Extracto
Aplicaciones
A pesar de intensos esfuerzos de investigación, el adenocarcinoma ductal pancreático sigue siendo una de las enfermedades más mortales del mundo. Nosotros y otros han identificado previamente una subpoblación de células madre de cáncer de páncreas en el tumor como diana terapéutica crítica y, además, se muestra que el estroma tumoral no sólo representa una barrera restrictiva para la administración de fármacos éxito, pero también sirve como un nicho paracrina para las células madre de cáncer . Por lo tanto, nos embarcamos en una investigación a gran escala sobre los efectos de la combinación de la quimioterapia, la inhibición vía hedgehog, y la inhibición de mTOR en un modelo preclínico de ratón de cáncer de páncreas.
Diseño Experimental
prospectivo y aleatorizado pruebas en un conjunto de casi 200 xenoinjertos de tumores subcutáneos y ortotópico de todo el tejido implantado primarios humanos.
resultados
El combinado de orientación de las células madre del cáncer altamente chemoresistant así como sus progenies más diferenciados, junto con supresión de la microambiente tumoral por la orientación del estroma y la mejora de penetración en el tejido del agente quimioterapéutico traducido a una supervivencia significativamente prolongada en modelos preclínicos de cáncer de páncreas humano. No se observaron efectos más pronunciados terapéuticas en los tumores de los pacientes derivados de gemcitabina-resistente. Curiosamente, el enfoque de la terapia triple propuesta podría mejorarse aún más mediante el uso de una formulación pegilada de gemcitabina, que aumentó significativamente su penetración biodisponibilidad y el tejido, lo que resulta en un mejor resultado global aún más.
Conclusiones
Este estrategia terapéutica multimodal debería estudiarse más a fondo en el ámbito clínico como su éxito con el tiempo puede mejorar el mal pronóstico de los pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático
Visto:. Hermann PC, Trabulo SM, Sainz Jr B, Balic a, E García , Hahn SA, et al. (2013) Multimodal tratamiento elimina las células madre cancerosas y conduce a la supervivencia a largo plazo en xenoinjertos de tejido primario de cáncer pancreático humano. PLoS ONE 8 (6): e66371. doi: 10.1371 /journal.pone.0066371
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 13 Noviembre 2012; Aceptado: May 7, 2013; Publicado: 18 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Hermann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente trabajo fue apoyado por una beca de investigación sin restricciones de Siena Biotech, un investigador de Grant avanzadas del CEI (Pa-CSC 233 460), la Subdirección general de Evaluación y Fomento de la investigación, Fondo de investigación Sanitaria (PS09 /02129, Ministerio de Ciencia e Innovación, España ) y el Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (Modalidad ACI-PLAN e Células Madre Proyectos PLE2009-0105 y Modalidad ACI-Colobra la India, tanto Innovación Ministerio de Ciencia e). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dos de los autores Actualmente (Patrizia Tunici) o eran hasta hace poco (Annette Bakker ) empleado por el patrocinador comercial de esta investigación 'Siena Biotech SpA'. Patrizia Tunici y Annette Bakker desarrollaron y validaron SIBI-C1, pero no estaban involucrados en el diseño y análisis de datos del presente estudio. Los autores también confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. no se realizan otras declaraciones pertinentes en materia de empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados, etc.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (en adelante denominado "el cáncer de páncreas" o PDAC ) es la cuarta causa más frecuente de todo el mundo la muerte relacionada con el cáncer [1], [2], [3] y se caracteriza por una alta tasa de metástasis y pronunciada resistencia a la quimioterapia y la radiación. A pesar de los grandes esfuerzos de investigación en las últimas décadas, se ha hecho poco progreso sustancial hacia la mejora de los puntos finales clínicos [4]. A pesar de la introducción de la gemcitabina anti-metabolito en 2007 ha mejorado la respuesta clínica al reducir el dolor y la pérdida de peso [5], pronóstico de la enfermedad se ha mantenido extremadamente pobre con una tasa de supervivencia a 5 años de ~3-4% y un período de supervivencia media de 4 meses -6 [1], [6]. De hecho, varios estudios han demostrado consistentemente que el tratamiento con gemcitabina en su mayoría blancos diferencian las células cancerosas que resulta en un enriquecimiento relativo de las células madre del cáncer [7], [8], [9]. Para los pacientes con enfermedad metastásica, pero buen estado funcional, la reciente terapia de combinación FOLFIRINOX (oxaliplatino, irinotecán, fluorouracilo y leucovorina) mostró una ventaja de supervivencia significativa pero con un aumento de los efectos secundarios tóxicos [10]. Por otra parte, el régimen de nab-paclitaxel y gemcitabina mostró actividad sustancial antitumoral con efectos adversos más tolerables en un ensayo I /II fase, justificando la evaluación de fase III [11]. Sin embargo, en todos estos ensayos, la mayoría de los pacientes finalmente sucumbió de progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer y /o nuevas modalidades de tratamiento sigue siendo una prioridad alta de la salud.
