Extracto
El estrés inducido fosfoproteína 1 (STIP1) ha sido recientemente identificado como un biomarcador lanzado en el cáncer de ovario humano. Además, STIP1 secretada por células de cáncer de ovario humano se ha demostrado para promover la proliferación de células tumorales mediante la unión a ALK2 (receptor de activina A, tipo II-quinasa 2) y la activación de las vías de señalización Smad-ID3. En este estudio, se evaluaron un total de 330 muestras de tumores de cáncer de ovario para la expresión STIP1 mediante técnicas de inmunohistoquímica y se analiza para una posible correlación con las características del paciente y la supervivencia. La cuantificación de la inmunorreactividad se llevó a cabo mediante la aplicación de un sistema de puntuación inmunohistoquímica (histoscore). Los pacientes con expresión STIP1 alto nivel (histoscore ≥169) tuvieron una supervivencia significativamente peor (alta STIP1, el tiempo de supervivencia de 76 meses = significa; STIP1 baja, el tiempo de supervivencia = 112 meses significar;
P Hotel & lt; 0,0001). Por otra parte, histoscores STIP1 fueron significativamente mayores en los tumores de alto grado (grado 3) que en los de bajo grado (grado 1-2) malignidades (
P Hotel & lt; 0,0001), lo que sugiere que STIP1 puede ser un indicador de tumor agresividad. Los resultados del análisis multivariable reveló que histoscores alta STIP1, etapas avanzadas, tipos histológicos, y la presencia de enfermedad residual (≥2 cm) fueron predictores independientes de mal pronóstico. La adición de histoscores STIP1 mejoró la predicción de las tasas globales y la supervivencia libre de progresión en el modelo de riesgo proporcional de Cox multivariable. El tratamiento de células de cáncer de ovario con STIP1 recombinante estimuló la proliferación celular y la migración, pero co-tratamiento con anticuerpos anti-STIP1 abrogadas este efecto. Nuestros hallazgos sugieren que la expresión STIP1 puede estar relacionado con el pronóstico y que la vía STIP1 puede representar una nueva diana terapéutica para el cáncer de ovario humano
Visto:. Chao A, Lai CH, CL Tsai, Hsueh S, Hsueh C, Lin CY, et al. (2013) del tumor inducida por el estrés Phosphoprotein1 (STIP1) como un biomarcador pronóstico en el cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (2): e57084. doi: 10.1371 /journal.pone.0057084
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Octubre 2012; Aceptado 16 de enero de 2013; Publicado: 27 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Chao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia (NSC100-2314-B-182-016MY3 al THW), el Chang Gung Fundación de Investigación médica (CMRPG391451 /2 a AC, CMRPG 391461/2 al THW), y el Departamento de Salud ( DOH101-TD-I-111-TM013 al THW, DOH101-TD-C-111-006 de CA y THW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es una de las enfermedades más letales que afectan a las mujeres [1]. Casi 225.500 de cáncer de ovario nuevos casos se producen cada año en todo el mundo, responsable de 140.200 muertes [2]. carcinomas de ovario comprenden un grupo heterogéneo de neoplasias, los cuatro subtipos histológicos más comunes son seroso, endometrioide, de células claras y mucinoso [3]. La medición del antígeno de cáncer de suero 125 (CA125) los niveles se ha convertido en una práctica estándar para la evaluación preoperatoria de masas [4] ováricos. Además, CA125 se ha demostrado ser útil para la monitorización de la respuesta terapéutica y en la vigilancia de pacientes con cáncer de ovario epitelial [5]. Sin embargo, CA125 no es elevada en todos los tumores ováricos y no tiene suficiente valor predictivo positivo para la evaluación del riesgo basada en la población o la detección temprana [6]. Debido a las limitaciones de CA125 como un marcador de enfermedad, existe una necesidad urgente de nuevos biomarcadores que pueden utilizarse como indicadores de pronóstico en el cáncer de ovario para diferenciar eficazmente entre la enfermedad agresiva y menos agresivo.
