Extracto
El
SEMA3B
gen se localiza en la región 3p21.3 LUCA, que con frecuencia se ve afectada en diferentes tipos de cáncer. El objetivo de nuestro estudio ha sido profundizar en el conocimiento de la
SEMA3B
gen como un supresor de tumores y los mecanismos de su inactivación. En este estudio, se utilizaron varios enfoques experimentales: analiza el crecimiento del tumor y los ensayos de apoptosis
in vitro
y en ratones SCID, de expresión y de metilación ensayos y otros. Con el uso de la pequeña línea celular de cáncer de pulmón de células U2020 que confirmó la función de
SEMA3B
como un supresor de tumor, y demostró que la supresión se puede realizar a través de la inducción de la apoptosis y, posiblemente, asociada con la inhibición de la angiogénesis. Además, por primera vez, las altas frecuencias de metilación se han observado tanto en intrónica (32-39%) y promotor (44-52%) CpG-islas en 38 no pequeñas carcinomas de pulmón de células, incluyendo 16 carcinomas de células escamosas (SCC ) y 22 adenocarcinomas (ADC), y en 83 carcinomas de células claras de células renales (ccRCC). Las correlaciones entre las frecuencias de metilación del promotor y los intrónicas CpG islas de
SEMA3B
con estadio y grado del tumor han sido revelados por SCC, ADC y ccRCC. La asociación entre la disminución de la
SEMA3B
nivel de ARNm y la hipermetilación del promotor y las islas CpG intrónicas se ha estimado en tumores primarios renales (
P Hotel & lt; 0,01). El uso de PCR cuantitativa, se observó disminución en el promedio de 10 y 14 veces mayor de la
SEMA3B
nivel de ARNm en las CEC y ADC, respectivamente, y una disminución de 4 veces en ccRCC. La frecuencia de este efecto era alta tanto en pulmón (92-95%) y (84%) muestras de tumores renales. Por otra parte, puso de manifiesto una diferencia clara (
P Hotel & lt; 0,05) del
SEMA3B
relativa niveles de mRNA de ADC con y sin metástasis en los ganglios linfáticos. Llegamos a la conclusión de que la expresión aberrante y la metilación de
SEMA3B
podrían sugerirse como marcadores de la progresión de pulmón y cáncer renal
Visto:. Loginov VI, Dmitriev AA, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et al. Supresor de funciones (2015) Tumor de la
SEMA3B
génica en el pulmón humano y cáncer renal. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10.1371 /journal.pone.0123369
Editor Académico: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 16 Julio, 2014; Aceptado: 5 Febrero 2015; Publicado: 11 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Loginov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 13-04-00828a, 13-04-02072a, y 14-04-32084 mol_a de la Fundación rusa para la Investigación básica ; conceder 28.12.07-6888 parecer del Instituto de Tumores Toscano; una subvención del CNR-RAS proyectos conjuntos 2008-2010; la subvención del Presidium de RAS Programa "Biología Molecular y Celular"; contratos 14.604.21.0117 (única RFMEFI60414X0117 del proyecto identificador) y 14.621.21.0001 (RFMEFI62114X0001 el identificador único del proyecto) del Ministerio de Educación y Ciencia de la Federación Rusa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores confirman la ausencia de intereses en competencia, pero declaran afiliación con Affina Biotecnologías. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
semaforinas son mediadores negativos de guía axonal en el sistema nervioso central [1]. Semaforinas comprenden una gran familia de glicoproteínas (8 clases, incluyendo 5 clases de vertebrados, de más de 30 miembros), pero sólo la clase 3 (SEMA3) representa secretan moléculas solubles. Los miembros de la familia SEMA se expresan diferencialmente en el cáncer, y promover o suprimir la proliferación celular, la migración y la angiogénesis, y la inducción de resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, los papeles de los miembros individuales de la familia semaforina pueden ser muy diferentes [2-9].