Con la creciente evidencia que apoya la existencia de células madre del cáncer, un nuevo horizonte está surgiendo en el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de páncreas. células madre de cáncer representan una subpoblación de células distinguible de la mayor parte del tumor basado en su capacidad exclusiva para conducir la tumorigénesis y metástasis. Estas células también juegan un papel crucial en la conducción y la recaída de la enfermedad [12], [13], [14], [15], [16]; Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos subyacentes a la tumorigénesis de páncreas y células madre de cáncer de páncreas en especial es de importancia crucial para el desarrollo de terapias más eficaces clínicamente disponibles. De hecho novedoso, recientemente hemos desarrollado enfoques que tanto las células madre cancerosas diana y superar sus mecanismos de quimio-resistencia [9], [17], [18]. Por ejemplo, hemos demostrado que la capacidad de auto-renovación de las células madre del cáncer de páncreas depende tanto de
Hedgehog
y
mTOR
de señalización y orientación simultánea de estas dos vías, en combinación con gemcitabina , representa una nueva estrategia de tratamiento para cánceres epiteliales tales como cáncer de páncreas [9]. Sobre la base de estos estudios, que aquí investigar la aplicabilidad, la seguridad, y el potencial para una mayor optimización de este enfoque de la terapia de combinación en un gran conjunto de tumores primarios derivados del paciente.
Resultados
Triple Terapia marcadamente reduce el tamaño del tumor y aumenta la supervivencia
Hemos demostrado previamente que las culturas esfera de células de cáncer pancreático para enriquecer las células madre del cáncer [8], [9], [17], y que combina la orientación del sonic Hedgehog (SHH ) y la de la mTOR pueden ofrecer una nueva opción terapéutica. Aquí se verifica en cuatro líneas de páncreas primarios distintos de células cancerígenas derivadas de tumores de pacientes que las culturas esfera enriquecidas en células madre del cáncer de hecho muestran una marcada sobreexpresión de SHH y el erizo genes diana GLI-1 y GLI-2 (Fig. 1A), así como aumento de la actividad de la vía de mTOR (Fig. 1B). La posterior
in vivo
evaluación de la terapia de combinación se llevó a cabo en modelos clínicamente más relevantes de cáncer de páncreas xenoinjertos conjunto de tejidos derivados del paciente (ver Fig. 1C de diseño del estudio). Piezas de brevemente
in vivo
tumores pancreáticos humanos primarios expandido que contienen poblaciones heterogéneas de células de cáncer, incluyendo cáncer de células madre [9], así como las células del estroma [7], células pancreáticas estrelladas, células inflamatorias, y la matriz extracelular se implantaron por vía subcutánea y ortotópica en ratones inmunodeprimidos. Tumor tasa de absorción fue confirmado por el crecimiento del tumor durante dos mediciones de tamaño sucesivas, y los ratones portadores de tumores se asignaron al azar para el tratamiento. Posteriormente, los tumores se midieron una vez por semana, ya sea por el calibrador (tumores subcutáneos) o con un sistema de imágenes de ultrasonido de pequeños animales (tumores ortotópico). Como gemcitabina (Gem) representa el actual tratamiento estándar para el cáncer de páncreas, hemos utilizado ratones tratados con la gema como grupo de referencia.
