Extracto
Muchos tumores son más rígidos que el tejido circundante. Este aumento de la rigidez se ha atribuido, en parte, a una elevación Rho dependiente de la miosina II fosforilación de la cadena ligera. Para caracterizar este mecanismo adicional, se estudió la miosina de cadena ligera quinasa (MLCK), la principal enzima que fosforila la miosina II cadenas ligeras. Se anticipó que los aumentos en la expresión y la actividad MLCK contribuirían al aumento de la rigidez de las células cancerosas. Sin embargo, nos encontramos con que MLCK ARNm y los niveles de proteína son sustancialmente menos en las células cancerosas y tejidos que en las células normales. En consonancia con esta observación, las células de cáncer de colágeno 3D contrato matrices mucho más lentamente que las células normales. Curiosamente, la inhibición de Rho-cinasa MLCK o no afectaron a las contracciones de gel 3D mientras blebbistatin parcial y citocalasina D contracciones máximamente inhibidos. imágenes de células vivas de células en geles de colágeno mostró que la citocalasina D inhibe proyecciones filopodios que se forman entre las células, mientras que un inhibidor de MLCK tuvo ningún efecto sobre estas proyecciones. Estos datos sugieren que la fosforilación de la miosina II es prescindible en la regulación de las propiedades mecánicas de los tumores
Visto:. Yu H-J, Serebryannyy LA, Fry M, Greene M, Chernaya O, Hu W-Y, et al. (2013) Rigidez del tumor no está relacionado con la miosina fosforilación de la cadena ligera en las células cancerosas. PLoS ONE 8 (11): e79776. doi: 10.1371 /journal.pone.0079776
Editor: Michael F Olson, Instituto Beatson para la Investigación del Cáncer Glasgow, Reino Unido
Recibido: 11 Junio, 2013; Aceptado: September 25, 2013; Publicado: 4 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Apoyado en parte por subvenciones de la Universidad Northwestern de Ciencias físicas Centro de Oncología (CA143869) subadjudicación a PdeL, de los Institutos nacionales de Salud a SG (CA113975), GP (ES018758, ES02207 y CA172220) y ZS (ARRA HD044713), la Sociedad de leucemia y linfoma (White Plains, Nueva York, Estados Unidos de América), la Asociación Americana de Gastroenterología y UIC gastrointestinal y la enfermedad hepática fondo para SG, una de las zonas de concesión de la excelencia de la Oficina del vicerrector de Investigación, UIC nm y una Asociación Americana del corazón comunión (13PRE17050060) a LAS. Los autores certificar que no tienen intereses financieros en competencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchos tipos de tumores pueden ser detectados por palpación, ya que son más rígido o más duro que el tejido circundante. Las propiedades mecánicas de un tumor se determinan por los efectos y las interacciones de múltiples parámetros [1] combinados. El estroma, la composición y la rigidez de la matriz extracelular, la integrina ligadura, aumento de la vascularización, la acumulación de fluido y la presencia de células inmunes, tales como macrófagos contribuyen a la rigidez total del tumor [1-3]. Las características físicas de las células transformadas, que pueden ser afectados por la firma genética de las células tumorales [4] y el microambiente [5,6] también juegan un papel en la determinación de la rigidez tumor. la rigidez de la célula está determinada principalmente por actina-miosina II interacciones [7,8]. La interacción actina-miosina II en células no musculares está regulada por la fosforilación de las cadenas ligeras de miosina (MLC) [9]. La actina y la miosina fosfo-II comprenden el motor molecular que convierte ATP en trabajo mecánico en el músculo y no musculares células lisas [9-11] y un aumento en la fosforilación de MLC se ha implicado en la determinación de la rigidez tumor [1,2].
Existen dos vías principales que regulan la fosforilación MLC. Una ruta implica la miosina de cadena ligera quinasa (MLCK). MLCK es una enzima dependiente de calcio-calmodulina que fosforila la cadena ligera reguladora de los músculos y no músculo liso miosina II [9,10]. A diferencia de otras proteínas quinasas que fosforilan varios sustratos, MLC parece ser el único sustrato para MLCK. MLC fosforilación /desfosforilación regula la contracción del músculo liso [9] y muchos otros procesos dependientes de la energía, incluyendo la división celular [10] y la motilidad celular [11,12]. Debido a que la proliferación celular y la colonización metastásica son dos de los aspectos más perniciosos de cáncer, es razonable predecir un papel importante para MLCK en el crecimiento del tumor y la colonización metastásica. En apoyo de esta idea, MLCK ha sido implicada en la supervivencia celular [13,14] y la inhibición de MLCK se ha demostrado que induce la apoptosis [13,15] y para disminuir el crecimiento del tumor [15]. La disminución de la fosforilación MLC también se ha implicado en la insuficiencia citocinesis en células de cáncer [16].
La segunda vía consiste en la GTPasa Rho A mediado de la activación de Rho-quinasa o de la roca. Mientras que la fosforilación de MLC por el rock ha informado, ROCK parece aumentar la fosforilación MLC principalmente mediante la fosforilación e inactivación de una fosfatasa de la miosina [17]. Debido a que el nivel de fosforilación de MLC representa un equilibrio entre las enzimas que fosforilan y desfosforilan MLC, la inhibición de la fosfatasa de miosina aumenta el nivel intracelular de MLC fosforilación [17]. La vía Rho /ROCK desempeña un papel crucial en la comunicación de señales extracelulares que afectan a la naturaleza del citoesqueleto, especialmente las señales de la matriz extracelular que da lugar a aumento de la tensión celular [18]. Esta vía también es central en la regulación de la motilidad celular y la metástasis del cáncer [12]. ROCA bloqueo se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor y la progresión [2] y, a pesar de Rho A no es un oncogén, un aumento de la Rho A expresión se detecta en el cáncer y la vía Rho A /ROCK está implicada en la transformación mediada por Ras [ ,,,0],4].
por lo tanto, hay una gran cantidad de datos que demuestran que la fosforilación MLC es un punto central en el proceso de transformación, la respuesta de las células cancerosas a la matriz extracelular y la proliferación y migración de las células cancerosas. Para entender la importancia de las dos principales vías de señalización que regulan la fosforilación MLC, se determinó la expresión de MLCK en las células cancerosas. Nuestra hipótesis era un aumento en la expresión MLCK en las células cancerosas daría lugar a aumento de la tensión del citoesqueleto y las respuestas contráctiles celulares. Para nuestra sorpresa, hemos encontrado que los tejidos de cáncer y células expresan menos MLCK que sus contrapartes normales y geles de colágeno 3D células de contrato normales más rápidamente que las células de cáncer. Por otra parte, el bloqueo de MLCK o roca tiene ningún efecto sobre las contracciones de gel 3D mientras que la citocalasina D, que interrumpe los filamentos de actina, bloqueado estas contracciones.
Métodos
Células y cultivo de tejidos
mononucleares células (MNC) (& lt; 1,077 g /ml) se obtuvieron por centrifugación de densidad en Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) como se describe anteriormente [19]. fibroblastos uterino humano (células HUF) se aislaron como se describe anteriormente [20]. La siguiente las células humanas, que se obtiene comercialmente (de origen y número de catálogo incluidos), también se utilizaron: HeLa células cervicales cáncer (ATCC, CCL-2), ECC-1 endometriales células de adenocarcinoma epitelial (ATCC, CRL-2923), células epiteliales de la próstata primaria (1 ° de próstata) de los hombres libres de la enfermedad, las células de cáncer de próstata LNCaP (Lonza, CC-25555), las células de cáncer de colon HCT116 (ATCC, CCL-247), MCF10A no transforma las células epiteliales mamarias (ATCC, CRL-10317), MCF-7 (ATCC, HTB-22) y T47D (ATCC, CRL-2865) células de cáncer de mama, células de cáncer escamoso de pulmón H520 (ATCC, HTB-182), las células de endometrio de adenocarcinoma de HEC-1A (ATCC, HTB-113), HEK293T inmortalizado células renales (ATCC, CRL-11268), BEAS-2B pulmonares transformado células epiteliales bronquiales (ATCC, CRL-9609), las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Lonza, CC-2517), células endoteliales de arteria pulmonar humana ( HPAEC) (Lonza, CC-2530), la arteria pulmonar de células humanas normales musculares lisas (HPASMC) (Lonza, CC-2581) y células endoteliales de la microvasculatura pulmonar normales humanos (HLMEC) (Lonza, CC-2527). Utilizamos las células MCF10A y BEAS-2B como controles, ya que, mientras crecen de forma continua en la cultura, que no forman tumores cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes [21,22]. Cinco pares de tejidos humanos de cáncer (vejiga, colon, pulmón, ovario y útero) y tejido normal circundante se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos, División del Medio Oeste (Columbus, OH) y se almacenaron congeladas a nitrógeno líquido. Cada par de tejidos era de la misma paciente.
Aislamiento de ARN y PCR
ARN total fue aislado de las células y tejidos usando Trizol como se recomienda por el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ARN se transcribió de forma inversa con superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y RT-PCR se realizó con 2 l de cDNA y 0,5 M, cada uno, del cebador directo 3BF y el cebador hacia atrás 3aR descrito por Brand-Arpon et al . [23]. PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores para el total de MLCK P4610 (5 'AGG AGG CCG AGC TTG ATT AC 3') y R4762 (5 'ACT TCC CTG AGA CCC CTT TT 3') exones diana 26 y 27. La especificidad de los cebadores fue validado por una curva de disociación el análisis y el cambio veces en la expresión de cada gen se calculó utilizando el método ΔΔCt, con H3F3A como un control interno.
los análisis Western Blot
Piezas de cada uno de tumor congelado y tejido normal eran extirpado mientras se encuentra congelado, se homogeneizaron en 10 veces w /v SDS muestra de amortiguación caliente y se calienta en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Los sobrenadantes se recogieron por centrifugación y 10 l de cada muestra se aplicaron a 4-20% de geles de SDS en gradiente de poliacrilamida y se transfirieron a nitrocelulosa. La mitad superior de cada transferencia se sondeó con un conejo, anticuerpo purificado por afinidad a MLCK [24] y la parte inferior se sondeó con un anticuerpo para GAPDH. Las células fueron cosechadas, suspendidas en PBS, se incubaron con fluorofosfato de diisopropilo 2 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente y se extrajo en 9M urea, DTT 50 mM, Tris 50 mM, pH 6,8. Los sobrenadantes se recogieron por centrifugación, las concentraciones de proteína se determinaron usando un ensayo de Bradford y 10 g de proteína por muestra se aplicaron a 4-20% de geles de SDS en gradiente de poliacrilamida y se transfirió a nitrocelulosa.
Medición de MLC fosforilación
fosforilación MLC se cuantificó en las células HUF y HeLa utilizando geles de urea /glicerol como se describe por Chew et al. [25], con ligeras modificaciones. Las células fueron tratadas con inhibidores durante 2 horas, se lavaron en sacarosa isotónica 2X y se extrajo en 9M urea, DTT 5 mM, Tris 20 mM, pH 6,8. Los sobrenadantes se recogieron por centrifugación, se determinaron las concentraciones de proteína y 100 g de extracto de células HUF y 225 g de extracto de células HeLa se han separado con PÁGINA glicerol-urea. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa, se identificaron las formas fosforiladas de ONU-y MLC utilizando un anticuerpo para MLC y la estequiometría de fosforilación (mol PO
4 /mol MLC
20) se calculó como se describe anteriormente [26] .
gel de colágeno contracción Ensayo y Tratamiento de Drogas
Para preparar la solución de gel de colágeno, medio de crecimiento celular fue suplementado con 1 mg /ml de colágeno tipo 1 de cola de rata collage (BD Biosciences), se neutralizó con 1 N de NaOH a pH 7,5 y se tampona con HEPES 10 mM, se combinó con los medios de cultivo de tejidos y se mantuvo en hielo. Las células se recogieron, se contaron y 5X10
5 células se resuspendieron en 200 l de solución de colágeno y se aplican a pocillos individuales de una placa de 48 pocillos (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Los geles se incubaron a 37 ° C en un CO
2 incubadora durante 15-20 minutos hasta que se solidificaron y luego separadas de las paredes de los pozos con puntas de pipeta. Se añadió medio de crecimiento (200 l) a cada pocillo y se dejó que los geles en contacto durante 18 horas o según lo especificado. Todos los geles fueron fotografiados antes y después de la contracción. Las áreas de los geles se miden en Image J y el porcentaje del tamaño de gel después de la contracción, normalizado a la zona de la sección transversal del pozo, se calculó
. Los tratamientos de drogas de células de colágeno
ML-7, y 27632 y blebbistatin se adquirieron de Merck Biosciences y citocalasina D se adquirió de Enzo Life Sciences. Los fármacos se diluyeron en medio de crecimiento y se añadieron a los geles. Las concentraciones de fármaco se calcularon sobre la base del volumen total de medios de comunicación y gel de colágeno. Las células no tratadas y células tratadas con DMSO se utilizaron como controles.
imágenes en vivo de células de geles de colágeno 3D
Las células HeLa se transfectaron de forma transitoria mediante electroporación usando un BioRad Gene Pulser XCell con ya sea con pLL7. 0 mCherry-LifeAct (regalo del Dr. Robert Wysolmasky) o pEGFP-LifeAct (regalo de Alexander Bershadsky), que se une a la actina F [27]. En pocas palabras, un plato de 10 cm de células Hela confluentes 95% se trataron con tripsina y se resuspendieron en 10 ml de medio de crecimiento. Las células se centrifugaron a 2000 xg durante 5 minutos y se resuspendieron en 400 ul Opti-MEM® I medio de suero reducido suplementado con 4 ul de 1 M Hepes, 1 ug de cualquiera LifeAct plásmido y 10 ug de ADN de esperma de salmón cortado con. La electroporación se hizo en un 4 mm cubeta (BioRad utilizando la siguiente configuración (voltaje = 240 V, la capacitancia = 950uF, resistencia = ∞) A 1:. Relación de 1 de mCherry-LifeAct y EGFP-LifeAct células HeLa transfectadas se mezclaron entre sí y una total de 2,5 x 106 células se mezclaron con 1 ml de 1 mg /ml de colágeno [28]. las células de colágeno se añadió una solución al pozo de un fondo de vidrio Mat Tek plato de formación de imágenes (P35G-1,5-14-C), durante 20 solidificado se añadió minutos a temperatura ambiente y 2 ml de medio de crecimiento para cubrir la matriz celular-gel y se colocan en la incubadora de CO2 al 5%. los inhibidores adecuados se añadió a los medios y las células fueron imágenes en Nikon A1 de barrido láser microscopio confocal, utilizando Apo 100x1. 45 NA objetivo, equipado con cámara ambiental Tokai.
Declaración de Ética
los tejidos se obtuvieron de la Red Cooperativa de tejidos Humanos, División del Medio Oeste (la Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH), un Instituto Nacional del Cáncer financiado repositorio de tejido (https://htrn.osu.edu). Otros investigadores puede haber recibido las muestras de los mismos temas. la sangre del cordón umbilical humano se obtuvo del Centro de Sangre de Nueva York (New York, NY, http: /nybloodcenter.org) según las directrices de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los protocolos para el aislamiento de CB humana células CD34 + por NM fueron aprobados por el IRB de la Universidad de Illinois en Chicago. HUF células fueron aisladas de los peritalis decidua disecados de membranas de la placenta después del parto vaginal normal a término por ZS con la aprobación previa del IRB de la Universidad de Illinois en Chicago. No se utilizaron animales.
Resultados
El gen MYLK se localiza en el cromosoma 3q21 (número de acceso GenBank U48959) en los seres humanos. Los tramos de genes MYLK & gt; 272 kb, contiene al menos 34 exones y codifica para 3 proteínas [29]: nmMLCK (~ 210 kD), smMLCK (~ 150 kD) y una pequeña proteína llamada telokin. nmMLCK humana y smMLCK son transcritos por los exones 1-34 [23] y 18-34 [30], respectivamente. Análisis de la estructura exón-intrón en el gen MYLK humano ha revelado variantes de empalme de nmMLCK que tienen patrones de localización únicas en las células epiteliales [30]. Al menos cuatro isoformas no musculares MLCK (MLCK2, 3a, 3b y 4) que son el resultado de variantes de corte y empalme alternativo de un precursor de ARNm se han descrito [31]. Por el contrario, smMLCK, codificada por los exones 18-34 [29], se expresa principalmente en las células musculares lisas y los bajos niveles de smMLCK se detectan en las células epiteliales y endoteliales (ver abajo). Aunque smMLCK y nmMLCK son estructuralmente diferentes, ambos al parecer sólo se fosforilan la cadena ligera reguladora de la musculatura lisa y no músculo miosina II [9].
Se utilizaron cebadores descritos por Marca-Arpón et al. [23] para analizar la expresión de MYLK en células y tejidos humanos. Se obtuvo tejido de tumores humanos y el tejido circundante para que pudiéramos comparar la expresión de MYLK. PCR cuantitativa, usando cebadores que se dirigen a las secuencias correspondientes en los exones 26 y 27 y reconocen todas las formas de MLCK, reveló niveles de ARNm se MLCK disminuyeron notablemente en la vejiga, colon, pulmón, tejidos de cáncer de ovario y de útero en comparación con el tejido normal (Figura 1 A). Del mismo modo, qPCR en una amplia gama de humano normal (fibroblastos uterino humano, las células endoteliales, los epitelios de próstata y las células mononucleares), las células no transformadas o transformadas también reveló niveles más bajos de ARNm MLCK total (Figura 2 A) en células de cáncer. Los datos de la Figura 2A se normalizaron al nivel de expresión MYLK en células HeLa. células más normal (HUF, HPAEC, HUVEC, 1 ° de próstata) y no tumorigénicos BEAS-2B células están por encima mientras que la mayoría de células cancerosas, con la excepción de las células ECC-1, están por debajo del nivel de expresión MYLK en células HeLa.
PCR cuantitativa (A) y Western blot (B) el análisis de los tejidos normales y cancerosas. El ARN se aisló de diversos tejidos normales y cancerosas y MLCK total de (A), incluyendo todas las variantes de corte y empalme de nmMLCK y smMLCK, se detectó usando cebadores dirigidos a los exones 26 y 27. Se utilizó el gen para H3F3A como un control interno en todos los experimentos. Los datos en el Panel A muestran los promedios de qPCR análisis realizados por triplicado y las barras de error muestran la desviación estándar. El panel B muestra un análisis de transferencia Western usando anticuerpos purificados por afinidad a MLCK. GAPDH se utilizó como control de carga.
PCR cuantitativa para detectar MLCK total de (A) y Western blot (B) análisis de las células normales y cancerosas en cultivo. ARN y proteína fueron aisladas de diversas células y se analizaron como se describe en la Figura 1. Los datos en el panel A representan los promedios de qPCR análisis realizados por triplicado.
A continuación se determinó si la expresión de proteínas correlacionada con los niveles de mRNA . expresión de la proteína MLCK en tejidos y células normales y cancerosas se determinó mediante la realización de transferencias de Western utilizando un anticuerpo purificado por afinidad a MLCK [24]. vejiga Normal, tejidos de colon y útero expresaron tanto no músculo y las isoformas de músculo liso de MLCK mientras que el tejido de pulmón normal sólo expresa smMLCK (Figura 1C). De manera uniforme, todos los tejidos de cáncer expresan principalmente smMLCK y nmMLCK era difícil de visualizar en estos tejidos. Curiosamente, el patrón de expresión de la proteína MLCK es muy similar en los tejidos normales y de cáncer de pulmón, aunque el nivel de mRNA se disminuye en el tejido de cáncer de pulmón (Figura 1). Análisis de las células de cultivo de tejidos mostraron que los fibroblastos humanos (células uterinas HUF) expresan grandes cantidades de ambas formas de MLCK mientras que las células no musculares humanas (endoteliales, células mononucleares de sangre epiteliales y espinal) expresan la mayoría de los más grandes, nmMLCK (Figura 2B). El patrón de expresión en las células cancerosas, sin embargo, es complejo. Las células cancerosas (células de cáncer cervical HeLa, T47D células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata LNCaP y células HL60 promielocítica), expresan smMLCK. Curiosamente, el aumento de la expresión en células de cáncer smMLCK parece acompañar a una disminución en la expresión de nmMLCK comparación con sus homólogos normales (por ejemplo: comparar LNCaP y 1 ° de próstata). En consonancia con los datos PCR, es evidente por la figura 2B que el nivel total de expresión MLCK se reduce en las células de cáncer en comparación con el control.: Células (es decir, normales)
Hemos explorado las consecuencias funcionales de disminución de la expresión MLCK por el crecimiento de células normales y cancerosas en geles de 3D y la comparación de su capacidad de contraerse los geles. colágeno líquido que contiene un número igual de células se aplicaron a placas de 24 pocillos y se dejó endurecer a 37 ° C. Posteriormente fueron liberados de los lados de los pocillos y se fotografiaron a intervalos definidos. Figura 3 muestra que HUF y 1 ° células de la próstata contraigan los geles rápidamente. El aumento de la concentración de colágeno a 2 mg /ml disminuyó la velocidad y el grado de contracción y 3 mg /ml contracción impedido (Figura S1). células HeLa y células MCF10A contratados geles de nivel intermedio mientras que las células MCF7, T47D y LNCaP apenas se contrajeron los geles (Figura 3 y Figura S1).
HeLa, LNCaP, MCF7, MCF10A, HUF y células de la próstata primarios se sembraron en placas de 24 pocillos en el colágeno líquido. Después de endureció el colágeno, los geles fueron puestos en libertad de los lados de los pocillos y se dejaron a contraerse durante 24 hrs. Los pozos fueron fotografiados desde arriba en las horas se muestran. Tenga en cuenta que la HUF y células de la próstata primarios contraigan los geles en un grado mayor que las células HeLa y LNCaP y que las células MCF 10A contrato más de células MCF-7. Barra de escala = 2 mm.
A continuación, se investigó si las contracciones podrían ser bloqueados por los inhibidores de molécula pequeña del citoesqueleto. Se estudiaron las células HeLa HUF y porque se contrajeron los geles. Las células se trataron con ML-7, un inhibidor de MLCK [32], Y27632, un inhibidor de la Rho quinasa [33], blebbstatin, un inhibidor de la miosina II [34] y citocalasina D, que bloquea la polimerización de actina [35]. ML-7 no tuvo ningún efecto sobre la contracción de geles que contienen HUF o células HeLa (Figura 4). Y27632 y blebbistatin tenían una mínima, aunque estadísticamente significativos, efectos sobre la contracción de geles que contienen células HUF. Y27632 no tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la contracción de las células HeLa, mientras blebbistatin tuvo un efecto más pronunciado, estadísticamente significativo en geles hechos de células HeLa. Curiosamente, la citocalasina D tenía el efecto más pronunciado sobre las contracciones de gel y contracciones casi completamente inhibida por ambos tipos de células (Figura 4). Lavado de la citocalasina D dio lugar a una rápida contracción de los geles por ambos tipos de células (no mostrados).
HUF (izquierda) y se cultivaron células HeLa (derecha) en cultivos 3D y tratados con inhibidores como se describe. Los geles fueron fotografiados 24 horas más tarde y se cuantificó el área de la superficie de los geles individuales. Los datos representan la media + SEM. Una forma ANOVA * = valor de p & lt; 0,05, *** = valor de p & lt; 0.001.
Para establecer que ML-7 y Y27632 eran, de hecho, la inhibición de MLCK y Rho-cinasa y la disminución de la fosforilación MLC, se utilizaron geles de glicerol para cuantificar los cambios en la fosforilación MLC20. Ellos mostraron que MLC20 fosforilación disminuye en células HeLa en comparación con las células de HUF y que ML-7 y Y27632 disminución MLC20 fosforilación (Figura 5). Sorprendentemente, blebbistatin y citocalasina D también disminuir la fosforilación MLC20 algo.
El MLC fosforilado y no fosforilado se separaron por electroforesis en gel de urea-glicerol, se transfirieron a nitrocelulosa y se identificó usando un anticuerpo de la 20 kD MLC.
también se utilizaron imágenes de células vivas para observar las células dentro de los geles. Estos geles no fueron liberados desde el lado de los pozos debido a que el movimiento introducido por la contracción del gel hizo imposible la imagen de las células. Figura 6 y la película S1 muestran que las células no tratadas son bien distribuidos y se extienden filopodios, que son ricos en actina, que alcanzar y tocar uno al otro. Las células tratadas con ML-7 o Y27632 permanecieron propagarse y continuaron extender filopodios. Las células tratadas con citocalasina D se mantuvieron propagarse y extenderse estructuras mucho más grandes, pseudópodos-como lugar de filopodios. Es importante destacar que la actina en estas células parecía unirse en grandes agregados dentro de las células.
células HeLa fueron transfectadas con Lifeact mCherry (rojo) o Lifeact-GFP y se cultivaron en geles de colágeno. Estos geles no fueron liberados de las paredes de los pozos para evitar artefactos de movimiento. El panel A muestra células control (sin tratar) que se extienden filapodia que el contacto las células vecinas (también ver la película en la Figura S2). Los paneles B & amp; células C muestran que fueron tratados con 20 mM ML-7 (B) o 6 M citocalasina D (C). Las células tratadas con ML-7 siguen ampliando activamente filopodios. Las células tratadas con citocalasina D tope que se extiende filopodios y la actina en estas células parece recoger en grandes agregados. Las inserciones son subidas por soplado de las áreas enmarcadas. bar = 10 micras de tamaño.
Discusión
Los tumores se pueden palpar porque se sienten más duro que el tejido circundante y muchos factores, tal como se describe en la introducción, puede contribuir a la rigidez de un tumor. Uno de estos factores es el estado contráctil de las células cancerosas en un tumor. Una de nuestras suposiciones básicas cuando comenzamos estos estudios fue que las células cancerígenas componentes del aparato contráctil hasta regular. Esto se basó en los informes de que la contractilidad actomiosina [2] y la expresión de las proteínas Rho [4], la miosina II [36,37] y MLCK [38] se incrementan en los tumores humanos en relación con los controles normales. Además, cuando las células tumorales metastatizan que tienen que hacer su camino a través de un bosque de fibras de colágeno y es razonable que iban a necesitar más proteínas contráctiles activados para empujar a través de la matriz extracelular.
Sin embargo, un examen más detallado de la literatura sugieren lo contrario. Los experimentos utilizando microscopía de fuerza de tracción han encontrado una relación inversa entre la producción de fuerza y la capacidad metastásica [39]. fenotipificación mecánica utilizando microscopía de fuerza atómica [40-42] y otros métodos [43,44] han demostrado consistentemente que las células cancerosas son más suaves que las células normales. Además, un estudio reciente ha sugerido que la disminución de la rigidez puede mejorar la supervivencia de las células cancerosas en la circulación [45]. Hemos demostrado anteriormente que la sobre-expresión de una forma activa de MLCK aumenta la fosforilación MLC y la rigidez en fibroblastos [46]. Por lo tanto, nuestra observación de una disminución en la expresión MLCK es muy consistente con una disminución en la rigidez en las células transformadas reportados por otros laboratorios [39-44].
Figura 2 muestra que la expresión MLCK se reduce en las células tumorales cultivadas en cultura. Sin embargo, los tumores no son homogéneos y, además de las células tumorales, contiene células inmunitarias, miofibroblastos y otros tipos de células del estroma que podría haber aumento de los niveles MLCK y por lo tanto contribuir a la rigidez total del tumor. Sin embargo, los tejidos tumorales se analizaron en la Figura 1 y los datos reflejan las contribuciones de todos los tipos de células dentro de cada tumor. Aunque los datos demuestran claramente disminuye en la expresión MLCK comparación con el tejido normal circundante, no podemos eliminar la posibilidad de que el aumento de la contractilidad de las células de tumor no contribuyen a la rigidez de los tumores. Un enfoque para abordar esta posibilidad es para teñir el tejido del tumor con anticuerpos frente a MLCK y para cuantificar el nivel de la tinción en células de cáncer en comparación con el que rodea las células del tejido y no cancerosas normales dentro de la masa del tumor. Actualmente estamos estableciendo los métodos para llevar a cabo tales experimentos.
El mecanismo responsable de la expresión MLCK regular a la baja en las células cancerosas no está claro. Marca-Arpón et al. [23] han informado de la presencia de un pseudogen (pMYLK) en el cromosoma 3p21 ubicación sólo se encuentran en los seres humanos, chimpancés, gorilas y orangutanes, pero no gibones o mandriles u otras especies. También demostraron que el pMYLK contiene una deleción 73 pb y utilizar PCR para diferenciar entre la expresión de MYLK (667 pb) y pMYLK (594 pb). Usando los mismos cebadores, Han et al. [47] han informado de que la expresión de pMYLK se incrementa en las células cancerosas y el aumento de la expresión de pMYLK es responsable de la disminución de expresión de MLCK. Se utilizaron los mismos cebadores para analizar la expresión de MLCK y pMYLK en células y tejidos humanos. Mientras vemos claramente una disminución en MLCK ARNm y la expresión de proteínas en las células cancerosas y tejidos, que no fueron capaces de detectar sistemáticamente la expresión pMYLK en las células cancerosas o la ausencia de expresión en las células normales. En consecuencia, la regulación de la expresión en células transformadas MLCK aún no está claro actualmente.
La observación de que las contracciones de gel 3D no son bloqueados por ML-7 y Y27632 también merece comentario. Un aumento en la fosforilación de MLC es esencial para la activación de la actina activado actividad de ATPasa musculares y no musculares lisas myosins [9-11]. La inhibición parcial por blebbistatin sugiere que la miosina II puentes cruzados desempeñan un papel en estas contracciones. Sin embargo, la incapacidad de ML-7 y Y27632 para bloquear estas contracciones sugiere que la fosforilación de MLC es prescindible. Por el contrario, la dinámica de actina parecen jugar un papel central en las contracciones de gel 3D. Esta observación es consistente con el informe de que la interrupción de los bloques citoesqueleto de actina todos los tipos de contracciones gel de colágeno [48]. Por otra parte, la característica más prominente de imágenes de células vivas de células en los geles de colágeno (Figura 6) es la presencia de filopodios actina altamente dinámico. Vonna et al. [49] han estudiado la captura patógeno por los macrófagos y se estima que filopodios puede generar cientos de pN de la fuerza de más de 10 micras distancias. En otro estudio se caracteriza filopodios como "tentáculos" fagocíticas que se retraen partículas hacia el cuerpo celular [50]. Estos autores encontraron que el tamaño de paso de las contracciones fue de 36 + 13 nm, lo que excluye la miosina II como sea posible del motor [50]. A pesar de que no fueron capaces de implicar a toda la miosina en la retracción filopodial, despolimerización de los filamentos de actina con latrunculin A también bloqueó las contracciones filopodial [50]. En su conjunto, la literatura y nuestros datos sugieren que las contracciones de gel de colágeno 3D están mediados por la actina a través de filopodios independientemente de la miosina II.
En resumen, nuestros datos demuestran inequívocamente que la expresión MLCK, la fosforilación MLC y la contracción del gel 3D son más bajos en células de cáncer y tejidos que en sus homólogos normales. Por otra parte, nos encontramos con que la disminución de la fosforilación MLC, mediante la inhibición de Rho-quinasa o MLCK, no tiene ningún efecto sobre las contracciones de gel 3D por las células normales o transformadas. Por el contrario, la inhibición de la miosina II tuvo un efecto parcial y despolimerización de la actina prácticamente abolió la contracción. Además, imágenes de células vivas sugirió que filopodios jugar un papel central en las contracciones 3D. Estos datos sugieren fuertemente que la rigidez del tumor, la base subyacente de auto-detección de tumores, es independiente de la fosforilación de la miosina II. Nuestras observaciones son consistentes con estudios recientes que han demostrado que las células cancerosas son menos rígidas que las células no transformadas [40-44]. Por último, hemos demostrado anteriormente que la inhibición de MLCK induce la apoptosis in vitro y potencia los efectos de medicamentos contra el cáncer para inducir la apoptosis e inhibir el crecimiento del tumor in vivo [17]. Nuestra demostración de que la expresión actual MLCK se reduce en las células tumorales sugiere una ventana de orientación para inducir específicamente la apoptosis en células de cáncer y provoca una mayor investigación de MLCK como una posible diana terapéutica.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Resumen de los ensayos de contracción de gel de colágeno. Los geles se incubaron durante 24 horas, fotografiado desde arriba y el área calculada como se describe en los métodos de superficie. El panel A muestra que HUF y células de la próstata primarios contraigan los geles más que las células HeLa y LNCaP. las células de cáncer de mama MCF10A también contratan los geles más que las células cancerosas sean más agresivos MCF7 y T47D.