveles de abundancia AKR1C3 medidos por Western Blot se indujeron ligeramente tras el tratamiento SF en células HCEC1CT (Fig 3E), pero en un grado menor que para las células HT29 (Fig 3A). No había ni aumento significativo de la actividad AKR1C3 (Figura 3E) ni sensibilidad a los medicamentos (HCEC1CT: Figura 3F; Tabla 2;
p
= 0,2; HCEC2CT: Tabla 2;
p
= 0,8).
captación SF en células HT29 y HCEC1CT
para examinar si la diferente respuesta en las células HT29 vs. HCEC1CT podría estar relacionado con la captación celular SF, se analizó la captación de SF en HT29 y HCEC1CT por un ciclocondensación ensayo. Este ensayo tiene la ventaja de permitir la cuantificación de la libre SF así como SF unido a tioles celulares, tales como el glutatión [41]. No hubo diferencias significativas en la absorción de SF (S3 Fig), lo que sugiere la exclusión de aumento de la captación como base para la interacción SF-PR104A en HT29, pero no las células HCEC.
Impacto de SF preacondicionamiento en la toxicidad del fármaco en adicional líneas celulares de cáncer de colon
Para explorar la generalidad y la base de los efectos de preacondicionamiento SF, experimentos de citotoxicidad se realizaron con líneas celulares de cáncer de colon adicionales con diferentes antecedentes genéticos (Tabla 2). Al igual que en HT29, SW620 en la CE
50 de la PR-104A se redujo significativamente de 3,6 veces por SF acondicionamiento previo (
p Hotel & lt; 0,0001). Al igual que en las células HT29, se indujo AKR1C3 abundancia en las células SW620 alrededor de 3 veces y la actividad aumentó 1,7 veces (Fig 4, S3 Tabla). En contraste, para HCT116, SW480, y las células GP2d, citotoxicidad PR-104A no se alteró. Esta observación parece consistente con el hecho de que ninguna proteína AKR1C3 se detectó en HCT116 y lisados de células SW480, y ni SF preacondicionamiento inducir la abundancia de proteínas o la actividad (Fig 4, S3 Tabla). En las células GP2d, AKR1C3 apenas se expresa; Sin embargo, la abundancia y la actividad de esta enzima no aumentaron de manera suficiente por SF para alterar PR-104A citotoxicidad (Fig 4, S3 Tabla). Una clara tendencia se observó a la baja de la PR-104A CE
50 valores para las células con mayor actividad AKR1C3 (Figura 4C, R
2 = 0,7063;
p Hotel & lt; 0,01). Estos resultados indican que una combinación de los niveles y actividad basal AKR1C3, así como la susceptibilidad a la inducción por SF, influyen en la propensión de las células para apoyar el potencial PR-104A de mejora de SF. Por lo tanto, la variación genética a través de tejido sano y tumor primario, así como diferentes tipos de cáncer, puede ser espera que contribuya a las respuestas individuales.
(a) actividad AKR1C3 con (gris) y sin (negro) SF preacondicionamiento para el colon líneas celulares utilizadas en este estudio. El análisis estadístico se realizó mediante el test t no apareado con corrección de Welch; *:
p Hotel & lt; 0.05. (B) de Western Blot para la proteína AKR1C3 con y sin preacondicionamiento SF (2,5 M durante 48 h). (C) Correlación entre la actividad y la citotoxicidad AKR1C3 PR-104A (
p
& lt; 0,01). Graph incluye datos de HCEC1CT, HCEC2CT, HT29, SW620, y las células GP2d con (símbolos abiertos) y sin (símbolos cerrados) SF de preacondicionamiento. líneas celulares con ninguna proteína AKR1C3 (HCT116, SW480) se han eliminado. *: Cambio significativo en la CE
50 a SF acondicionamiento previo acuerdo con la prueba F adicional de suma de cuadrados para probar si las curvas de dosis-respuesta en el control y SF pretratados células difieren estadísticamente entre sí
Discusión
a pesar de la existencia de datos sobre el impacto de la ciencia ficción en la expresión génica, sólo había poca información disponible en relación con la proteína alteración abundancia en las células del colon humanos, especialmente para las concentraciones de SF demasiado bajas para alterar significativamente la viabilidad celular. En la pantalla proteómico realizado aquí, 23 eran proteínas diferencialmente abundante, 18 de un posible incremento en la abundancia después del tratamiento con 2,5 M SF. Varias de estas proteínas, incluyendo diferentes AKRs, fueron encontrados previamente para ser inducida por dosis más altas de SF (5 y 15 mM) en líneas celulares de mama establecidas a partir de glándulas mamarias con enfermedad fibroquística y adenocarcinoma de colon humano Caco-2 células también mediante el uso de enfoques proteómicos [14, 16]. Sin embargo, en el presente estudio, la respuesta celular se analizó a una concentración no tóxico y potencialmente fisiológicamente relevante demostrado de exposición SF en tejidos humanos (2,5 M) [46]. A dosis altas, SF tiene actividad citostática y citotóxica en células cultivadas [47-50]. Un cambio moderado en abundancia AKR1C3 (7,3 veces) y la lista general limitado de enzimas regulados hasta detectados en nuestro estudio puede estar relacionado con el tipo de células o la baja concentración de SF, el apoyo a un aumento en una alta proporción de las enzimas reductasa incluso a baja concentración .