(A) Doble aumentar los niveles de expresión de ARNm de Shh, GLI-1, y GLI-2 de esfera derivados vs. células adherentes. (B) Análisis de transferencia Western de actividad de la vía mTOR a través de la evaluación de la expresión S6 quinasa (panel superior) y la fosforilación (panel inferior) en células primarias adherentes frente a las células esfera derivados enriquecidos en células madre. (C) Ejemplo de configuración experimental. Duración de la terapia triple está marcada por una caja gris oscuro (del día 21 al 48), la monoterapia gema con una caja de color gris claro (día 48 a 81).
Un conjunto de tumores representativos se seleccionan en base a su respuesta al tratamiento diversa Gem [7]. PDAC-265 y 185 fueron altamente resistentes al tratamiento Gem, que muestra el crecimiento rápido del tumor de modo que la primera ratones tuvo que ser retirado del estudio dentro de 3 semanas del inicio del tratamiento (Fig. 2A-E), debido al crecimiento del tumor excesiva. Por el contrario, en los tumores PDAC-JH051, 247, y Pax22, el tratamiento Gem resultó en la respuesta al tratamiento inicial y estabilización de la enfermedad; Sin embargo, después de la eliminación de la quimioterapia, los tumores de forma reproducible comenzaron a volver a crecer (Fig. 2C-E). De todos los tumores investigados, sólo el PDAC-354, que no lleva
Kras
mutaciones [19], mostró una respuesta significativa al tratamiento de la gema hasta el final del período de observación (Fig. 2F) y imitado de cerca el tratamiento respuesta observada en el paciente real (datos no mostrados).
(a-F) curvas de crecimiento del tumor para los xenoinjertos de todo el tejido primario PDAC-265, PDAC-185, JH051, 247, Pax22, y 354 implantado subcutáneamente y ortotópica. línea continua representa vehículo Gem +, línea discontinua representa la gema + SIBI, la línea de puntos representa la gema + + Rapa SIBI (n≥6 por grupo). (G) La curva de Kaplan-Meier que representa el tiempo de supervivencia acumulada de todos los ratones agrupados por grupo de tratamiento.
Es importante destacar que hemos sido capaces de mejorar la respuesta al tratamiento mediante la combinación de quimioterapia con el nuevo inhibidor de la vía hedgehog SIBI-C1 ( SIBI; Siena Biotech) [20]. SIBI inhibe fuertemente la expresión de genes de SHH y los genes diana tales como GLI2 en células de cáncer pancreático primario
in vitro gratis (Fig. S1 A en el Archivo S1). SIBI se administró por sólo 3 semanas para reducir los posibles efectos perjudiciales. Gema fue suministrada por un período máximo de 60 días, de acuerdo con la práctica clínica habitual (Fig. 1C). Debido a la fuerte respuesta a la quimioterapia sola, co-tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos de PDAC-354, ya sea con SIBI no mostró un efecto adicional en el nivel de tamaño de tumor (Fig. 2F) o la supervivencia (datos no mostrados). Para todos los otros tumores, sin embargo, el doble tratamiento con Gem + SIBI condujo a una reducción marcada en el tamaño del tumor (línea de trazos, Fig 1 & amp;. 2), retraso significativo en el crecimiento del tumor, y la supervivencia de este modo significativamente prolongada en comparación con los ratones que recibieron ningún tratamiento o la gema + vehículo (Fig. 2G). Es importante destacar, sin embargo, los tumores con el tiempo recayeron limitar la supervivencia en ratones que recibieron esta terapia doble. Estos datos están en línea con la mejora de la entrega de gemcitabina tras el agotamiento del tejido estromal de protección [21]. Como se indica anteriormente, la inhibición de la señalización por sí sola no abrogar completamente la población de células madre de cáncer (Fig 3A & amp.; B) hedgehog [9]
(A) de flujo de Representante citometría de parcelas y (B) Cuantificación de cáncer. células madre (EpCAM
+ CD133
+ CD44
+) contenido de los tumores en el grupo de tratamiento respectivo (resultados acumulativos de células obtenidas de diferentes xenoinjertos). (C) Imágenes representativas y cuantificación de la formación de esferas secundaria de los tumores tratados PDAC-Pax22 explantados al final del experimento (D200).
