Extracto
Antecedentes
Reconociendo EGFR como orquestador clave del proceso de metástasis en el cáncer colorrectal, sino también la heterogeneidad sustancial de las respuestas a la terapia anti-EGFR, que examinó el patrón de actividades quinasa tumorales compuestos que se rigen por la señalización mediada por EGFR que podrían estar implicados en el desarrollo de la enfermedad metastásica.
pacientes y métodos
Las mutaciones puntuales en
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
y
erbB2
amplificación se determinaron en los tumores primarios de 63 pacientes con localmente avanzado cáncer rectal prevista para el tratamiento radical. El uso de arrays de péptidos con sustratos de tirosina quinasa,
ex vivo
perfiles de fosfopéptidos se generan a partir de las mismas muestras de tumores de la línea de base y se correlacionó con la supervivencia libre de metástasis.
Resultados
análisis de agrupamiento no supervisado de la fosforilación resultante de 102 sustratos de matriz definido dos clases de tumores, tanto que consiste en los casos con y sin
KRAS /BRAF
mutaciones. El grupo de clústeres más pequeño de pacientes, con tumores que generan alta
ex vivo
fosforilación del fosfatidilinositol 3-quinasa relacionada con sustratos, tenía un curso de la enfermedad especialmente agresiva, con casi la mitad de los pacientes que desarrollan enfermedad metastásica dentro de un año el seguimiento.
Conclusión
High fosfatidilinositol-3-quinasa mediada por la actividad de señalización del tumor primario, en lugar de
KRAS /BRAF
estado de la mutación, fue identificada como una sello de la escasa supervivencia libre de metástasis en pacientes con cáncer de recto localmente avanzado sometidos a tratamiento radical de la cavidad pélvica
Visto:. Ree AH, Kristensen AT, Saelen MG, de Wijn R, H Edvardsen, Jovanovic J, et Alabama. (2012) Tumor de la fosfatidilinositol-3-quinasa de señalización y el desarrollo de la enfermedad metastásica en el cáncer rectal localmente avanzado. PLoS ONE 7 (11): e50806. doi: 10.1371 /journal.pone.0050806
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Agosto, 2012; Aceptado: 25 Octubre 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Derechos de Autor © 2012 Ree y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Akershus Grant hospital 2010-003 (a AHR), la Unión Europea 7º Programa Marco de Grant-222741 METOXIA (a AHR y KF), la Sociedad Noruega del cáncer (KF), y una donación generosa del paciente (aproximadamente 10.000 USD ) en apoyo de esta actividad específica de investigación (a AHR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen el siguiente conflicto: ADE es PamGene Internacional empleado BV. Los otros autores han declarado que no existen intereses en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La multitud de más de 500 proteínas quinasas, la kinome, representa una parte sustancial de el genoma humano, y los receptores de tirosina quinasas son mediadores clave en las cascadas que regulan los procesos biológicos centrales de malignidad, tales como la proliferación, angiogénesis y la metástasis [1] señalización, [2]. Con el fin de optimizar e individualizar la eficacia terapéutica de la quinasa agentes para el control de la enfermedad metastásica la inhibición, parece racional para explotar el patrón específico de actividad de la quinasa del tumor como marcador biológico funcional de objetivos viables.
En el cáncer de recto localmente avanzado (LARC) , estudios aleatorizados han puesto de relieve el papel central de la quimiorradioterapia (CRT) junto con resección quirúrgica para erradicar el tumor dentro de la cavidad pélvica y mejorar el resultado a largo plazo [3]. Sin embargo, incluso con tratamiento local con éxito, un número sustancial de pacientes desarrollarán la enfermedad metastásica como resultado de la difusión temprana, sin ser detectados sistémica de las células tumorales. Dentro de este marco de referencia, nuestro estudio no aleatorizado prospectivo que comprende los pacientes LARC dado CRT seguida de cirugía radical y no hay otro tratamiento ofrece una oportunidad única para explorar el papel regulador de las vías específicas de señalización de la quinasa en la proliferación tumoral, la angiogénesis y la metástasis en un definido contexto clínico. En este estudio, el uso de matrices de péptidos con sustratos de tirosina quinasa [4] - [6] para analizar los tumores de los pacientes en el momento del diagnóstico, se ha encontrado que los pacientes con mala respuesta CRT tenían actividad quinasa tumor significativamente elevada, lo que representa la señalización mediada por VEGFR, EGFR, y fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /AKT, en comparación con los pacientes de buen responder [7]. Por otra parte, hemos informado de que las firmas angiogénicos tumorales que comprende PDGFR, VEGFR, y EPOR se asociada con la difusión microscópica de las células tumorales en la médula ósea en el momento del diagnóstico, que en segundo lugar se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad metastásica siguiendo el curso del tratamiento radical de la cavidad pélvica [8].