Los recientes avances tecnológicos, especialmente en los campos de la genómica y la proteómica, están acelerando el descubrimiento de nuevos biomarcadores de cáncer [7], [8]. Al comparar los proteomas de fluido intersticial tumor (TIF) y el fluido intersticial normal (NIF), se han identificado recientemente fosfoproteína inducida por estrés 1 (STIP1) como un biomarcador candidato para el cáncer de ovario humano [9]. Los niveles séricos de STIP1 son significativamente más altos en pacientes con cáncer de ovario que en los controles sanos de la misma edad [9] y disminuyen significativamente después de la extirpación quirúrgica del tumor [10]. Además, la medición combinada de CA125 y STIP1 se ha demostrado que mejora la detección temprana de cáncer de ovario [9], el apoyo a la utilidad clínica de STIP1 como biomarcador en esta malignidad [11].
STIP1, también conocido como Hsp70 /Hsp90-organización de la proteína (HOP), proteína de transformación sensible IEF SSP 3521 (IEF-SSP-3521), P60, Sti1, STI1L, (GeneID 10963; HPRD 05454), una proteína de 62,6 kDa, contiene tres tetratricopeptide repetir (TPR) dominios [12] que son capaces de interactuar con las proteínas de choque térmico para formar complejos que participan en diversos procesos biológicos que van desde empalme de ARN, la transcripción, el plegamiento de proteínas, la transducción de señales, y la regulación del ciclo celular [13], [14]. En los tejidos neuronales, STIP1 extracelular se une a las proteínas priónicas y desencadena diferentes vías de señalización - incluyendo la endógeno de la proteína quinasa activada por mitógenos medio (ERK1 /ERK2), proteína quinasa A, y fosfatidilinositol 3-quinasa cascadas de señalización - en última instancia conduce a un aumento en la proliferación celular [15], [16], [17]. En el cáncer de ovario, hemos demostrado que STIP1 une a una proteína morfogenética ósea (BMP) receptor - denominado receptor de activina A, tipo II-quinasa 2 (ALK2) - para activar la ruta de señalización de Smad y la activación transcripcional de ID3 (inhibidor de la ADN vinculante 3) [10]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que STIP1 secretada por células de cáncer de ovario humano promueve la proliferación de células de cáncer, actuando de forma autocrina y /o paracrina.
Aunque la liberación de STIP1 de cáncer de ovario humano ha sido confirmado por una independiente grupo de investigación [18], se dispone de pocos datos sobre la utilidad del análisis inmunohistoquímico STIP1 para evaluar el pronóstico en el cáncer de ovario [19]. En este estudio, se evaluaron un total de 330 muestras de tumores de cáncer de ovario para la expresión STIP1 mediante técnicas de inmunohistoquímica y se analiza para una posible correlación con las características del paciente y la supervivencia.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Consejo de Administración del Chang Gung Memorial hospital (CGMH-IRB#99-0112B y#97-1444C) Revisión Institucional.
los pacientes
Entre 2000 y 2005, se incluyeron un total de 403 pacientes consecutivos con diagnóstico de cáncer de ovario en el Centro Médico de Linkou Chang Gung Memorial hospital en el estudio. Los tipos histológicos fueron los siguientes: serosa (n = 160), mucinoso (n = 68), endometrioide (n = 73), carcinoma de células claras (n = 64), y el tipo de células mixtas (n = 38). Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (i) los pacientes que se sometieron a la terapia neoadyuvante antes de la cirugía definitiva o que fueron remitidos desde fuera de los hospitales después de la cirugía inicial; (Ii) los pacientes que se sometieron a cirugía laparoscópica como tratamiento primario; (Iii) los pacientes que no fueron seguidos en los tres primeros meses después del tratamiento primario; (Iv) los pacientes con carcinomas indiferenciados que surgen en los teratomas; y (v) los pacientes con bloques de parafina patológicos no disponibles. La supervivencia libre de progresión (SLP) se calculó como el intervalo de tiempo (en meses) desde la fecha de la cirugía a la fecha de progresión de la enfermedad documentada (retrospectivamente define a partir de la elevación de CA125 en suero y /o evidencia radiográfica de progresión). La supervivencia global (OS) se define como el intervalo de tiempo entre la fecha de la cirugía y la fecha de la muerte.