Ya que hemos mostrado en la amplia
in vitro
estudios que las células madre del cáncer de hecho puede ser eliminado mediante la adición de un inhibidor de la mTOR [9], el próximo investigó el efecto de un régimen de tratamiento que comprende la gema, SIBI, y rapamicina establecido inhibidor de mTOR (Rapa) en nuestro panel representativo de xenoinjertos de tejido de cáncer de páncreas primarios. Curiosamente, se observó una respuesta muy fuerte a esta terapia triple, lo que resulta en la estabilización de la enfermedad o incluso regresión en casi todos los tumores investigados (línea de puntos, Fig 1 & amp;. 2). Esto se tradujo en una mejora de la supervivencia acumulada significativamente en comparación con todos los otros grupos de tratamiento (Fig. 2E).
Combinación de terapia contra el cáncer agota Stem contenido celular y altera la composición del tumor
Con el fin de evaluar la
in vivo
efectos de la terapia de combinación en poblaciones de células madre del cáncer, que explante y se digirieron tumores representativos de cada grupo después de la finalización de las 3 semanas de terapia triple, y se analizaron mediante citometría de flujo la expresión de marcadores de superficie previamente vinculado a una fenotipo de células madre del cáncer [8], [9], [13]. El porcentaje de EpCAM
+ CD133
+ CD44
+ células en los tumores tratados con la gema era regularmente 2-3 veces mayor en comparación con los tumores no tratados [datos no presentados y [8]]. Por el contrario, la gema + SIBI ya mostraba una ligera disminución en el número de células madre del cáncer, en comparación con la gema solo (Fig 3A & amp;. B). Es importante destacar que sólo la adición de Rapa al régimen de tratamiento elimina prácticamente las células madre de cáncer de tumor. Por otra parte, a la terminación del periodo de estudio (día 200) que investigó la formación esfera secundaria como un ensayo funcional para la actividad de las células madre del cáncer en los tumores PDAC-Pax22 y observamos que la capacidad de formación de esferas se ha reducido ligeramente debido a las culturas derivadas de tumores tratados con la gema + SIBI en comparación con Gem solo. Curiosamente, sin embargo, fue sólo después de triple tratamiento que pudimos observar derogación completa de la actividad de formación esfera (Fig. 3C), lo que sugiere que la terapia de combinación triple había agotado efectivamente el grupo de células madre del cáncer en el tumor.
Más investigación histológica detallada de los tumores mostró que los diferentes regímenes de tratamiento también modificarse la composición celular del tumor. Mientras que los xenoinjertos de tumor derivado primarios utilizados para este estudio muestran una razonablemente alta cantidad de estroma (35-70%) en los grupos tratados con Gem única (Fig. 4A, paneles de la izquierda), la adición de un inhibidor de la vía hedgehog disminuyó notablemente la (4A Fig., los del centro) estroma contenido, una observación que está en sintonía con los informes publicados anteriores [21]. Este efecto fue ligeramente más pronunciada después de la adición de Rapa (Fig. 4A, paneles de la derecha), y fue significativo estadísticamente en comparación con los tumores tratados con Gem solo (Fig. 4B). Como era de esperar, se observó el mismo efecto después del tratamiento de la gema sensible a tumores (Fig. S1B en Archivo S1). Curiosamente, hemos observado efectos similares en los tumores ortotópico (Fig. 4A) como en los tumores subcutáneos (Fig. S1B en Archivo S1).
(A) imágenes histológicas representativas que muestran contenido de estroma en los respectivos grupos de tratamiento en resistentes a gemcitabina tumores ortotópico (PDAC-185, panel superior), (Pax22, panel inferior). (B) Cuantificación del contenido de estroma a través de los diferentes xenoinjertos tratados.