sobre la base de los resultados SILAC, hemos explorado el potencial de SF preacondicionamiento de las células HT29 de alterar la citotoxicidad del profármaco bioreductive PR-104A, y encontramos que haya una interacción positiva directamente relacionado con la modulación de AKR1C3. análisis de transferencia Western, las medidas de actividad enzimática específica, y siRNA knock-down experimentos todos corroboraron que el aumento de la sensibilidad a la PR-104A se relacionó con un aumento en los niveles de abundancia AKR1C3 y actividad. Por el contrario, esta sensibilización no era detectable en las células inmortalizadas HCEC1CT, consistente con la falta de actividad de la enzima inducida detectado en estas células (Fig 4A). Sobre la base de los datos de transferencia Western, no parecía haber un aumento relativo de la abundancia de proteínas (Fig 4B). Sin embargo los niveles de proteína absolutos permanecieron tan bajos tanto en las células pre-acondicionado y sin tratar que no se observó sensibilización eficaz. El resultado para la línea celular HCEC1CT era de interés debido a su tejido de origen no oncológico y las características moleculares sugieren como un modelo para las células epiteliales de colon sanos [38].
La posible mejora selectiva de la PR-104A en las células tumorales nos motivaron para examinar cinco líneas celulares adicionales, a saber HCEC2CT (no cancerosos), y las líneas celulares de cáncer de colon SW480, SW620, HCT116, y GP2d para comprender mejor cómo los factores moleculares influyen en la respuesta de combinación. Al igual que en HT29, células SW620 fueron sensibilizados hacia el tratamiento con la PR-104A por el SF-tratamiento previo. Además, AKR1C3 abundancia de proteínas y la actividad se indujo asimismo en estas células. En contraste, la abundancia de proteínas y la actividad no se vio afectada por SF-tratamiento previo en células HCEC2CT no cancerosas, por lo tanto, estas células no fueron sensibilizados hacia la droga. En líneas celulares que tenían niveles muy bajos o ningún ARNm AKR1C3 [51] y no expresan la proteína (SW480, HCT116), la abundancia AKR1C3 tampoco fue inducible con SF acondicionamiento previo. Por lo tanto, no hubo un impacto sobre la citotoxicidad PR-104A. GP2d células tenían una baja
AKR1C3
niveles de ARNm [51], pero la abundancia de proteínas y actividad enzimática podría incrementarse en SF acondicionamiento previo, pero con un nivel de inducción aparentemente insuficiente para afectar a la citotoxicidad de la PR-104A. Así, la actividad AKR1C3 parecía ser más de diagnóstico de la PR-104A citotoxicidad (figura 4C) que pequeños cambios abundancia de proteínas que podrían ser detectados por Western blot, pero no eran suficientes para tener un efecto real. Esta observación se presta apoyo adicional en el contexto de las células de cáncer de colon a la sugerencia de que la actividad AKR1C3 podría ser utilizado como un marcador predictivo de la susceptibilidad PR-104A como poner adelante previamente en la base de datos de xenoinjertos derivados del paciente y las células de leucemia. Por último, se sugiere un valor para el desarrollo continuo de estrategias para controlar la actividad AKR1C3, incluyendo a base de actividad de la proteína de perfiles [30, 52, 53].
Se ha especulado que los factores adicionales, tales como la reparación del ADN, puede cuenta de los resultados contradictorios observados antes en cuanto a la relación entre la susceptibilidad PR-104A y la actividad AKR1C3 en líneas celulares, sin embargo, nuestros datos sugieren un papel débil si ninguna de las diferencias de reparación para ser significativa en las células de cáncer de colon teniendo en cuenta los resultados obtenidos con CBL (Tabla 2). formularios PR-104A ICL, propusieron a ser similares a los descritos para CBL y MMC [26-28, 54]. Cuando probamos CBL como un agente de reticulación y modelo analizado citotoxicidad en las mismas líneas celulares como PR-104A, no había ninguna influencia significativa de SF preacondicionamiento sobre la viabilidad celular (Tabla 2). Sin embargo, en condiciones aeróbicas, tal como se emplea aquí, se cree que PR-104A ICL sólo para ser formado si se expresa AKR1C3, se han sugerido lo contrario otros modos de acción en líneas celulares que carecen de esta enzima, tal como monoalquilación de ADN por sí mismo PR-104A o su oxidada mitad de mostaza [27, 28, 54]. Las estructuras de estos aductos de ADN no se han caracterizado rigurosamente, ni su correspondiente modo de reparación conocido, por lo tanto, la importancia de estas vías para influir en la citotoxicidad en células con bajos niveles basales o inducidas AKR1C3 requiere nuevos estudios.
La posibilidad de potenciar la citotoxicidad de profármacos anticancerígenos bioreductive con fitoquímicos en la dieta se ha demostrado en un puñado de estudios previos de líneas celulares humanas [21, 22, 43, 55]. Cuatro líneas de células, de colon, de pulmón o de mama origen, se sensibilizaron hacia el MMC fármaco bioreductive por la inducción de NQO1 [22]. Yu
et al
. curcumina y resveratrol usado para inducir la enzima de metabolización de fármaco y por lo tanto PTGR1 sensibilizan hígado HepG2 y células SW620 de colon hacia el hidroximetilacilfulveno fármaco bioreductive [43].