La inmunohistoquímica
Los archivos de secciones de tejido de cáncer de ovario en parafina fijados con formol eran recuperado como se describe anteriormente [9], [20], [21]. Las secciones fueron teñidas con un anticuerpo monoclonal de ratón STIP1 primario anti-humano (Abnova Corp., Taipei, Taiwán; 1:1,800 dilución) utilizando una tinción inmunohistoquímica automatizada con la Ventana DAB básica (3,3-diaminobencidina) kit de detección (Tucson, AZ, EE.UU.). Las diapositivas fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos (S. H. y C. H.) que fueron cegados a los datos clínico-patológicos y los patients'identities. La puntuación inmunohistoquímica general (histoscore) se expresó como el porcentaje de células tumorales positivas (0-100%) multiplicado por su intensidad de la tinción (0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderada, 3 = fuerte). Por lo tanto, el total de histoscore varió de 0 a 300 [22]. La validación de la especificidad del anticuerpo anti-STIP1 se realizó mediante el bloqueo de los anticuerpos con 400 nM de proteína STIP1 humana recombinante (rhSTIP1) durante la etapa de incubación con anti-STIP1.
Cell Cultura
ovárico líneas celulares de cáncer (BG1, MDAH2774) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en 10% de FBS, penicilina (100 unidades /ml), estreptomicina (100 unidades /ml), y medios de comunicación DMEM /F12 a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera.
la migración de células de ensayo
BG1 y MDAH2774 células (10
6 /pocillo) - tratados con cualquiera rhSTIP1 (400 nm) o el vehículo solo - se cultivaron en un medio libre de suero durante 24 h. Las células se sembraron en la cámara superior de un Transwell (24 pocillos, de 8 micras de tamaño de poro; Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.). La cámara inferior se llenó con 800 l de DMEM /F12 y 0,5 g /ml de fibronectina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Después de 26 horas de incubación, las células que habían migrado a través de los poros y adheridas a la membrana inferior se tiñeron con fluoresceína y calceína-AM (4 mg /ml; BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). El número de células viables que habían atravesado el filtro se determinó por medición de la fluorescencia de cada muestra usando un lector Tecan Infinito M200 Multiwell (Tecan, Männedorf, Suiza). La neutralización de STIP1 se realizó usando un anticuerpo anti-STIP1 (800 nM). Todos los ensayos se repitieron al menos tres veces.
cierre de la herida Ensayo
Para investigar el efecto de STIP1 sobre la migración celular, las células MDAH2774 (10
6 /pocillo) que fueron tratados con 400 nM de rhSTIP1 o el vehículo se sembraron en placas de 3,5 cm después de 24 h de cultivo en medio libre de suero. El medio se reemplaza con uno que contenía 0,4% de FBS. Se observó la migración celular a través de una abertura. imágenes de contraste de fase de las lagunas fueron capturados al inicio del estudio y después de 24 h de tratamiento con un microscopio invertido (magnificación, 10 ×). Se utilizó el software WimScratch (Wimasis, Munich, Alemania) para el análisis de cierre de la herida [23].
viabilidad celular Ensayo utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 difeniltetrazolio (MTT)
La conversión de las sales de tetrazolio amarilla a cristales de color púrpura formazon por las mitocondrias se utilizó como un proxy para la viabilidad celular. En placas de 48 pocillos, 5 × 10
4 células fueron cultivadas en 200 l de medio por pocillo durante la noche. Se añadió Twenty l de reactivo MTT a cada pocillo, y después de 4 h, se añadieron 200 l de solución de solubilización (10% de SDS en HCl 0,01 M) por pocillo durante toda la noche. La absorbancia se determinó a 570 nm en un espectrofotómetro de microplacas (PerkinElmer Life Science). Para probar el efecto de caída de STIP1 sobre la viabilidad celular, las células de cáncer de ovario fueron transfectadas con 50 nM de ARNsi de doble cadena de orientación STIP1 o controlar siRNA en Lipofectamine RNAimas (Invitrogen, Calsbad, CA), como se informó anteriormente [10]. Después de 48 h de transfección, las células se subcultivaron en la placa para ensayos de MTT.
bromodesoxiuridina (BrdU) Ensayo de incorporación
Para investigar el efecto de STIP1 sobre la proliferación celular, BG1 y MDAH2774 células (10
4 células /pocillo) se cultivaron en medio completo durante 24 h, seguido de 72 h de privación de suero. Las células se trataron a continuación, ya sea con 400 nM de rhSTIP1 o el vehículo durante 24 h. la síntesis de ADN fue ensayada con la proliferación de células de ELISA, BrdU Kit (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) usando la detección colorimétrica de acuerdo con el protocolo del fabricante [21], [23]. La neutralización de STIP1 exógeno se realizó utilizando el anticuerpo anti-STIP1 (800 nM).