PEGilación de gemcitabina mejora aún más los efectos de la terapia combinada
Dado que los informes anteriores han demostrado que la modificación de la estructura química de la gema por PEGilación conduce a un aumento significativamente el tiempo de circulación y penetración en el tejido
in vivo
y puede por lo tanto ser una nueva opción para el mejor tratamiento de los pacientes con (páncreas) del cáncer [22], [23], hemos decidido, como próxima paso para determinar los efectos de la gema con destino a polietilenglicol (PEG-GEM) como la extendida
in vivo
tiempo de circulación y penetración en los tejidos más alta de PEG-Gem puede generar efectos superiores en comparación con la gema estándar. En primer lugar, se evaluó el
in vitro
efectos de PEG-Gema, en comparación con la gema en las células cancerosas recién aisladas primarias humanas pancreáticas. Para este propósito, cuatro cultivos de células primarias que emparejan generan a partir de
in vivo
-EXPANDED tejidos de cáncer de páncreas se trataron durante 48 horas con o bien Gem estándar o PEG-Gem y se analizaron posteriormente por citometría de flujo para la inducción de apoptosis o la muerte celular, así como por su contenido de células madre de cáncer. En cuanto el porcentaje de células apoptóticas y muertas, no hay diferencias podrían ser observadas entre los grupos de tratamiento (Fig. 5A panel de la izquierda, y los datos no se muestra). Además, no se observaron diferencias entre la gema estándar y tratamiento con PEG-Gem sobre el contenido de CD133
+ células
in vitro gratis (Fig. 5A panel de la derecha).
(A )
In vitro
efectos de Gem y PEG-Gem sobre la apoptosis y la muerte celular, así como la expresión de CD133 (resultados acumulativos de células obtenidas de diferentes xenoinjertos). La curva (B) de Kaplan-Meier que representa el tiempo de supervivencia acumulada de todos los ratones agrupados por grupo de tratamiento. Para fines ilustrativos, seleccionado curvas de supervivencia de la Fig. 2D se representan de nuevo. curvas (c) el crecimiento tumoral de xenoinjertos de todo el tejido primario implantaron subcutáneamente y ortotópica, respectivamente. línea continua representa vehículo Gem +, línea discontinua representa la gema + SIBI, la línea de puntos representa la gema + + SIBI Rapa. (D) La curva de Kaplan-Meier que representa el tiempo de supervivencia acumulada de todos los ratones agrupados por grupo de tratamiento. Para fines ilustrativos, seleccionado curvas de supervivencia de la Fig. 2D se representan de nuevo.
A continuación los ratones portadores de xenoinjertos ortotópico o subcutáneos primarios derivados de tumores de todo el tejido con PEG-Gem, de forma análoga al régimen de tratamiento estándar para Gem tratada. Se seleccionaron los tumores que mostraron una respuesta insuficiente con la gema. Si bien no se observó una diferencia significativa para la supervivencia media entre PEG-Gema y Gema estándar para estos tumores (Fig. 5B), es importante tener en cuenta que el inicio de la muerte relacionada con el tumor en los ratones tratados con PEG-Gem fue mucho más tarde que con la gema estándar (tiempo hasta la progresión: PEG-91d gema gema vs 19d). Alentados por estos resultados prometedores, el próximo desplazó al tratamiento de la gema de serie con PEG-joya en el enfoque de la terapia triple (PEG-Gem + SIBI + Rapa) y evaluamos los efectos sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia en ratones portadores de PDAC-185 xenoinjertos derivados del paciente. Mientras que en nuestro
in vivo
estudios de tratamiento inicial de la gema + + SIBI Rapa llevado a reducir significativamente el crecimiento del tumor y la enfermedad sostenida a corto plazo en comparación con el tratamiento estándar de la gema (Fig. 2D), muchos tumores finalmente recayeron. En respuesta al tratamiento con PEG-Gem + SIBI + Rapa, sin embargo, se observó regresión casi completa de los tumores (Fig. 5C), lo que resultó en la supervivencia del 100% hasta el final del período de observación (día 125) (Fig. 5D ).