en el cáncer colorrectal metastásico, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR, cetuximab y panitumumab Actualmente, se han aplicado en la práctica clínica en los últimos ocho años. Para la selección óptima de los pacientes elegibles, los datos moleculares iniciales establecieron las mutaciones de los genes que codifican las proteínas efectoras aguas abajo de EGFR en el tumor de cascada, principalmente las mutaciones en el codón 12 o 13 de
KRAS
, como predictor de la resistencia terapéutica intrínseca a la señalización anticuerpos monoclonales anti-EGFR [9]. Por otra parte, las mutaciones en los genes que codifican otros mediadores, principalmente
BRAF
p.V600E sino también
PIK3CA
mutaciones, están asociados con la resistencia [9], mientras que los tumores que albergan
KRAS
p .G13D puede responder [10], [11]. Se sugirió recientemente que la amplificación de
ErbB2
comprende otro mecanismo de resistencia [12], [13], y que la resistencia adquirida es conferida por la mutación de
EGFR
en sí [14] o el resultado de la expansión subclones del tumor con mutado o amplificado
KRAS
[15], [16]. Además de la señalización a través de la vía del
KRAS /BRAF
efectores codificados con, EGFR en paralelo activa mediada por PI3K señalización a través de una interacción de varios pasos de moléculas mensajeras con efectores [17], [18]. A pesar de todo el conocimiento anterior, sin embargo, se obtiene la respuesta objetiva al tratamiento con anticuerpo anti-EGFR en el cáncer colorrectal metastásico, en el mejor, en no más de la mitad de los pacientes sin aberraciones tumorales en la red de señalización de EGFR que se prueban actualmente en la práctica habitual [ ,,,0],9], [19], [20].
Hacer hipótesis de que la actividad quinasa de EGFR realizado por puede reflejar el estado de mutación de los genes que codifican las proteínas efectoras de cualquier componente de la red de señalización molecular, se comparó la alcanzada previamente
ex vivo
perfiles de fosfopéptidos tumoral de los pacientes del estudio LARC [7], [8] con mutaciones tumorales dentro de
KRAS
exón 2,
BRAF
exón 15, y
PIK3CA
exones 9 y 20, y la amplificación de
erbB2
. Conceptualmente, las firmas de actividad quinasa de tumores que comprenden todas las vías de señalización que interactúan de relevancia podrían desarrollarse en biomarcadores funcionales de dianas terapéuticas viables para el control de la enfermedad metastásica. Las investigaciones en este estudio definieron un subgrupo de pacientes LARC, tras la resección de tumores primarios con alta actividad de la vía de señalización de PI3K, es muy deficiente supervivencia libre de metástasis. Este hallazgo sugiere que la actividad de señalización mediada por PI3K alta tumor es un biomarcador de la evaluación de riesgos y la estratificación del tratamiento.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La fase II, no protocolo de estudio aleatorizado (NCT00278694 ClinicalTrials ID) fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional y el Comité regional de Medicina y Salud de Ética de Investigación del sudeste de Noruega, y está en conformidad con la Declaración de Helsinki. Se requiere el consentimiento informado por escrito para la participación.