Ki67 inmunocitoquímica Ensayo
BG1 y MDAH2774 células se mueren de inanición de suero durante 72 h y luego se trataron con 400 nM de rhSTIP1 o el vehículo durante 24 h. La actividad proliferativa se puso a prueba mediante tinción inmunohistoquímica de Ki67 utilizando un anticuerpo monoclonal frente a Ki67 (NeoMarker, Fremont, CA, EE.UU.).
Análisis estadístico
Las diferencias en la histoscore entre los dos grupos se compararon utilizando la U de Mann-Whitney
T
prueba. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para la comparación de más de dos grupos. La capacidad de STIP1 histoscores para discriminar entre el sobrevivieron y los pacientes fallecidos se evaluó mediante el trazado de las características de funcionamiento del receptor (ROC), que asocia la verdadera tasa positiva (sensibilidad) a la tasa de falsos positivos (1-especificidad) y calculando la área bajo la curva (AUC). Las curvas ROC que dependen del tiempo se utilizaron para evaluar las AUC en diferentes puntos de tiempo [24]. Se utilizó el análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox para identificar los predictores independientes de la SG y SLP. Todas las variables con asociaciones univariantes a
P Hotel & lt; 0,05 se introdujeron en el modelo multivariable. Para investigar el efecto de la adición de STIP1 para el modelo de Cox pronóstico para los pacientes con cáncer de ovario invasivo, restamos la desviación del modelo con la adición de STIP1 de la desviación del modelo sin STIP1. entonces la diferencia se ensayó frente a una distribución chi-cuadrada con grados de libertad igual a la diferencia entre los grados de libertad de los dos modelos (ya sea con o sin STIP1) [25]. Los resultados se presentan como proporciones ajustadas de riesgo (CR) y los intervalos de confianza del 95% (IC). Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete estadístico SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó el paquete R
survivalROC gratis (R versión 2.15.1; La fundación de R estadística, Viena, Austria) para el cálculo de las curvas ROC que dependen del tiempo. Dos colas
P
valores. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Una Expresión de alta STIP1 inmunohistoquímica se asocia con alta etapa, de alto grado, y Invasiva cáncer ovárico
los resultados de inmunohistoquímica (IHC) demostró que el tratamiento con una cantidad en exceso de STIP1 recombinante abrogó completamente el inmune-reconocimiento de STIP1 tejido por anti-STIP1, confirmando la especificidad del anticuerpo anti-STIP1 utilizado en este estudio (Figuras 1A-D). Para el anticuerpo anti-STIP1 idéntico al usado en IHC largo de este estudio, el análisis de transferencia de Western de varias líneas celulares de cáncer de ovario también confirmó su especificidad en el reconocimiento de STIP1 (Figura S1). Las diferencias en STIP1 tinción inmunohistoquímica se muestran en las figuras 1E-G.
STIP1 expresan en el citoplasma de las células de cáncer de ovario es manchado marrón. La inmunorreactividad de STIP1 al anticuerpo anti-STIP1 en tejidos de cáncer (A, C) ha sido abrogada por la adición de 15 g de STIP1 humana recombinante durante la incubación (B, D); estos resultados apoyan la especificidad del anticuerpo anti-STIP1. La intensidad de la tinción STIP1 se calificó como 1 (E), 2 (F), y 3 (G). Todas las diapositivas presentadas aquí eran de carcinomas serosos de ovario. Las barras de escala representan 100 micras (A, B) o 20 micras (C-G) guía empresas
Un total de 330 pacientes con cáncer de ovario (edad media, 50,7 años;. Rango, 17-90 años ) se incluyeron en el estudio. Las características generales de los pacientes del estudio se presentan en la Tabla 1. De los 50 pacientes con tumores borderline de ovario (BOT), 49 (98%) se encontraban en estadio I o II. Por el contrario, 146 (52,1%) de los 280 pacientes con cáncer invasivo se encontraban en estadio III o IV. carcinoma seroso fue el subtipo histológico más común. histoscores STIP1 más altas se asociaron significativamente con la edad avanzada (≥ 50 años), etapa avanzada, la presencia de cánceres no mucinosos (células serosas, claro, o carcinomas endometrioide), grado 3, el cáncer invasivo, los niveles más altos de CA125 (≥35 U /ml), y la citorreducción quirúrgica primaria subóptima (enfermedad residual ≥2 cm) (Tabla 1).
Una Expresión de alta STIP1 inmunohistoquímica se asocia con una reducción de la supervivencia global (OS)
La duración media del seguimiento fue de 69,3 meses (rango, 4-130 meses). Para investigar la utilidad potencial de STIP1 expresión inmunohistoquímica como biomarcador en el cáncer de ovario, se utilizó la curva ROC para cuantificar qué tan bien diferentes histoscores podrían ser utilizados para la predicción de la supervivencia. Debido a que se requiere un seguimiento mínimo de 3 años para el análisis de supervivencia determinada por la curva ROC, se incluyeron un total de 245 pacientes en este análisis. El punto de corte óptimo para el histoscore STIP1 para discriminar entre los pacientes que sobrevivieron (n = 191) y los que murieron (n = 54) fue de 169 (sensibilidad = 0,889, especificidad = 0,492). En el análisis de todos los pacientes estudiados incluyendo ambos casos invasivos (n = 280) y borderline (n = 50), el OS acumulativa de los pacientes con STIP1≤169 (n = 119) fue significativamente mayor (
P
& lt; 0,0001) que aquellos con una puntuación & gt; 169 (n = 211) en el análisis de Kaplan-Meier. Los períodos de supervivencia media fueron 112 y 76 meses, respectivamente (Figura 2A) guía
curva de Kaplan-Meier análisis de supervivencia global mostró que las mujeres con un histoscore STIP1 & gt;. 169 (línea roja) tuvieron una supervivencia global significativamente menor que aquellos con un STIP1 histoscore ≤169 (línea azul). significados estadísticos (
P
& lt; 0,0001) fueron detectados en los análisis de (A) todos los casos (n = 330), incluyendo el cáncer invasivo y tumor borderline (BOT), (B) cánceres de ovario invasivos de todos los tipos de células (n = 280), y (C) solamente invasiva tipo seroso de los cánceres de ovario (n = 107).
Debido a que los tumores de ovario borderline se caracterizan generalmente por un buen pronóstico y no son comúnmente incluidos en ovario ensayos clínicos de cáncer, el significado pronóstico independiente de los niveles STIP1 se analizó sólo en el subgrupo de pacientes con cáncer de ovario invasivo (n = 280). Los resultados del análisis multivariado indicaron que STIP1 histoscores & gt; 169 fueron factor independiente, significativamente el pronóstico para el sistema operativo (
P Hotel & lt; 0,005) y la SLP (
P Hotel & lt; 0,05) (Tabla 2 ). Kaplan-Meier también análisis revelaron que STIP1 histoscores & gt; 169 se asociaron significativamente con pobre OS tanto en todos los casos invasivos de este estudio (n = 280) (Figura 2B) y en los cánceres de ovario seroso invasivos (n = 170) (Figura 2C) .
una Expresión inmunohistoquímica de alta STIP1 está asociado con tumores de alto grado
clasificación histológica es un parámetro importante para la evaluación del riesgo de los pacientes con cáncer de ovario. Como se muestra en la Tabla 1, los histoscores STIP1 fueron significativamente mayores en alto grado (grado 3) tumores que en bajo grado (grado 1-2) malignidades (
P Hotel & lt; 0,0001). Además, investigó la importancia clínica de STIP1 inmunoexpresiones en los cánceres de ovario, según su tipo histológico y grado. La mayoría de los tumores de grado 3 mostró una histoscore STIP1 & gt; 169; En particular, 92,8% (77/83) de tipo seroso, 92,3% (12/13) de endometrioide, y 76,5% (13/17) de los carcinomas de tipo mixto mostraron una expresión de alto STIP1. De los 57 cánceres de células de ovario claras que por lo general no se califican [3], 40 (70,2%) mostraron un histoscore STIP1 & gt; 169. Las tasas de SG acumulativos de los pacientes con bajo grado (grado 1-2) tumores malignos fueron significativamente mayores que los de los pacientes con tumores malignos de grado 3 (
P
& lt; 0,0001). Los períodos medios de supervivencia fueron 102 y 66 meses, respectivamente (Figura S2). Tomados en conjunto, estos resultados indican que histoscores alta STIP1 se asocian con un comportamiento especialmente agresivo en el cáncer de ovario.
La adición de STIP1 Histoscores Mejora el pronóstico estratificación de los pacientes con cánceres ováricos invasivos
Para probar si histoscores STIP1 proporcionado información, además de utilizarse actualmente la clasificación del tumor y puesta en escena, analizamos el impacto de los niveles STIP1 en la supervivencia clínica sólo en pacientes con los mismos grados o estadios clínicos mismas. En los pacientes con grado 3 cáncer de ovario, los pacientes con STIP1 & gt; 169 (n = 102) tenían una significativa (P = 0,022) peor tasa de supervivencia a 5 años del 44,5% de 63,6% en aquellos con STIP1≤169 (n = 11). En pacientes con cáncer de ovario de grado 1-2, los casos con STIP1 & gt; 169 (n = 62) tuvieron una tasa de supervivencia a 5 años del 73,8% peor que el 85,3% de los que tienen STIP1≤169 (n = 48), aunque la diferencia no alcanzó significación estadística todavía (P = 0,197). Además, en los pacientes con estadios avanzados (III y IV) de carcinoma seroso y grado indeterminado 2-3 (n = 8), todos ellos tenían STIP1 & gt; 169 y 7 de ellos (87,5%) sucumbido a la enfermedad durante el seguimiento de este estudio.
también realizamos un análisis de la desviación y construimos las curvas ROC que dependen del tiempo (ya sea con o sin STIP1) para examinar si la adición de histoscores STIP1 podría mejorar la estratificación pronóstica de los pacientes con invasoras los cánceres de ovario. En estos análisis, otros predictores potenciales incluidos en el modelo fueron el escenario, el tipo, el CA125 en suero, y la presencia de enfermedad residual. El modelo de la adición de la histoscore STIP1 a otros factores pronósticos superado de lejos al modelo sin STIP1, que muestra ambos AUC mayores y desviaciones inferiores tanto en OS (Figura 3A,
P
= 0,0008) y la SSP (Figura 3B,
P = 0,014
). En conjunto, estos resultados indicaron que histoscoring STIP1 tumor tenía un valor pronóstico además de la clasificación y puesta en escena.
El AUC dependiente del tiempo (área bajo la curva ROC) del modelo incluyendo STIP1 se informa como un sólido rojo línea, mientras que el AUC del modelo sin STIP1 se muestra como una línea de puntos azul. Otros parámetros incluyen la etapa, el tipo, el CA125 sérico y enfermedad residual. (A) La supervivencia global, (B) la supervivencia libre de progresión.
STIP1 estimuló la proliferación y migración de las células del cáncer de ovario
Para investigar las funciones biológicas de STIP1, hemos tratado BG1 y MDAH2774 células de cáncer de ovario con rhSTIP1 (400 nm). El tratamiento con rhSTIP1 indujo una estimulación de 1,9 veces en la incorporación de BrdU en las células de cáncer de ovario (Figura 4A). Por otra parte, el tratamiento con rhSTIP1 resultó en un aumento de la Ki-67 inmunotinción, lo que sugiere que STIP1 induce la proliferación de células de cáncer de ovario humano (Figura 4B).
Dos líneas de células de cáncer de ovario (BG1 y MDAH2774) fueron tratadas con 400 nM de rhSTIP1 y se analizaron por incorporación de BrdU (A) y la inmunotinción Ki67 (B). células Ki67 positivas se muestran en color marrón; barras de escala representan 20 μ.
El tratamiento con rhSTIP1 estimuló significativamente la migración de células de cáncer de ovario (aumento de 2,4 veces en las células BG1 y aumento de 1,6 veces en MDAH2774 células, respectivamente) (Figura 5). De acuerdo con los datos obtenidos en el ensayo de migración transwell, los resultados del ensayo de cierre de la herida (Figura 5B) se analizaron usando el software WimScratch indicó un aumento 1,8 veces mayor en la tasa de migración de MDAH2774 células tratadas con rhSTIP1 (datos no mostrados).
El tratamiento con rhSTIP1 promovió la migración de células de acuerdo con los resultados tanto de la migración Transwell (a) y el cierre de la herida (B) ensayos. El análisis cuantitativo del porcentaje de la migración de células MDAH2774 utilizando el software WimScratch mostró que la exposición a rhSTIP1 indujo un aumento de 1,8 veces en la migración (B). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
Es importante destacar que los incrementos observados en la proliferación celular y la migración inducida por rhSTIP1 fueron abrogadas por el co-tratamiento con anticuerpos anti-STIP1 (Figuras 6A y 6B). Estos resultados no sólo confirman que los efectos observados fueron inducidos por STIP1, sino que también proporcionan evidencia preliminar para apoyar el potencial terapéutico de anticuerpos anti-STIP1 en el cáncer de ovario.
Cuando se añadieron anticuerpos anti-STIP1 (800 nM) a las células cancerosas previamente expuestas a 400 nM de rhSTIP1, se inhibieron la proliferación celular (a) y la migración (B). Los datos se presentan como media ± error estándar de las medias de tres experimentos independientes.
En las células de cáncer de ovario tratados con rhSTIP1, siRNA desmontables de STIP1, o anticuerpos anti-STIP1, que también se utiliza para ensayos de MTT evaluar la viabilidad celular como un proxy para el número de células, con el entendimiento de que el número de células está determinada por las fuerzas de la proliferación celular y la apoptosis. De acuerdo con los resultados de la Figura 4 y la Figura 6A, el tratamiento con rhSTIP1 significativamente (P & lt; 0,01) aumento del número de células de cáncer de ovario basado en el ensayo de MTT (Figura S3A), mientras que desmontables de STIP1 significativamente (P & lt; 0,005) suprimen las células de cáncer de ovario (Figura S3B). En contraste con el efecto de neutralización de anti-STIP1 sobre la proliferación celular estimulada por rhSTIP1 (Figura 6A), el tratamiento directo de las células de cáncer de ovario con varios clones de anti-STIP1 no cambiar las lecturas de MTT (Figura S3C).
Discusión
Este estudio demuestra por primera vez que STIP1 es un biomarcador pronóstico en el cáncer de ovario humano. De acuerdo con sus características moleculares individuales, biomarcadores Recientemente se han agrupado en las siguientes categorías: biomarcadores de carcinogénesis, biomarcadores liberados, biomarcadores de respuesta, y biomarcadores de riesgo [11]. Sobre la base de su aplicación en la caracterización de la enfermedad, biomarcadores también pueden clasificarse como tales, y los marcadores de riesgo predictivos de pronóstico [19]. En nuestros estudios anteriores [9], [10], hemos demostrado que STIP1 es secretada por los cánceres de ovario en el torrente sanguíneo, lo que sugiere que esta molécula puede servir como un biomarcador de lanzamiento de cáncer de ovario. En particular, nuestros resultados actuales indican que una expresión de alto STIP1 está relacionada con pobre OS (Figura 2; Tabla 2). Y las tasas de PFS pobres (Tabla 2) y por lo tanto puede representar un nuevo marcador pronóstico
un factor pronóstico importante en el cáncer de ovario es el grado histológico (Figura 2B); por desgracia, la clasificación es subjetiva, incluso entre los patólogos experimentados y algunos tumores no se ajustan correctamente en un grado determinado [26]. Por ejemplo, una variación entre observadores significativa entre los patólogos en la clasificación de cáncer de mama se ha informado [27]. Para hacer frente a esta advertencia, la clasificación de cáncer de mama en subtipos moleculares con genes distintivo firmas de expresión ha sido propuesta como un medio para la comprensión de la base molecular de la grado histológico [28]. En este estudio, hemos demostrado que los histoscores STIP1 pueden ser útiles para complementar la clasificación histopatológica del patólogo de los cánceres de ovario, proporcionando objetivos, evaluaciones cuantitativas. En particular, STIP1 histoscores pueden ser útiles para predecir el pronóstico en pacientes con cáncer de células claras (que por lo general no se califica) [3]. Nuestros análisis revelaron además que, incluso en pacientes de la misma el grado del tumor, un nivel más alto STIP1 se asoció con una peor evolución clínica.
Los niveles séricos de STIP1 no diferían significativamente entre los pacientes con 4 etapas clínicas de ovario cáncer [9], pero en este tumor estudio histoscores STIP1 fueron significativamente mayores en las etapas III-IV (n = 147) que las etapas I-II (n = 183) (Tabla 1). Esta discrepancia puede ser causado simplemente por el número de casos pequeñas (n = 43) en nuestro estudio anterior [9]. Los hallazgos que histoscores alta STIP1 se asociaron significativamente con etapas altas clínicos (III-IV) y de alto grado (3) (Tabla 1) también plantearon la posibilidad de que los altos histoscores pueden ser una función de los grados de tumor y /o estadios clínicos altos, que queda por demostrado en estudios futuros de mayor número de caso. Sin embargo, STIP1 histoscoring tumor ejerce claramente un valor pronóstico además de los parámetros utilizados comúnmente, clínicos (Figura 3). Estos resultados apoyan colectivamente la utilidad de STIP1 histoscore como un biomarcador de pronóstico.
Como una fosfoproteína, STIP1 sufre una fosforilación quinasa cdc2, que se acompaña de la translocación citoplasmática de STIP1 [14]. La expresión de STIP1 en diversos tipos de cáncer [15], [29], [30], [31] sugiere que esta molécula tiene una función anti-apoptótica y /o promueve la supervivencia de células de cáncer. La caída de STIP1 se ha demostrado que suprimir la invasividad de las células de cáncer de páncreas [31]. Hemos informado anteriormente de que STIP1 es secretada por las células de cáncer de ovario en el microambiente del tumor y la circulación sistémica [9]. También hemos descrito los mecanismos moleculares por los cuales segrega STIP1 estimula la proliferación de células de cáncer de ovario [10]. Los resultados del presente estudio (Figuras 4 y 5) no sólo confirmar el papel de STIP1 en la promoción de la tumorigénesis, pero también sugieren que esta molécula puede servir como un biomarcador pronóstico (Figuras 2 y 3, Tabla 2).
Los bloqueo efectivo de la proliferación celular estimulada por rhSTIP1 y migración de células de ovario provocadas por anticuerpos anti-STIP1 (Figura 6) indica que STIP1 secretada a partir de tejidos de cáncer puede ser un objetivo para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos en el cáncer de ovario. STIP1 representa un candidato atractivo para la terapia del cáncer. Por ejemplo, un compuesto que previene la Hsp90 de la interacción con STIP1 ha sido diseñado recientemente y demostrado que es perjudicial la vía de plegamiento Hsp90-dependiente, en última instancia, ejerciendo efectos citotóxicos sobre las células de cáncer de mama [32]. Por otra parte, un inhibidor de la Hsp90 C-terminal novobiocina derivados, KU135, se ha demostrado que inhibe la proliferación e inducir la apoptosis en células de melanoma [33]. Por último, un
in vitro
estudio realizado por Horibe et al. [34] ha informado de que un péptido anti-TPR que bloquea la interacción de Hsp90 con el dominio TPR2A de STIP1 es capaz de inducir la muerte celular en pancreático, renal, de pulmón, de próstata, y las líneas celulares de cáncer gástrico.
a pesar de las mejoras incrementales en la cirugía y la quimioterapia, la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario troquel de la enfermedad dentro de los cinco años del diagnóstico [3]. Para los pacientes adecuados, agregar el tratamiento de quimioterapia, puede aumentar tanto la posibilidad de que el tumor responderá bien al tratamiento, así como aumentar la duración que el tumor se puede suprimir objetivo; juntos, esto puede conducir a una cierta prolongación de la vida. Si corroborado por otros estudios, nuestros datos sugieren que STIP1 puede servir como un objetivo prometedor para el tratamiento del cáncer de ovario basado en anticuerpos.
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Figura S1.