Terapia de combinación muestra ningún nivel significativo de toxicidad
la toxicidad potencial sigue siendo una preocupación importante para los enfoques de la terapia de combinación. Para evaluar la toxicidad acumulativa de los tratamientos administrados y sus respectivas combinaciones, se registró el peso corporal de todos los ratones tratados una vez por semana, comenzando el día de la aleatorización hasta el día 100. excluido caquexia como un potencial efecto secundario inducido por el tratamiento, no hubo diferencias significativas en los pesos corporales se observaron entre los grupos de tratamiento (Fig. 6A), por otra parte, con el fin de excluir posibles efectos perjudiciales sobre la función de las células madre normales (por ejemplo, en el sistema hematopoyético), que, además, monitorizamos el número de células blancas de la sangre en los ratones tratados en la terminación de las 3 semanas de las terapias individuales frente a combinados. Si bien en este punto del estudio de la toxicidad acumulativa esperado sería la más alta, no se observó reducción significativa en el recuento de células blancas de la sangre en cualquiera de los grupos de tratamiento en comparación con el tratamiento estándar de la gema (p = 0,792) (Fig. 6B), lo que sugiere no hay grandes alteraciones de las células madre hematopoyéticas por el tratamiento de combinación triple. Curiosamente, a pesar del aumento del tiempo de circulación y penetración tisular mejorada de PEG-Gem no significativamente aumento esperado efectos secundarios adversos en comparación con el tratamiento estándar de la gema (figura 6A & amp;. B).
(A) Los pesos corporales eran grabada para todos los ratones a lo largo de los primeros 100 días del experimento. (B) los recuentos de glóbulos blancos de todos los ratones fueron evaluados al final del periodo de administración de la combinación triple.
Discusión
A continuación, se valida el concepto de una terapia multimodal para integral dirigido a los diversos compartimentos celulares en el cáncer pancreático utilizando un conjunto representativo de casi 200 xenoinjertos de tumores primarios de todo el tejido subcutáneo y ortotópico, haciendo de esta una de las mayores investigaciones en el campo de las células madre tumorales. Los tumores fueron seleccionados en base a su respuesta diversa descrito previamente al tratamiento gemcitabina [7]. La quimioterapia y la radiación se dirigen principalmente células cancerosas diferenciadas, y mientras estas terapias inducen la apoptosis y la muerte celular en las células tumorales, una población de células madre de cáncer es altamente resistente [8], [9], [18], [24], sobrevive a la norma terapia, y mantiene la capacidad de volver a llenar un tumor en toda su heterogeneidad. doble tratamiento que combina la gema y el nuevo inhibidor de alisado SIBI supervivencia prolongada consistentemente en los ratones trasplantados con tumores. Es importante destacar, sin embargo, sólo en los ratones tratados con células madre del cáncer de triple terapia fueron casi completamente abrogada, y se observó una estabilización a largo plazo de la enfermedad o la regresión, y posterior supervivencia a largo plazo. En este régimen de combinación, el efecto del tratamiento de Gem convencional podría mejorarse aún más por el uso de PEGilado Gem a través de la mejora de su biodisponibilidad.
A nivel histológico, el cáncer de páncreas se caracteriza por muy denso estroma y la mala vascularización. Olive et al. mostró en un modelo de ratón genéticamente modificado de cáncer pancreático que el estroma es fuertemente dependiente de la señalización de hedgehog, y la inhibición de la vía de hedgehog con inhibidores de smoothened conduce a "preferente" muerte de las células del estroma y el aumento de densidad de los vasos [21], con lo que las células tumorales más accesibles a la intervención terapéutica. Si bien se obtuvieron estas observaciones en un modelo de ratón de cáncer de páncreas, hemos demostrado más recientemente que también en xenoinjertos de todo el tejido del paciente derivado de co-tratamiento con un inhibidor de smoothened aumenta significativamente la administración de fármacos [17] y reduce notablemente la formación de estroma asociado al tumor . Es importante destacar que, ahora sabemos que el estroma no sólo dificulta la administración de fármacos [21], sino que también proporciona un nicho de apoyo para las células madre del cáncer promoviendo su capacidad de auto-renovación y la invasión [25]. Por lo tanto, la eliminación o supresión del estroma no mejora significativamente los regímenes de tratamiento de mecanismo distinto, pero sólo es capaz de eliminar las células madre del cáncer si se combina con la gema.