Pacientes y Procedimientos
La población de pacientes informó aquí fue inscrito entre octubre de 2005 y mayo de 2008. Los criterios de elegibilidad de los pacientes, los procedimientos de evaluación, tratamiento del estudio, y los procedimientos de revisión de seguimiento se han descrito en detalle anteriormente [7]. Tras CRT neoadyuvante fluoropirimidina /basada en oxaliplatino y cirugía posterior, las muestras de tumor primario resecado fueron evaluados histológicamente en cuanto a la respuesta al tratamiento según los criterios estándar (histopatológico de parada; ypTN) y grado de regresión tumoral histomorphologic (TRG). Brevemente, este último fue clasificado dentro de una de cinco categorías TRG, que abarca desde la ausencia de células tumorales residuales en la muestra resecada (TRG1) a la falta de señales morfológicas de la respuesta al tratamiento (TRG5) [21]. Los datos de seguimiento se obtuvo de la base de datos clínicos y censuraron el 31 de diciembre de 2011. Las observaciones válidas de la presencia o ausencia de metástasis a distancia requiere un examen radiológico designado. Cuatro pacientes con metástasis hepáticas resecables síncronos se excluyeron del análisis de la supervivencia libre de metástasis.
Las muestras tumorales
En el momento del diagnóstico, la línea de base biopsias de tumores primarios específicos del estudio se obtuvieron de 79 pacientes con cáncer de recto localmente avanzado bajo sedación profunda, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C, como se informó anteriormente [7]. De los pacientes incluidos, 16 pacientes fueron excluidos del presente estudio, 12 pacientes tenían como muestras de biopsia de tumores en los que la actividad quinasa de perfiles no se había realizado debido a que los pacientes eran o no elegible después de Registrarse estudio (
n
= 4) , se había retirado el consentimiento (
n
= 1), había muerto de forma inesperada durante el tratamiento preoperatorio (
n
= 1), se había desarrollado la progresión de la enfermedad metastásica durante el tratamiento preoperatorio que impedía la cirugía definitiva (
n
= 1), tenía el contenido de las células tumorales a menos de 20% dentro de la muestra de biopsia (
n
= 3), o tuvo una muestra de biopsia en la que el análisis de la actividad quinasa faltaban razones desconocidas (
n
= 2), y cuatro pacientes adicionales no tienen ADN tumoral aislado porque no permaneció material de biopsia para el propósito. Por lo tanto, los perfiles de actividad quinasa de tumores basados en datos phosphosubstrate matriz anterior se identificaron con éxito por 63 pacientes que tuvieron su tumor
KRAS /BRAF /PIK3CA /ErbB2
determina el estado de mutación, y esta población de estudio estuvo presente en los análisis actuales.
tumor Gene análisis de mutación
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
secuencias diana se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa, y sustituciones de bases fueron detectados por desnaturalizante, completando un ciclo de temperatura electroforesis capilar [22], [23], de acuerdo con la Tabla S1.
ErbB2
amplificación se analizó usando el número de copias del ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Oslo, Noruega) de protocolo [24] y la relación a las correspondientes ADN de cada paciente individual aislada a partir de células mononucleares de sangre periférica calibrado. Las muestras de ADN tumoral con la cuantificación relativa valores superiores a 5 fueron considerados amplificada para asegurar puntuación focal de alto grado
ErbB2
amplificación sólo, omitiendo polysomy de bajo grado del cromosoma 17.
tumor actividad de la quinasa de perfiles
Preparación de lisados de muestra tumoral y análisis multiplex de actividad tumoral quinasa utilizando matrices de péptidos con sustratos de tirosina quinasa (tirosina quinasa PamChip96 matriz; PamGene International BV, 's-Hertogenbosch, Países Bajos) se han descrito en detalle previamente [7 ]. El contenido medio de células tumorales en las muestras de biopsia fue del 46%, y no se encontraron diferencias entre los tumores de tipo salvaje y mutado
KRAS /BRAF gratis (
P Hotel & gt; 0,67; dos muestras
t-test
). Cuatro repeticiones técnica se analizaron de cada muestra del paciente para generar
ex vivo
perfiles phosphosubstrate.
Adaptación de la matriz de datos
visualización y procesamiento de datos de la matriz de datos obtenidos previamente (ArrayExpress adhesión número E-TABM-913), como se informó anteriormente [7], se llevaron a cabo utilizando BioNavigator versión 5.10.70 (PamGene International BV). Los tumores se dividieron en dos grupos; De tipo salvaje y mutado
KRAS /BRAF
estado (36 y 27 muestras, respectivamente). Los datos sobre la fosforilación de péptido array, después de la conversión de la intensidad de señal de matriz, fue log-transformado después de manipular un pequeño número de puntos de datos negativos restando el percentil 1% del total de datos establecidos y, posteriormente, el establecimiento de todos los puntos de datos restantes con valor menos de 1 con el valor 1. se eligió este enfoque de adaptación a equilibrar el número de puntos de datos que se establece en el valor de 1 y el grado de desplazamiento hacia arriba colectiva de todo el conjunto de datos. La corrección de la variación de placa a placa se logra mediante la normalización de la intensidad de señal de sustrato a la intensidad media de la señal de todos los tumores de tipo salvaje en las respectivas placas mediante la siguiente fórmula: N
PSM = log
2 (S
PSM) - log
2 (G
pm), donde N
PSM es la señal normalizada de sustrato p de la muestra s en la placa m, S
PSM es la señal no normalizada correspondiente, y G
de la tarde es la señal media de los tumores de tipo salvaje de sustrato de p en la placa. Phosphosubstrates con una señal de muestra de la media de menos de 10 fueron excluidos, dejando 102 péptidos para su posterior análisis (Tabla S2).
Análisis estadístico
Sobre la base de los valores de la señal de estos resultantes 102 fosfopéptidos de matriz, el análisis se llevó a cabo sin supervisión aplicación del análisis de componentes principales y
k-means clustering
, con 10 repeticiones de Monte Carlo, utilizando las funciones estándar proporcionadas en el Statistics Toolbox de Matlab (Matlab R2010A; Mathworks, Natick, MA, EE.UU.). Binaria supervisó el análisis de clasificación se realizó a través de mínimos cuadrados parciales-análisis discriminante en Matlab R2010A, esencialmente como se describe anteriormente [7]. Rendimiento de partición de clase con respecto al estado de la mutación del tumor fue evaluada por 20 veces la validación cruzada. Distribución de parámetros entre los pacientes con tumores que albergan las características moleculares diferenciales se comparó con la prueba exacta de Fisher para datos categóricos y de dos muestras
t-test
para las variables continuas. Se aplicó la prueba de log-rank para calcular cualquier diferencia en la supervivencia libre de metástasis entre los subgrupos de pacientes. El análisis de los datos se realizó con el programa SPSS Predictive Analytics Software (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
P
-valores inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Las mutaciones tumorales
Las mutaciones puntuales en
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
y amplificación de
erbB2
se detectó en el 35%, 6,3%, 9,5% y 3,2% de los tumores primarios de los 63 casos LARC, respectivamente (Tabla 1); en la mayoría, se encontró un único gen aberración. Cuatro tumores albergaba
BRAF
mutación, ya sea p.D594G o p.V600E, como una aberración solitario. En seis tumores,
se encontraron mutaciones PIK3CA
; en dos de los casos,
KRAS mutado también fue
. Sólo dos muestras, tanto sin otras mutaciones detectadas, mostró amplificados
erbB2
(en virtud de tumor mayor de 5 veces
erbB2
nivel relativo al nivel en el ADN normal correspondiente del paciente). No se observaron diferencias entre los pacientes que albergan
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y tumores mutados relación con el estadio TNM radiológica en el diagnóstico, estadio ypTN histopatológico o la puntuación TRG histomorphologic de los especímenes quirúrgicos siguiente CRT, el desarrollo de la enfermedad metastásica en el momento mediana de seguimiento -up de 53 meses (rango 7-70), o la edad (Tabla S3).
tumor quinasa Actividad perfiles
ex vivo perfiles de actividad tumoral
quinasa se derivaron de 102 sustratos de matriz que tenían intensidades de señal por encima del umbral definido (Tabla S2), con niveles de fosforilación relativos varían dentro de un registro
2 rango de -1,0 a 1.0. Sobre la base de los perfiles generados phosphosubstrate, un modelo de partición binaria clase discrimina correctamente entre el tumor
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y la mutación de estado en el 67% de los casos. Ninguna mejora de la precisión de partición de clase se logró en la inclusión de cualquiera de
PIK3CA
o
ErbB2
aberraciones como capas adicionales de información para el grupo de muestras de tumores con mutaciones del gen.
la Figura 1 muestra el gráfico de puntuación resultante de análisis de componentes principales del conjunto de datos de 102 sustratos fosfopéptidos; cada punto representa una de las 63 muestras en un espacio de componentes principales en tres dimensiones. En la inspección de la trama puntuación, se observó un único tumor (triángulo cerrado) como un claro valor atípico para la distribución de muestras a lo largo del primer componente principal, y además, las muestras restantes parecía separar en dos grupos, tanto consiste en un relativamente equilibrada número de
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y tumores mutados. Posteriormente, utilizando las puntuaciones de los tres componentes principales como entrada y excluyendo el tumor atípico de los nuevos análisis,
k-means clustering
se aplicó con el fin de obtener dos grupos distintos de muestras, la asignación de este modo cualquier casos límite en cualquiera de los dos. Como resultado de este procedimiento, 15 de 62 muestras (24%), de los cuales 11 (69% de los 15) fueron
KRAS /BRAF
casos de tipo salvaje, agrupados en el grupo más pequeño (Cluster-Grupo 2; círculos cerrados). Aunque el grupo más amplio de 47 muestras (cluster-grupo 1; cuadrados blancos) consistió en 26 (55%)
KRAS /BRAF
tumores de tipo salvaje,
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y casos mutados se distribuyen por igual en los dos grupos de tumores (
P
= 0,17).
análisis de agrupamiento no supervisado de los niveles de fosforilación de sustrato quinasa generados por los tumores de 63 pacientes. Distribución de las muestras individuales de
KRAS /BRAF
de tipo salvaje (rojo) y los tumores (azul) mutados se visualiza usando las puntuaciones de los tres primeros componentes en un análisis de componentes principales (PC1-3) de la gama de los niveles de fosforilación de 102
ex vivo
sustratos quinasa.
k-means clustering
se utilizó para obtener dos grupos de muestras de tumor, indicado por cuadrados blancos (Cluster-Grupo 1) y los círculos cerrados (Cluster-Grupo 2), respectivamente. El triángulo cerrado representa un solo valor atípico para la distribución de muestras a lo largo de PC1, según se detalla en los resultados.
En la Figura 2, el uso de los grupos resultantes del análisis agrupamiento no supervisado, muestras de tumor (eje horizontal) y péptidos (eje vertical) fueron ordenados a lo largo de una línea que conecta los dos centroides de grupo en función de su proyección y el peso en el cambio de señal, respectivamente, que ilustran que los Cluster-Grupo 2 tumores generados
ex vivo
niveles de fosforilación de sustrato más altas que las muestras del Cluster-Grupo 1 para todos los 102 péptidos. El orden de los sustratos peptídicos con respecto a la forma en que su diferencia en los niveles de fosforilación a través de las muestras tumorales distingue entre los dos grupos de clústeres,
es decir, Francia El perfil de actividad tumoral quinasa discriminante, se enumeran en la Tabla 2. Curiosamente, las diferencias en la fosforilación de sustratos relacionados con PI3K dependiente de factores (uno PIK3R1, tres CTTN1, uno plcg1, dos PDPK1, y uno péptidos RASA1) contribuyeron con más fuerza a la discriminación de los grupos de racimo, ya que esencialmente se encuentran en la mitad superior de la lista , que phosphosubstrates relacionados con la señalización mediada por el
KRAS BRAF
vía efectora /codificados en (una RAF1 y cuatro isoformas MAPK péptidos). Uno de los péptidos de matriz de tres EGFR se encontró entre phosphosubstrates firmemente que distinguen entre los dos grupos de clústeres.
Una línea imaginaria se elaboró entre el centro de gravedad determinado de cada uno de los pacientes Cluster-Grupo 1 y Grupo 2-Cluster (representado en la Figura 1), y las muestras de tumores (63 eje horizontal; marcados de mutaciones de genes como se especifica) y 102 phosphosubstrates (eje vertical) fueron ordenados a lo largo de esta línea de acuerdo con la proyección y el peso en la diferencia de la señal, respectivamente. Red corresponde a más alto y azul para los niveles de fosforilación de sustrato inferiores. Las flechas indican los péptidos de matriz que representan factores de vías de señalización del EGFR-dirigido, como se indica, y la identidad de cada sustrato peptídico, con el fin de arriba a abajo de la figura, se dan en la Tabla 2. En este análisis, el único valor atípico para la distribución de las muestras, como se explica en los resultados, ordenados de izquierda Cluster-Grupo 1 en el mapa de calor.
la Tabla 3 resume las características del tumor y el tratamiento de los 62 pacientes incluidos en cualquiera de Cluster-Group 1 o Cluster-Grupo 2. una vez más, no se observaron diferencias entre los grupos en relación con racimo estadio TNM, ypTN etapa, o la puntuación TRG. supervivencia libre de metástasis fue evaluada por 58 pacientes, ya que los cuatro pacientes con metástasis hepáticas sincrónicas se omitieron de este análisis, con el Cluster-Grupo 2 que demuestra una menor supervivencia libre de metástasis de Cluster-Grupo 1 (
P = 0,011
; Figura 3). De particular interés, mientras que una quinta parte de los pacientes en el Grupo-Grupo 1 desarrollaron enfermedad metastásica durante un período de seguimiento de 36 meses, los pacientes en Cluster-Grupo 2 parecía tener una enfermedad mucho más agresiva, ya que casi la mitad se le había diagnosticado metástasis en menos de un año de seguimiento.
Este parámetro de resultado se analizó para 58 pacientes como consecuencia de la baja (Cluster-Grupo 1) o alta (Cluster-Grupo 2)
ex vivo
actividad de fosforilación del sustrato del tumor primario.
Por otra parte, al comparar
KRAS /BRAF
tumores de tipo salvaje como todo un grupo con todo el grupo de tumores que albergan tales mutaciones, las muestras sin mutaciones generadas significativamente mayor fosforilación de 11 de los 102 péptidos de matriz que constituyen los perfiles de actividad tirosina quinasa (
P-valor
rango 0,0034 a 0,049). En la Figura 4, las muestras dentro de cada uno de estos dos grupos tumorales se organizan horizontalmente en orden de menor a niveles altos de fosfopéptida para visualizar el porcentaje más alto de
tumores KRAS /BRAF
de tipo salvaje que produjo más alto que significa fosforilación 11 niveles para los sustratos (18 de 36 muestras) que los tumores con mutaciones
KRAS /BRAF
realizan correspondientemente (6 de 27 muestras;
P = 0,036
). Una mayoría de los phosphosubstrates discriminantes se consideró para representar los factores de señalización que están interconectados con la vía EGFR-realizado. Dentro de todo el panel 102-péptido, se identificaron seis péptidos que representan miembros de la familia EGFR de tirosina quinasas receptoras (tres de EGFR, erbB2 dos, y uno ERBB4) (Tabla S2). Aunque no se encontraron ninguno de los péptidos de matriz de tres EGFR entre phosphosubstrates distinguen tumoral
KRAS /BRAF
estado de mutación a nivel de grupo, todos los tres péptidos que representan ErbB2 y ERBB4 estaban entre los sustratos exigentes.
las muestras tumorales 63 se ordenan a lo largo del eje horizontal, anotada por el tipo salvaje o mutado
KRAS /BRAF
y marcado para otras mutaciones genéticas que se especifican, mientras que los 11 que discriminan sustratos quinasa (
P
,0034-,049 gama-valor en la comparación de
KRAS /BRAF
tumores de tipo salvaje como todo un grupo con todo el grupo de tumores que albergan estas mutaciones) se representan a lo largo del eje vertical. Para cada sustrato peptídico, se indica la posición (s) del sitio (s) de fosforilación de tirosina dentro de la proteína. El rojo corresponde al superior y azul para los niveles de fosforilación de sustrato inferiores.
Discusión
El hallazgo fundamental de este estudio fue que la alta
ex vivo
fosforilación de PI3K-relacionada sustratos por el tumor primario, en lugar de la
KRAS BRAF
estado /mutación, pueden ser una característica de la escasa supervivencia libre de metástasis en pacientes LARC después de un tratamiento radical de la cavidad pélvica. Este subgrupo particular de pacientes del estudio tenían desarrollo de la enfermedad agresiva, con una fracción sustancial de los pacientes que son diagnosticados con enfermedad metastásica en menos de un año de seguimiento.
Mientras que el tratamiento multimodal contemporánea de LARC ha dado lugar a una mejora significativa de el control local de la enfermedad, el desarrollo de la enfermedad metastásica sigue siendo un reto importante [3]. En la actualidad, no existe consenso al tratamiento sistémico si puede reducir el riesgo de desarrollar metástasis en pacientes con cáncer rectal [25], lo que en parte podría explicarse por la falta de biomarcadores para la evaluación de riesgos y la estratificación del tratamiento. En la cohorte de pacientes analizado aquí, hemos demostrado anteriormente que la presencia de células tumorales diseminadas en la médula ósea en el momento del diagnóstico correlacionado con el desarrollo de la enfermedad metastásica manifiesta [8]. La cuestión de si el tumor
KRAS BRAF
estado /mutación puede ser un biomarcador fiable con el fin de seleccionar a los pacientes de alto riesgo a la terapia anti-EGFR, sin embargo, sigue siendo difícil de alcanzar. A pesar de pruebas convincentes de la eficacia en la enfermedad metastásica de tipo salvaje
KRAS BRAF
tumores colorrectales /[9], incluyendo el hallazgo de un alto porcentaje de posibilidad de resección de metástasis hepáticas después de la terapia sistémica basada en cetuximab [26], la adición de cetuximab a la quimioterapia estándar en pacientes con tipo salvaje
KRAS
cáncer de colon no cumplió con el criterio de valoración de la supervivencia libre de enfermedad prolongada en un ensayo aleatorio que acaba de concluir en el tratamiento adyuvante [27]. Un estudio similar para el cáncer rectal resecado no se ha hecho.
En el presente estudio, el análisis binario de clasificación supervisada de la
ex vivo
perfiles de fosfopéptidos -generated discriminados correctamente entre el tumor
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y mutado en muestras de dos tercios de los casos. Debido a que este manejo de datos en particular se llevó a cabo para permitir la detección de las diferencias sutiles entre los dos grupos que se comparan, no se puede comparar plenamente con el resultado del análisis no supervisado de todo el panel 102-phosphosubstrate. En este último, dos poblaciones tumorales fenotípicas alternativas aparecieron; una más pequeña, que comprende un cuarto de toda la cohorte, y un grupo más grande de los tumores, tanto que consta de muestras con y sin
KRAS /BRAF
mutaciones con distribución similar en los dos grupos de tumores. En el cáncer colorrectal metastásico, respuesta objetiva al tratamiento con anticuerpo anti-EGFR se puede esperar en un tercio de los pacientes no seleccionados, y por el contrario, tumor
KRAS
mutaciones puede encontrarse en casi un tercio de los que respondieron [19]. Nuestra observación de que
KRAS /BRAF
de tipo salvaje y mutado tumores tenían perfiles de actividad quinasa de solapamiento es consistente con el creciente reconocimiento de la heterogeneidad del tumor, que se refleja en el estado de la mutación dispares, como factor determinante de la variable de respuesta a la terapia con anticuerpos anti-EGFR .