Clase 3 (semaforinas SEMA3s, también conocidos como colapsinas) comprenden una de las cinco familias de vertebrados de semaforinas y juegan un papel importante en la biología del tumor, incluyendo la regulación de procesos celulares, tales como proliferación de células endoteliales, la apoptosis, la migración y la angiogénesis [10]. Recientemente, la implicación de esta clase de proteínas en la carcinogénesis ha sido intensamente estudiada. SEMA3s son secretadas por las células de múltiples linajes, incluyendo células epiteliales, neuronas, y células tumorales específicos [10]. Neuropilins (PNR) representan los receptores primarios de SEMA3s. La unión de SEMA3s a NRP1 /2 inicia su señalización aguas abajo pero impide la interacción entre NRP1 /2 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la posterior inducción de un programa transcripcional pro-angiogénico. Sin embargo, no está claro si SEMA3s inhibir el crecimiento tumoral al competir con VEGF para neuropilins sitios de unión a ligando, al actuar de manera independiente de VEGF, o por una combinación de estos efectos [10-13].
Estudios anteriores, incluyendo la nuestra, del cromosoma 3 humano en renal, de pulmón, de mama y carcinomas de cuello uterino reveló frecuentes pérdidas alélicas (hasta 40%) en la región LUCA (3p21.3), que alberga dos semaforinas-SEMA3B y SEMA3F. Esta región (hg38 /chr3: 50.0-50.5Mb) compuesta de 445 Kb contiene alrededor de 20 supresores de tumores (TSG) y TSG-candidatos:
RASSF1
,
NPRL2
,
TUSC2
,
CACNA2D2
y otros. Sorprendentemente, estos genes que juegan papeles en procesos celulares y que ejercen la supresión tumoral por varias maneras diferentes (bloqueo del ciclo celular, la inhibición de la angiogénesis, inducción de apoptosis, etc.) se encuentran en la región compacta [14-18].
evidencia importante de la actividad supresora de tumores incluye la identificación de las vías celulares de regulación y otros mecanismos que se ven afectados por SEMA3B. El uso de MDA-MB435 (carcinoma de mama) y A549 (adenocarcinoma de pulmón) las células se demostró previamente que SEMA3B suprimió el crecimiento tumoral, pero provocó un programa pro-metastásico mediante la liberación de interleuquina 8 [19, 20]. Además, se encontró que la inducción de apoptosis por SEMA3B en las células tumorales fue mediada por la inactivación de la vía de señalización Akt [21]. Por lo tanto, era importante aclarar aún más los aspectos particulares de la supresión tumoral SEMA3B.
La metilación es un mecanismo importante de
SEMA3B
gen inactivación [17, 22]. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones anteriores se centró en los estudios de metilación de la isla CpG intrónica, que fue considerado erróneamente como se encuentra en la región promotora.
El objetivo de nuestro estudio fue determinar las distintas funciones de SEMA3B en el tumor supresión, en especial en la apoptosis y la angiogénesis. Por otra parte el objetivo fue evaluar las frecuencias de promotor (hg38 /chr3: 50,267,308-50,267,797) y (chr3 hg38 /: 50,268,972-50,269,271) intrónica correlaciones de la isla CpG hipermetilación con
SEMA3B
expresión, y la progresión del tumor en el pulmón y renal cánceres
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
ADN genómico se aisló de las líneas celulares de cáncer de 14: 3. cánceres de pulmón de células escamosas (SCLC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM: NCI-H157, NCI-H647) y 9 cánceres de células renales (RCC: A498, ACHN, Caki-1, Caki-2, HN-51, KH-39, KRC /Y, TK-10, TK-164). El U2020 línea celular se ha descrito anteriormente [23]. La línea celular ACC-LC5 que lleva una supresión en 3p21.3 [24] fue proporcionado amablemente por el Dr. Yusuke Nakamura (Universidad de Tokio, Tokio, Japón). A498 renal, las líneas celulares Caki1, y CAKI2 y pulmón NCI-N417, NCI-H157, H647 y NCI-se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). líneas de células KRC /Y, ACHN, TK-164, HN-51, TK-10 y KH-39 se obtuvieron del Instituto Karolinska (Estocolmo, Suecia) recogida línea celular [25]. Todas las líneas celulares humanas se cultivaron como cultivos monocapa en IMDM /RPMI o DMEM (con 4,5 g /l de glucosa) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS).
muestras de tejido
En total , 70 emparejados muestras de tumor /normal de NSCLC (29 ADC y 41 SCC) y 133 RCC de células claras (ccRCC) se obtuvieron de la NN Blokhin Cancer Research Center, Academia Rusa de Ciencias Médicas (Moscú, Rusia). Se utilizó el conjunto de NSCLC 38 (16 y 22 ADC SCC) y 83 ccRCC en los estudios de metilación y la expresión o número de copias de los estudios realizados por semi-cuantitativos RT-PCR. Se utilizó el conjunto adicional de 32 NSCLC (13 ADC y 19 SCC) y 50 ccRCC de validación mediante qPCR estudios de expresión. La información de la muestra se presenta en la Tabla 1 y en la Tabla S1. Las muestras se recogieron de acuerdo con las directrices emitidas por el Comité de Ética de N.N. Blokhin Cancer Research Center, Academia Rusa de Ciencias Médicas (Moscú, Rusia). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado (disponible bajo petición) escritos. El Comité de Ética de N.N. Blokhin Cancer Research Center, Academia Rusa de Ciencias Médicas, específicamente aprobado este estudio. El estudio se realizó de acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki. Los tejidos tumorales y tejidos morfológicamente normales emparejados se obtuvieron de los pacientes después de la resección quirúrgica antes de la radiación o la quimioterapia y se almacenaron en nitrógeno líquido. El diagnóstico se verificó mediante histopatología, y sólo las muestras con 70 a 80% o más células tumorales se utilizaron en el estudio. controles "normales" se obtuvieron en un mínimo de 2 cm desde el tumor y se confirmaron histológicamente como células epiteliales normales. muestras de tumores se caracterizaron de acuerdo con el Sistema Internacional de Clasificación de los tumores, basado en el tumor-nódulo-metástasis (TNM) y la puesta en escena de clasificación de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC, versión 2002) [26] y la Organización Mundial de la Salud (OMS ) criterios de clasificación [27, 28]. Las muestras de sangre de 15 donantes sanos también se utilizaron en el estudio.
ratones SCID
ratones SCID Doce fueron utilizados en los experimentos. Los ratones se obtuvieron de Scanbur (Sollentuna, Suecia). la eutanasia de animales se realizó por CO
2 asfixia seguido por dislocación cervical. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NRC 2011), la Convención Europea para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos, Consejo de Europa (STE 123 ), y las directrices del Comité de ética del norte de Estocolmo para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. Los experimentos con los ratones SCID fueron aprobados por el Comité Ético del norte de Estocolmo.
La transfección y selección de transfectadas establemente
SEMA3B
-U2020 clones de células
El ADNc que codifica el
SEMA3B
gen se clonó en un vector regulado por tetraciclina episomal, Pete. El plásmido resultante se secuenció. Para obtener clones celulares estables que expresan
SEMA3B
, U2020 células (SCLC) se transfectaron con Pete vacío o PETE /
SEMA3B
ADN plásmido (0,5 mg de ADN por pocillo) en placas de 12 pocillos utilizando Lipofectamina y reactivo PLUS (Invitrogen, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Transfectadas transitoriamente Pete /
SEMA3B
-U2020 y células Pete-U2020 se cultivaron durante 2-3 semanas en medio IMDM que contienen BSD (5 mg /ml) para seleccionar clones estables. La expresión de
SEMA3B
fue regulada por doxiciclina.
Colonia ensayo de formación de
fueron despojados células transfectadas transitoriamente U2020 (con Pete y Pete /
SEMA3B
) 24 a 48 h después de la transfección y se sembraron en 100 mm
2 placas de cultivo celular a una densidad de 500-1000 células por placa. Después de la selección con BSD (5 mg /ml), las colonias teñidas con Giemsa se fotografiaron y se contaron usando un software Cantidad (versión 4.4.0; Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). viabilidades celulares se estimaron mediante análisis FACS con yoduro de propidio (PI-FACS), siguiendo las instrucciones del fabricante (FACSCalibur, BD Bioscience).
El crecimiento del tumor en ratones SCID
La tumorigenicidad de Pete /
SEMA3B
transfectadas U2020 y celdas vacías transfectadas con Pete U2020 (control) fue evaluada por vía subcutánea inyectar las células en ratones SCID 6-8 semanas de edad, tal como se describe anteriormente [29]. Las células se recogieron por centrifugación a 800 rpm durante 2 min y se resuspendieron en medio IMDM exento de suero a una concentración de 2-3 x 10
6 células por 100 l de inyección. Las células se incrustan en una matriz de Matrigel (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los ratones se observaron para la formación de tumor dos veces por semana y el tamaño del tumor se midió usando calibradores. A continuación, se utilizó la prueba de inactivación de genes múltiples (MGIT) para los tres genes (
ZMYND10 /BLU
,
TUSC2 /FUS1
y
SEMA3B
) en ratones SCID. MGIT se basa en el seguimiento de supresor tumoral inactivación de genes candidatos en las células y tumores. Se lleva a cabo de acuerdo con un método publicado [29, 30]. En pocas palabras, se transfectaron células U2020 ya sea con Pete /em>
, Pete /em>
, Pete /em>
vacíos o con plásmidos Pete. Mezclas de clones de células se inyectaron por vía subcutánea en ratones SCID. Posteriormente, si se forma un tumor, la expresión de
SEMA3B
,
ZMYND10
y
TUSC2
se evalúa. El derribo de los genes sugiere su importancia para la supresión de tumores.
El análisis inmunohistoquímico de SCLC línea de células tumorales U2020 y la angiogénesis tumoral en ratones SCID
El plásmido Pete /
SEMA3B
se introdujo en la línea celular U2020 SCLC, que produce constitutivamente un transactivador de tetraciclina (tTA) [29]. La sublínea resultante se inoculó por vía subcutánea en ratones SCID. Los ratones se les administró agua potable con doxiciclina (dox +, el gen es OFF) o sin (-DOX, gen es ON). Los ratones fueron sacrificados después de 1 mes. Los tumores o lugares de inyecciones de células se escindieron y se incrustan con parafina. Las secciones fueron 5 micras de espesor. La parafina se disolvió en xileno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), y las secciones de tejido se trató secuencialmente con 99, 95, 75 y 30% de etanol. Los epítopos se recuperaron mediante calentamiento en un horno de microondas durante 5 min en tampón de citrato. anticuerpo de ratón anti-CD31, junto con el conejo-anti-ratón conjugado con FITC anticuerpo secundario (Dako, Karlstrup, Dinamarca), se utilizó para teñir microvasos. El ensayo de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Boehringer Mannheim, Alemania) para la detección de la apoptosis se realizó según el protocolo del fabricante.
DNA y el aislamiento de ARN total, la transcripción inversa-PCR
tejidos nitrógeno congelado se rompieron usando un Mikro-Dismembrator (Sartorius, Alemania). El ADN a partir de tejidos humanos y cultivos de células se aisló mediante extracción con fenol de acuerdo con los protocolos estándar. El ARN total se aisló usando el kit RNeasy mini según lo recomendado por Qiagen (Países Bajos). ARN purificado se cuantificó usando NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies Inc., DE, EE.UU.). la calidad del ARN se evaluó mediante 28S y 18S rRNA bandas después de la electroforesis en un 1% de desnaturalización en gel de agarosa y se analizó usando un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, EE.UU.). La falta de contaminación de ADN se comprobó mediante PCR semi-cuantitativa con cebadores para el gen principal de histocompatibilidad I (
MHCI
, diseñado utilizando Vector NTI, ver Tabla S2). Todas las muestras de ARN fueron tratadas con DNasa libre de RNasa I (Fermentas, Lituania). Se descartaron las muestras de ARN que contienen más de 0,1% de ADN. El ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN total usando M-MuLV la transcriptasa inversa y al azar hexámeros, de acuerdo con el protocolo del fabricante estándar (Fermentas, Lituania).
secuenciación de bisulfito del promotor de la isla CpG de
SEMA3B
gen
conversión de ADN de bisulfito se realizó como se describe en [31, 32] con el uso de 1 a 2 g de ADN (líneas de pulmón y de células renales y los tejidos tumorales /normales). El ADN modificado se purificó usando un kit de purificación de PCR Jetquick de Spin (Genomed, Suecia). ADN modificado se mantuvo a -20 ° C y se utiliza como una plantilla para PCR con los cebadores diseñados (enumerados en la Tabla S2), cuyo producto se secuenció. La amplificación de la
SEMA3B
fragmento de promotor de la isla CpG se realizó en una mezcla de reacción 50 l que contiene tampón de PCR (Tris-HCl 67 mM pH 8,8, sulfato de amonio 16,6 mM, 0,01% de Tween 20); 2,0 mM de MgCl
2; 0,25 mM de cada dNTP; 25 pM de cada cebador; 1 unidad de Taq ADN polimerasa Hot Start (SibEnzyme, Rusia); y 5 a 20 ng de ADN modificado en un Dyad Cycler DNA Engine (Bio-Rad, Estados Unidos) usando el siguiente programa: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de 95 ° C, 15 s; 62 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s y 72 ° C, 7 min. El producto de PCR amplificado se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, y el Spin Kit de extracción de gel Jetquick (Genomed, Suecia). Para la secuenciación, se utilizaron 5 a 10 ng del fragmento de ADN purificado y 25 pM de uno de los cebadores. La secuenciación se llevó a cabo usando una máquina de secuenciación automática (Beckman Coulter).
PCR específica de metilación (MSP)
El ADN tratado con bisulfito, se disolvió en agua destilada dos veces, también se utilizó como una plantilla para MSP. Las condiciones de PCR y cebadores para el alelo metilado y no metilado de intrónica [17] y el promotor (diseñado por DNASTAR Lasergene programa 2000) CpG-islas se dan en la Tabla S2. En el caso del promotor de la isla CpG, se analizaron 6 CpG dinucleótidos (2 por el cebador directo y 4 por el reverso), y en el caso de la intrónica-3 (1 por el cebador directo y 2 por el reverso). PCR se realizó en un amplificador de ADN Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, Estados Unidos) usando el siguiente programa: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de 95 ° C, 10 s; T
Ann (ver Tabla S2), 20 s; 72 ° C, 30 s y 72 ° C, 3 min. La ausencia de producto de PCR en el ADN no convertido se comprobó para cada par de cebadores. ADN de la línea celular de fibroblastos humanos L-68 sirvió como un control alelo metilado; L-68 L-ADN de 68 fibroblastos tratados con LICE metiltransferasa (SibEnzyme, Rusia) SSS I sirvió como control positivo para el 100% de metilación.
Semi-RT-PCR cuantitativa
Para controlar el la transcripción inversa, los cebadores para la transcripción de la beta 2-microglobulina (
B2M
) se utilizaron genes [33]. Semi-RT-PCR cuantitativa se realizó con cantidades iguales de ADNc utilizando los cebadores y las condiciones enumeradas en la Tabla S2. Multiplex PCR con cebadores al
SEMA3B
[17] y
B2M
genes se realizó en condiciones optimizadas para los
SEMA3B
cebadores, y la concentración de
B2M
cebadores fue de 1,5 veces menor. Los productos de la RT-PCR se separaron en geles de agarosa al 2%, y el patrón de bandas se analizaron mediante software GelImager (DNA Technology, Rusia). Un ensayo de número de copia semi-cuantitativo para los marcadores de la región LUCA se utilizó como se describe en otra parte [14].
qPCR
Quantitative PCR se realizó con los cebadores y sondas TaqMan enumerados en la Tabla S2 usando un Sistema 7500 real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). Cada reacción se repitió tres veces. Las secuencias de nucleótidos de los amplicones fueron verificadas por secuenciación en un secuenciador de ADN automatizado Analizador 3730 (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). Se analizaron los datos utilizando la referencia de QPCR genes
GAPDH
,
GUSB
y
RPN1
[34] y la cuantificación relativa o ΔΔCt método como se describe anteriormente [35]. Por lo menos 2 veces-los cambios en el nivel de ARNm se consideraron como significativos a causa de ARNm nivel de variabilidad de los genes de referencia.
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba no paramétrica de Wilcoxon para comparar las diferencias de expresión de mRNA en el blanco y los genes de referencia en las muestras ccRCC y NSCLC. pruebas de suma de rangos de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis, prueba exacta de Fisher y la χ
Se han usado 2 criterios para el análisis de los cambios en el nivel de ARNm y el estado de metilación de los grupos ccRCC y CPCNP con diferentes características patológicas e histológicas. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los datos obtenidos para los grupos de repeticiones. Los valores de P ≤ 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. coeficiente de correlación de Spearman (
r
s
) se utilizó para revelar correlaciones.
Resultados
in vitro
la supresión del crecimiento de las células de SCLC U2020 por
SEMA3B
la línea celular de carcinoma de pulmón de células pequeñas U2020 se transfectadas con Pete
/SEMA3B
o Pete como control. Las células transfectadas se cultivaron durante 15 días. La tasa de crecimiento de las células que expresan U2020
SEMA3B
fue menor que en el control (
P Hotel & lt; 0,01 desde el día 5, ver figura 1A). El ensayo de formación de colonias mostró que el número de colonias de células que contienen U2020 Pete /
SEMA3B
fue menor después de la re-expresión de la
SEMA3B
gen doxiciclina-suprimido en comparación con las células control (890 ± 60 vs 190 ± 40,
P
& lt; 0,01, Fig 1B). Basado en el análisis de FACS-PI, la abundancia de células apoptóticas y necróticas expresando
SEMA3B gratis (sin doxiciclina) se incrementó significativamente en comparación con
células SEMA3B
-off (con doxiciclina): a partir de (7 ± 2) × 10
2 a (49 ± 5) × 10
2
P Hotel & lt; 0,01, ver la figura 1C. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que
SEMA3B
es el inhibidor del crecimiento de células SCLC humana a través de inducción de la apoptosis
in vitro
A-La tasa de crecimiento de las células U2020.: línea discontinua con cuadrados clon-U7111 con Pete /
SEMA3B
, línea continua con círculos células-U2020 con Pete (control); ensayo de formación de colonias de B; análisis de C-PI-FACS de células con y sin expresión de
SEMA3B
. Los valores medios ± desviación estándar para 4 repeticiones están representados en cada caso.
Multi-gen prueba de inactivación en ratones SCID
Hemos informado anteriormente de que la técnica GIT permite la eficiente y inducción controlada de varios genes en las células [29, 30]. Para el experimento MGIT, se utilizó la línea celular U2020 SCLC para la expresión condicional de tres TSG-candidatos situado en 3p21.3:
ZMYND10 gratis (
BLU
),
TUSC2
(
FUS1
) y
SEMA3B
. Mezclas de clones de células que incorporan diferentes genes se inocularon por vía subcutánea en ratones SCID de seis semanas de edad utilizando un (membrana basal de la matriz) técnica de implante Matrigel en ausencia de doxiciclina (los genes están activados).
Una basada en PCR la comparación de los tumores de ratones SCID y clones de células primarias demostró inequívocamente que
SEMA3B
fue derribado de forma selectiva en los tres tumores cultiva
in vivo gratis (ver muestras de 8-10 en la figura 2), mientras que el expresión de
ZMYND10
y
TUSC2
genes no cambiaba en estas condiciones. Estos dos genes más probable es que no antagonizan el crecimiento del tumor de células U2020 en ratones SCID (dejamos esta pregunta abierta porque la búsqueda de la mutación a través mantenerse genes no se incluyó en el MGIT). Estos datos sugieren que SEMA3B es un inhibidor del crecimiento de las células de SCLC humanos
in vivo
.
electroferograma de multiplex PCR a partir de plásmidos, clones y los tumores de los ratones SCID tres genes. M-marcador, 1-PCR a partir del plásmido Pete /
SEMA3B
, 2-PCR a partir del plásmido Pete /
TUSC2
, 3-PCR a partir del plásmido Pete /
ZMYND10
, 4 -PCR a partir U7111 /
SEMA3B
clon de células 1, 5-PCR a partir U7111 /
TUSC2
clon de células 3, 6-PCR a partir U7111 /
ZMYND10
clon de células 4, 7-clones de células mixtas, 8-PCR de tumores 1, 9-PCR a partir del tumor 2, 10-PCR de tumor de 3, 11 de control negativo.
Efecto de
SEMA3B
transgenes en el crecimiento de tumores en ratones SCID y la angiogénesis
El U2020 sublínea con condicional
SEMA3B
expresión bajo el control de la doxiciclina se inoculó por vía subcutánea en ratones SCID. Cuatro ratones recibieron doxiciclina en el agua potable (+ ratones dox, control) de agua y doxiciclina cinco no fueron administrados (ratones -DOX). La aparición de tumores sólidos que expresan activamente
SEMA3B
no se observó en 4 de cada 5 casos (Figura 3, línea roja). En el crecimiento de tumores de ratón activa quinta-Dox (Figura 3, línea amarilla) comenzó una semana más tarde en comparación con el control (Figura 3, línea azul), a pesar de la presencia de
SEMA3B
en la construcción. Sin embargo, la expresión de la
SEMA3B
gen no se detectó en este tumor de acuerdo con el análisis de transferencia Northern (datos no mostrados), sugiriendo la pérdida de
SEMA3B
en estas células. Los tumores (observado en
SEMA3B
-OFF ratones) tenían áreas de la proliferación celular activa, en contraste con los tejidos tomadas de los sitios de las inyecciones de células (en
SEMA3B
-ON ratones), en cuyo se observaron abundantes áreas del estroma celular y necróticas fibrosos y pobremente diferenciados. Estos datos demuestran la posibilidad de
SEMA3B
actividad de supresión tumoral en ratones SCID
La tasa de crecimiento de las células U2020 U7111 (clon) en ratones SCID:. Azules células line-U2020 sin
SEMA3B
expresión (+ doxiciclina, 4 ratones), las células de la línea-U2020 rojas y amarillas con
SEMA3B
expresión (- doxiciclina, 4 ratones y 1 de ratón, respectivamente). * -no Expresión de
SEMA3B
gen de acuerdo con la transferencia de Northern (datos no mostrados). Una ratones + dox y uno-Dox se retiraron del estudio después de un mes
Los tejidos de se analizaron mediante tinción con CD31 y ensayo de TUNEL dos sitios de inoculación: U2020 células. SEMA3B uno negativo (Figura 4A y 4B) y uno SEMA3B-positivo (figura 4C y 4D ratón). anticuerpos de ratón anti-CD31 se utilizaron para teñir los microvasos sanguíneos. Se ha detectado un número muy limitado de microvasos en los tejidos SEMA3B-positivo. Un fragmento que contiene uno de los objetos de microvasos-como se muestra en la figura 4C. señal de microvasos (canal verde) fue co-localizada con la señal de los eritrocitos (canal rojo) resultante de áreas de color amarillo en la figura 4A. Sin embargo, los tumores sólidos SEMA3B-negativas demostraron abundancia de los conductos sanguíneos, comprimidos alargados con fluorescencia típica de los epitelios. Estos conductos tumorales fueron también co-localizada con eritrocitos (Figura 4A). Esto podría apoyar un papel de SEMA3B como inhibidor de la angiogénesis. Sin embargo, se necesitan más experimentos sobre el muestreo extendido para probar esta sugerencia
(A, B) -.
SEMA3B
está en OFF (ratón recibió doxiciclina en el agua potable). (C, D) -
SEMA3B
está en ON (ratón no se les administró doxiciclina). (A, C) -staining con anti-CD31 para supervisar los vasos sanguíneos (señal verde). Cuando
SEMA3B
está en OFF, se observan zonas llenas de eritrocitos (señal roja). señal amarilla indica la co-localización de las señales verdes y rojos. señal azul corresponde al ADN. -TUNEL ensayo (B, D). Observe el área con células apoptóticas (señal verde) cuando el
gen SEMA3B
se expresó.
La hipótesis de que las células SEMA3B-positivas en las áreas sin vasos sanguíneos y los eritrocitos fueron sometidos la muerte celular. Para probar esta hipótesis, las secciones de los mismos fragmentos de tejido se analizaron mediante un ensayo de TUNEL, una detección de la técnica de activación de las células apoptóticas. (Fig 4B, 4D). Se observó una gran área de células apoptóticas en muestra de tejido SEMA3B-positiva, mientras que no hay zona de apoptosis se observó en los tumores SEMA3B-negativo. En este caso, se asumió que la expresión de
SEMA3B
el crecimiento del tumor suprimido
in vivo
, probablemente por la inducción de la apoptosis. La inhibición de la angiogénesis podría sugerirse también.
La metilación del promotor y intrónica
SEMA3B
CpG islas en las líneas de pulmón y de células renales y tumores primarios mediante secuenciación de bisulfito y PCR específica de metilación
el
SEMA3B
gen está compuesto de 18 exones y contiene dos islas CpG-: se encuentra situada en la región promotora (1-st isla CpG, hg38 /chr3: 50,267,308-50,267,797, 22 CpG dinucleótidos) y el otro en el primer intrón (2-nd isla CpG, hg38 /chr3: 50,268,972-50,269,271, 12-CpG dinucleótidos). Se analizó el perfil de metilación de CpG-16 dinucleótidos del promotor isla CpG en líneas celulares de cáncer de pulmón 5 (3 de SCLC y NSCLC 2) y 12 tumores primarios de NSCLC usando secuenciación de bisulfito (5 ADC y 7 de SCC, consulte la figura 5A). metilación densa (& gt; 40% de las GPC analizados fueron metilado) del promotor isla CpG de la
SEMA3B
gen se observó en 2 de 3 líneas celulares de SCLC, pero en ninguna de las líneas celulares de cáncer (NCI -H157 y NCI-H647). Sin embargo, en los 7 tumores primarios de SCC y en 2 de 5 tumores primarios de ADC, se detectó metilación en 2-12 de los CpG. Además, se analizó el perfil de metilación en 9 líneas celulares de cáncer renal y el 25 ccRCC tumores primarios (Figura 5B). metilación densa del promotor isla CpG se observó en 8 de 9 líneas celulares y 11 de 25 tumores primarios ccRCC. Entre los tejidos normales emparejados histológicos, se detectaron los CpG metilados sólo en 2 de 25 casos ccRCC y en ninguno de los 12 casos de NSCLC (Figura 5A y 5B).
Los datos de secuenciación de bisulfito, 16-CpG dinucleótidos (2-17) de la isla CpG se dan. cuadrados grises muestran metiladas CpG dinucleótidos no metilados, cuadrados-blancos. El número de tumores primarios corresponden a los de la Tabla S1. Las cifras en negrita de CpG dinucleótidos (3-4 y 9-12) indican la localización de los cebadores que se utilizaron para el método de MSP.
A continuación, se evaluaron las frecuencias de metilación de ambas islas CpG de la
SEMA3B
gen mediante el método MSP utilizando un conjunto representativo de los tumores primarios. La frecuencia de metilación del promotor de la isla CpG era 44% (7/16) en ADC, 45% (10/22) en SCC y 52% (43/83) en ccRCC. El intrónica isla CpG fue metilado ligeramente menor que la isla promotor en ambos tipos histológicos de NSCLC (ADC -38%, 6/16; SCC -32%, 7/22) y en ccRCC (39%, 32/83; Tabla 2). Las frecuencias de metilación de ambas islas fueron significativamente mayores en los tejidos tumorales que en los tejidos histológicamente normales emparejados (
P
≤ 0,04, véase la Tabla 2). Por lo tanto, la metilación de CpG ambas islas del
SEMA3B
gen es un sello distintivo de pulmón y cáncer renal. Como era de esperar, la metilación de que ni el 1-st ni el 2-nd
SEMA3B
la isla CpG se detectó en ninguna de las muestras de ADN aisladas de linfocitos de la sangre de donantes sanos (n = 15). Los datos del MSP estaban de acuerdo con los resultados de la secuenciación de bisulfito para cada tipo de cáncer investigado.
El uso de un conjunto representativo de los tumores primarios nos permitió revelar posibles correlaciones entre la frecuencia de metilación del promotor y intrónicas CpG islas con los parámetros patológicos e histológicos de los tumores. tumores avanzados ccRCC y CPNM tenían una mayor frecuencia de metilación de la isla CpG en comparación con las primeras etapas (Tablas 2 y 3). La correlación más fuerte se mostró por SCC (coeficientes de correlación de Spearman fueron iguales 0,37,
P
= 0,09 y 0,60,
P Hotel & lt; 0,01, para el 1-st y para el 2- nd isla CpG, respectivamente). Se observó una correlación positiva entre el grado del tumor y la frecuencia de metilación de la isla CpG para el NSCLC y ccRCC (Tabla 3). Esta correlación fue más fuerte que la correlación entre el estadio del tumor y la frecuencia de metilación de la isla CpG para ambos tipos histológicos de NSCLC y casi igual a los de ccRCC (Tabla 3).