Sin embargo, a pesar de la más bien modesta respuesta de las células madre del cáncer de erizo la inhibición de la vía como agente único, hemos sido capaces de demostrar que los inhibidores de smoothened siguen siendo esenciales con el fin de eliminar con éxito células madre de cáncer de páncreas chemoresistant si se combina con otros agentes de metas de células madre [9], [17]. En concreto, hemos demostrado previamente para el cáncer de páncreas que una combinación de quimioterapia y los inhibidores de mTOR y tanto la señalización hedgehog elimina las células diferenciadas, así como las células madre del cáncer
in vitro
[9], y que esto se traduce en largo supervivencia a largo plazo
in vivo
. Recientemente, Wang et al. proporcionado una importante relación mecanicista para la inhibición combinada de la vía hedgehog y mTOR. En concreto, los autores demuestran que la mTOR /S6K1 resultados en la fosforilación de la expresión de Gli y posterior de los objetivos de abajo de señalización. La inhibición de ambas vías mejorado en gran medida el efecto pro-apoptosis de la inhibición de ya sea la inhibición sola [26]. En el presente estudio, que hoy vimos una eliminación casi completa de las células madre del cáncer de esta terapia de combinación en un conjunto grande y representativa de xenoinjertos primarios. Considerando que la citometría de flujo utilizando los marcadores de superficie CD133, EpCAM, y CD44 ya se ha sugerido que el contenido de células madre de cáncer se redujo fuertemente, ensayos funcionales (por ejemplo, ensayo de formación de esfera) validado que las células aisladas de los tumores explantados de hecho fueron incapaces de formar esferas tumorales
in vitro, España sugiriendo fuertemente que la población de células madre de cáncer como la raíz de la enfermedad, había sido blanco de manera efectiva por la combinación triple
.
a pesar de que los resultados utilizando la gema-SIBI-Rapa eran altamente consistente y fomentar a través de un panel de tumores derivados del paciente, lo hicimos observar re-crecimiento del tumor en algunos ratones (por ejemplo, PDAC-185 xenoinjertos) y, posteriormente, una disminución en la supervivencia de estos animales de xenoinjerto-cojinete. Como esto puede estar relacionado con la biodisponibilidad limitada del agente quimioterapéutico como una parte esencial de esta terapia de combinación, avanzamos aún más nuestra estrategia de tratamiento mediante la modificación de la quimioterapia. Específicamente, Vandana et al. han demostrado recientemente que la modificación de gemcitabina a través de PEGilación conduce a una mayor biodisponibilidad en la circulación, en comparación con gemcitabina nativo. Aunque también han mostrado mejor
in vitro
respuesta de las células de cáncer de páncreas establecidos utilizando pegilado gemcitabina en comparación con la formulación habitual [22], no se observaron diferencias significativas entre la gema y PEG-Gem
in vitro
a nivel de contenido de células madre de cáncer o la inducción de la apoptosis o muerte celular usando células primarias de xenoinjertos derivados. Aunque estos datos no son sorprendentes ya que la administración de fármacos y la disponibilidad no es un tema crítico
in vitro
, los resultados ponen de manifiesto claramente la importancia de la utilización de tejido de cáncer primario para más
in vivo
evaluación de la eficacia del fármaco .
de hecho, nos fueron capaces de validar y extender este concepto a la
in vivo
entorno, mostrando que el tratamiento con PEG-Gem retrasó significativamente el tiempo de progresión del tumor por 72 días. Esta respuesta al tratamiento mejorado es sin duda impresionante, ya que representa más de la mitad del período de estudio. Como era de esperar, sin embargo, en última instancia, los tumores progresaron resultante en prácticamente ninguna diferencia en la supervivencia media de los ratones tratados PEG-Gem comparación con los ratones tratados con Gem tradicional solo. Mientras que estos datos confirman que la PEGilación de la gema en efecto, mejorar la disponibilidad de medicamentos y entrega, respectivamente, mediante la mejora de el tiempo de circulación y penetración en el tejido, como se esperaba, PEG-Gem sola es claramente no suficiente para superar la quimiorresistencia de las células madre de cáncer. Por lo tanto, el próximo investigó los efectos de la sustitución de la gema regular con PEG-joya en nuestro enfoque multimodal para combatir tumores pancreáticos, que habían respondido inicialmente al tratamiento de la gema + + SIBI Rapa, pero finalmente recayeron en virtud de este régimen de tratamiento específico. Curiosamente, el uso de la combinación de PEG-Gem + + Rapa SIBI no sólo se observó regresión tumoral virtualmente completa, pero lo más importante se obtuvo una supervivencia del 100% durante todo el período de estudio 125d en este tumor altamente resistente a la terapia. Si bien esta observación no excluye más tarde re-crecimiento como se ve en PDAC-Pax22, estos datos son muy prometedores y son consistentes con la idea de que mejorar aún más la formulación de los fármacos combinados es obligatoria para extender
in vitro
hallazgos a la mucho más compleja
in vivo
ajuste.