de la notificación, los pacientes de estudios que demuestren actividad de señalización mediada por PI3K tumoral alto, ya que todos los sustratos de la matriz de esta vía específica (PIK3R1, CTTN1, plcg1, PDPK1, y RASA1) fueron altamente fosforilada, tenía particularmente pobre metastasis- supervivencia libre después del tratamiento radical de la cavidad pélvica. El complejo PI3K consiste en una subunidad reguladora, que existe en varias isoformas (PIK3R1 y CTTN1), y una subunidad catalítica codificada por
PIK3CA
. En la fosforilación de la subunidad reguladora por tirosina quinasas receptoras o proteína G (RASA1) receptores -junto, la subunidad catalítica está habilitado para generar fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, que activa 3-phosphoinositide dependiente de la proteína quinasa 1 (PDPK1) y posteriormente, AKT y el objetivo de mamíferos aguas abajo de la rapamicina (mTOR). Además, la fosfodiesterasa 1-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato gamma-1 (plcg1) es crucial para la generación de la activación de moléculas de segundo mensajero en el, vía de señalización mediada por EGFR PIK3 dirigida [17], [18]. En el contexto de nuestras observaciones, incluso sin pruebas válidas en la actualidad, es tentador especular que los pacientes LARC podrían ser elegibles para la terapia sistémica adyuvante basado en esta característica biológica de alto riesgo. Dado el hallazgo de que el complejo de PI3K puede ser una clave orquestador red de señalización de la metástasis del cáncer colorrectal, productos terapéuticos dirigidos PI3K /AKT o el complejo mTOR aguas abajo [17] podrían ser racional, y dentro de este marco de referencia, el
ex vivo
phosphosubstrate tecnología podría mostrar útil en el desarrollo de los biomarcadores solicitada de señalización farmacobilidad vía.
en el análisis por separado comparando
ex vivo
perfiles de fosfopéptidos generados por
KRAS /BRAF sobre wild mecanografíe tumores como todo un grupo con los obtenidos colectivamente entre el grupo de los tumores que albergan estas mutaciones, erbB2 y ERBB4 estaban entre los sustratos imperantes discriminan estos dos grupos. Sin embargo, teniendo en cuenta que los 11 sustratos que discriminan en este análisis aparecieron a partir de un número total de 102 péptidos que constituyen los perfiles de actividad tirosina quinasa, la tasa de falso descubrimiento podría ser tan alta como 50% con un nivel de significación estadística de
P
& lt; 0,05. Sin embargo, la resistencia al tratamiento con anticuerpos anti-EGFR puede ser mediada por la activación de la señalización de ErbB2 mediada, ya sea a través de la amplificación de
erbB2
o aumento de los niveles de la heregulina ligando ERBB3 /ERBB4 [13]. Por otra parte,
ErbB2
se ha descubierto recientemente que va a amplificarse en un tercio de los tumores, principalmente el cáncer de colon, confirmado que se trata de tipo salvaje para
KRAS /BRAF /PIK3CA
pero resistente a anticuerpo anti-EGFR terapia; tumores con
ErbB2
amplificación se enriquecieron sustancialmente en esta población específica en comparación con pacientes no seleccionados [12]. En la presente cohorte de pacientes LARC, sin embargo, sólo dos casos se llegó a la conclusión de tener
ErbB2
amplificación.
En concreto, el uso de matrices de alto rendimiento de sustrato quinasa, una asociación entre la actividad quinasa del tumor y la metástasis la supervivencia exento se encontró en esta cohorte LARC. Para la práctica clínica, esta tecnología puede ser factible, ya que es robusto, con pequeñas cantidades de tejido, típicamente 10-15 microgramos de proteína total siendo suficiente [4] - [6]; sin embargo, hasta ahora se ha empleado para hacer frente a un número limitado de temas clínicos [7], [8], [28] - [30]. El concepto es contingente en el tejido tumoral fresco congelado para la conservación de la actividad quinasa, y para la investigación informó aquí, que tomó la ventaja de un banco biológico existente de muestras de biopsia de forma prospectiva compilado a partir de los pacientes del estudio, que permite el análisis del tejido tumoral de calidad garantizada. Sin embargo, la población actual LARC no había recibido tratamiento con anticuerpos anti-EGFR y, por tanto, dichos datos de resultado no estaban disponibles para la correlación de los perfiles de actividad quinasa de tumores generados.
En la selección de pacientes con cáncer para inhibir la cinasa de la terapéutica, el oro que prevalece -standard se basa principalmente en la detección de las aberraciones de genes en los tumores de los pacientes.