el nuevo inhibidor de alisado utilizado SIBI-C1 (Siena Biotech, Italia) fue también muy eficaz
in vivo
, como puede ser visto por el crecimiento del tumor reducido en combinación con la gema y por lo tanto el tiempo de supervivencia significativamente mejorada. Por otra parte, la SIBI se puede administrar de forma segura
in vivo
, como hemos visto ningún efecto adverso sobre el peso corporal total o recuento de glóbulos blancos. Es importante destacar que esto es así en línea con las observaciones anteriores usando otros inhibidores de smoothened [9], [15]. La terapia de combinación Gem + SIBI + Rapa también mostró ninguna toxicidad significativa en comparación con el tratamiento Gem solo durante el curso de los experimentos. PEG-Gem + + SIBI Rapa tratamiento de combinación, si bien es mucho más eficaz
in vivo
, sólo un poco, pero no de manera significativa disminución en el conteo de glóbulos blancos y no tuvo efecto sobre el peso corporal de los animales en comparación con los respectivos controles. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que los ratones sanos y relativamente jóvenes utilizados para este estudio probablemente son más capaces de compensar los efectos adversos putativos en los compartimentos de células madre normales durante el tratamiento de terapia triple. Por lo tanto, será importante para validar aún más la seguridad de este régimen de tratamiento en pacientes humanos con el fin de aplicar en última instancia a los pacientes en su mayoría ancianos y moribundos que sufren de cáncer de páncreas
.
En conclusión, aquí nos proporcionan pruebas convincentes para la eficacia de una terapia multimodal dirigirse a las células diferenciadas, así como células madre de cáncer en el cáncer de páncreas, lo que resulta en la supervivencia a largo plazo en ratones. Por lo tanto, estos datos confirman y amplían los hallazgos previos de nuestro laboratorio en un muy gran cohorte de animales con xenoinjertos de cáncer de páncreas derivadas del paciente [9], [15], [17]. Además, también ofrecemos una perspectiva nueva y novedosa sobre cómo mejorar aún más los enfoques terapéuticos actuales mediante la modificación de la estructura molecular de los agentes quimioterapéuticos obligatorias utilizando las PEGilación. Tomados en conjunto, estos hallazgos deben afectar significativamente el desarrollo futuro de la terapéutica del cáncer nueva anti-pancreáticas y /o modalidades de tratamiento.
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales
Después de los pacientes ' se ha obtenido el consentimiento informado, el exceso de tejidos de carcinomas pancreáticos resecados fue de xenoinjerto en Johns Hopkins Medical Institutions (JHMIRB: 05-04-14-02 "un estudio de factibilidad para el tratamiento individualizado de los pacientes con cáncer pancreático avanzado") y el hospital de Madrid - Centro integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 "creación de un banco de tumores y el tejido sano en pacientes con cáncer"), respectivamente, bajo los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional indicadas [7]. en resumen, los tejidos tumorales en exceso no es necesario para el diagnóstico clínico durante resecciones Whipple rutinarias realizadas por los cirujanos que no participaron en el presente estudio se implantaron posteriormente en ratones inmunodeprimidos. Toda la información del paciente se hizo en el anonimato por la eliminación de cualquier información que identifica, o podría conducir a la identificación del paciente. Ninguno de los pacientes había sufrido la radiación o la quimioterapia neoadyuvante antes de la resección del tumor.
Experimentos con Animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comité uso del CNIO (Protocolo PA34 /2012- "modelo de xenotrasplante de cáncer de páncreas humano"). Los animales fueron alojados y mantenidos en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos.