Extracto
Antecedentes
específicas para la enfermedad son una herramienta importante para la oportuna y la gestión eficaz de las condiciones patológicas, incluyendo la determinación de la susceptibilidad, el diagnóstico y el seguimiento de la eficacia de las estrategias preventivas o terapéuticas. Los aptámeros, que comprende ADN de cadena sencilla o de doble cadena o ARN, pueden servir como marcadores biológicos de la enfermedad o estados biológicos. Los aptámeros se pueden unir a epítopos específicos sobre macromoléculas en virtud de sus estructuras tridimensionales y, al igual que los anticuerpos, aptámeros se pueden utilizar para dirigirse a epítopos específicos sobre la base de su forma molecular. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el enfoque utilizado para seleccionar aptámeros de alta afinidad para objetivos específicos macromoleculares de entre el & gt; 10
13 oligómeros que comprenden bibliotecas típicos de oligómeros al azar. En el presente estudio, hemos utilizado en vivo SELEX basado en células para identificar aptámeros de ADN que reconocen las diferencias de superficie celular entre las células del cáncer cervical carcinoma de HPV-transformado y, en líneas celulares, revertant nontumorigenic isogénicas.
Metodología /Principales conclusiones
Plenario de células metodología SELEX se ha adaptado para su uso con líneas celulares adherentes (que hemos denominado adherente Cell-SELEX (AC-SELEX)). Usando este enfoque, hemos identificado aptámeros de alta afinidad (rango nanomolar K
d) a los epítopos específicos de la superficie celular de dos revertantes nontumorigenic, nontumorigenic derivados del cáncer de línea celular HeLa cervical humano, y demostró la pérdida de estos epítopos en otro el virus del papiloma humano transformado línea celular de cáncer de cuello uterino (SiHa). También se realizó una investigación preliminar de los epítopos de aptámeros y sus características de unión.
Conclusiones /Importancia
El uso de AC-SELEX hemos generado varios aptámeros que tienen una alta afinidad y especificidad a la no tumoral, de reversión de HPV-transformado células de cáncer cervical. Estos aptámeros se pueden utilizar para identificar nuevos biomarcadores que están relacionados con la carcinogénesis. Paneles de aptámeros, como estos pueden ser útiles para predecir el potencial tumorigénico y las propiedades de las biopsias de cáncer y ayudan en la gestión eficaz de las condiciones patológicas (diagnóstico, resultado predicho, y las opciones de tratamiento) guía
Visto:. Graham JC , Zarbl H (2012) El uso de Cell-SELEX para generar aptámeros de ADN como sondas moleculares de las células asociadas al VPH cáncer cervical. PLoS ONE 7 (4): e36103. doi: 10.1371 /journal.pone.0036103
Editor: Eric Deutsch, Instituto Gustave Roussy, Francia |
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: March 28, 2012; Publicado: 20 Abril, 2012
Derechos de Autor © 2012 Graham, Zarbl. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de Servicios de Salud pública de subvención#NIEHS P30ES005022 (HZ), una beca para JCG de la Comisión de New Jersey en la Investigación del cáncer, Premio #: 09-1962-CCR-EO, y el apoyo institucional de la Escuela de Medicina Robert Wood Johnson, UMDNJ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el segundo cáncer más común que afecta a las mujeres en todo el mundo [1]. Más del 90% de los cánceres cervicales son causados por el VPH, y aproximadamente 10.800 nuevos casos de cáncer de cuello uterino relacionado con el VPH son diagnosticados en los Estados Unidos (USA) por año [2]. Más de 100 tipos de HPV se han clasificado, el más oncogénico de los cuales son HPV16 y HPV18. HPV tipo 16 (HPV-16) está asociado con más de 50% de los cánceres de cuello uterino en todo el mundo [3]. Un estudio reciente demostró que la infección por HPV también se asocia con la actividad sexual y es la principal causa de la creciente incidencia de cáncer de orofaringe en los EE.UU. [4]. Por lo tanto, a pesar de la disponibilidad de una vacuna preventiva para la infección por HPV [5], sigue existiendo una necesidad significativa para el desarrollo de biomarcadores que se asocian específicamente con la carcinogénesis del VPH en lugar de simplemente la infección. Estos biomarcadores específicos de transformación serían útiles para los estudios de progresión de la enfermedad, la prevención, y /o respuesta al tratamiento. A continuación se describe el desarrollo de un enfoque basado en el aptámero para la identificación de biomarcadores de la transformación celular mediada por el VPH-.
El concepto de aptámeros surgió a través de la observación de que las macromoléculas con diferentes estructuras moleculares primarias serán cada adoptar un único, de tres configuración dimensional, cada uno de los cuales se tienen afinidades únicas para la unión a, y formando complejos con otras moléculas [6]. De hecho, es el mismo tipo de variaciones estructurales dependientes de la secuencia que es la base para la unión de anticuerpos al antígeno epítopos específicos. Durante los últimos ~ 20 años, el concepto de unión basado en estructura ha sido explotada para el desarrollo de bibliotecas de aptámero, conjuntos de macromoléculas con secuencias aleatorizadas de ácidos nucleicos (ARN o ADN). bibliotecas de aptámero se criban para su capacidad de unirse preferentemente a moléculas específicas o macromoléculas utilizando SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), que combina el enriquecimiento aptámero mediante la selección iterativa mediante la unión de afinidad y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para descubrir alta afinidad , RNA o DNA de doble cadena o de cadena sencilla específica de la función [6], [7]. Mientras que los aptámeros pueden tener afinidades comparables a las de los anticuerpos monoclonales que tienen varias ventajas. Los aptámeros se pueden producir
in vitro
y por lo tanto no requieren la inmunización, fusión de células, o fermentación para producir cantidades masivas. Una vez que se determina la secuencia de ácido nucleico de un aptámero funcional, grandes cantidades del oligómero específico pueden ser producidos por síntesis química o enzimática a bajo costo y alta eficiencia.
Una aplicación más reciente es célula-SELEX, donde aptámeros que reconocen moléculas específicas en la superficie de las células se desprenden por amplificación repetida y la unión a células vivas [8]. En este enfoque aptámeros se pueden utilizar para identificar una amplia variedad de moléculas, incluyendo ácidos nucleicos, proteínas lípidos, hidratos de carbono, así como la modificación postraduccional de tales moléculas que se encuentran en la superficie de las células expuestas. Significativamente, las células-SELEX ofrece la capacidad única para descubrir marcadores biológicos desconocidos o no identificados asociados con un tipo específico de células, etapa de desarrollo, la exposición, infección, estado biológico o enfermedad. Cell-SELEX se ha utilizado con éxito en cultivos de células no adherentes para identificar aptámeros que pueden reconocer las células de leucemia en muestras biológicas [8], [9]. En el presente estudio hemos adaptado toda célula-SELEX para su uso en líneas de células adherentes (objetivo y no objetivo), un proceso que hemos denominado adherente Cell-SELEX (AC-SELEX) por simplicidad. El uso de AC-SELEX, hemos evolucionado aptámeros que pueden distinguir el virus del papiloma humano (VPH)-transformado células de carcinoma cervical HeLa de revertientes no tumorigénicas de las células HeLa (HF) que retienen un genoma de HPV integrado funcional [10], [11]. La línea celular de HF revertientes se derivó previamente en nuestro laboratorio a partir de células HeLa expuestos a una dosis única mutagénico de, ethylmethylsulfonate (EMS), seguido por la selección de clones de células que perdió la Rodamina 123 tiempo de retención característico prolongada de la mayoría de las células del cáncer [12] . En relación con las células HeLa parentales, las células tienen un fenotipo de HF no transformado, disminución de la eficiencia de clonación en agar blando y no son tumorigénicas en ratones desnudos atímicos [11]. células híbridas de células HF × HeLa generados por fusión de células mostraron una reducción significativa en la clonación de la eficiencia en agar blando, lo que sugiere la activación de un gen supresor tumoral dominante en las células de HF y el análisis molecular indicó la reactivación del gen supresor de tumores p53 en células de HF, pero sin la pérdida, reordenamiento, o la reducción en la expresión de las oncoproteínas E6 HPV /E7 [10], [11]. Dado que las células de HF son isogénicas con las células HeLa, las diferencias en sus patrones de expresión de genes son propensos a ser asociada con la pérdida del fenotipo tumorigénico, haciendo de este el par de células ideal en el que la búsqueda de marcadores biológicos de la transformación de células HPV mediada.
Aquí nos informe sobre el descubrimiento de los aptámeros de ADN de cadena sencilla con alta afinidad por epítopos que se enriquece en la superficie del adherente, no tumoral línea celular HF respecto a la línea celular HeLa tumorigénico. La capacidad de los aptámeros para detectar biomarcadores perdidos durante la transformación celular mediada por el VPH-fue validado en la línea celular de carcinoma de cuello uterino SiHa. Los resultados de este estudio indican que los aptámeros se pueden utilizar para dilucidar biomarcadores candidatos para los cambios celulares asociados con y /o contribuir a la generación de un fenotipo no tumorigénicos en las células infectadas por el VPH.
Resultados
adherente de la célula-SELEX e identificación de Target-Cell candidatos aptámeros específico
para adaptar el conjunto de células adherentes en SELEX para células en cultivo, que utlized el procedimiento descrito en la Figura 1. los aptámeros fueron dirigidos a la célula no tumoral HF línea, utilizando células HeLa isogénicas de contra-selección negativa. Después de dieciocho ciclos de selección positiva /negativa identificamos sondas moleculares que eran altamente específicos para la línea de células revertientes HF (Tabla 1). Hemos secuenciado once candidatos aptámeros y de éstos, cuatro fueron escogidos al azar para su posterior análisis de la secuencia de ADN y estudios de unión (negrita en la Tabla 1). Desde aptámeros pueden ser considerados como que comprende las bibliotecas "forma", se generaron estructuras secundarias potenciales para cada uno de los aptámeros seleccionados y se calcularon las energías libres relativos para cada una de las estructuras predichas [13] (Figura 2).
Una biblioteca de partida de & gt; se utilizó 10
15 aptámeros y dieciocho rondas de AC-SELEX se llevaron a cabo para purificar y amplificar los aptámeros que reconocen epítopos presentes en las células de HF y no presente en las células HeLa La biblioteca de partida se incubó primero. con la línea celular HeLa y los aptámeros no unidos fueron recuperados y utilizados para el procedimiento de AC-SELEX.
las estructuras secundarias para cada uno de los aptámeros investigado. la estructura (s) con la energía libre más bajo ( dG) se presentan. estructura secundaria predicciones se determinaron utilizando el software UNAfold y son sir_graph ® de salida [13].
aptámeros sitios de unión en las células diana
Una vez que obtuvimos las secuencias de nucleótidos para nuestros aptámeros específicos de células diana, los correspondientes oligonucleótidos de ADN de una sola hebra se sintetizaron con las etiquetas FAM fluorescentes. Los aptámeros marcados se incubaron a continuación con las células de alta frecuencia para determinar la localización celular de sus sitios de unión (Figura 3). Los aptámeros conjugados FAM también se incubaron con las células HeLa parentales para verificar unión diferencial.
Imágenes de células HF y HeLa incubadas con aptámeros marcados fluorescentemente. Los aptámeros son específicos para la línea celular HF no tumorigénicos. Ellos reconocen epítopos sobre o dentro de las células HF y no reconocen sus sitios de unión en las células HeLa oncogénicas. Todas las imágenes son 40 × y son de células dentro de las 24 horas después de la incubación con 2000 aptámeros nm y posterior fijación y montaje de porta con Aquamount.
formación de imágenes confocal y reconstrucción de la imagen usando z-pilas se utilizó para determinar el celular la localización de los complejos de aptámero de epítopo (Figura 4). Los sitios de unión de aptámeros 13, 14, 20 y 28 parecen estar localizadas en la superficie celular. Aptámero 14, sin embargo, también parece estar la unión a la región perinuclear dentro de la célula, que es coherente con la unión del aptámero 14 a epítopos en la superficie celular seguido por el transporte a la región perinuclear. Aunque el mecanismo por el cual esto oligómero entró en la celda no está claro, pre-incubación de las células de HF con proteinasas (proteinasa K o tripsina durante 2 ó 10 minutos antes de la aptamer vinculante) no afectó a la capacidad de las células para internalizar el FAM marcada aptámeros. Por el contrario, el tratamiento con proteinasa redujo significativamente la capacidad de los aptámeros de 13, 20 y 28 para unirse a las células, lo que sugiere que se asociaron con epítopos en proteínas de la superficie celular.
Imágenes de células HF con aptámeros FAM etiquetados. Los aptámeros 13, 20 y 28 parecen estar de unión únicamente a las superficies de las células, mientras que aptámero 14 también está siendo internaliza en el citoplasma de la célula. Todas las imágenes son de 40 × y son de células dentro de las 24 horas después de la incubación con aptámeros 2000 nm y la posterior fijación y montaje de porta con Aquamount.
aptámeros características de unión
Para determinar el equilibrio de unión de los aptámeros a sus epítopos de HF, se incubaron las células con concentraciones de HF incrementales de la FAM etiquetados aptámeros y midieron la fluorescencia de las células individuales (Figura 5). Sobre la base de nuestro análisis, todos los aptámeros evaluados mostraron una alta afinidad de unión a sus epítopos: aptámero 13 (K
d = 2,5 ± 0,5 nM); Aptámero 14 (K
d = 7,1 ± 0,4 nM); aptámero 20 (K
d = 1,6 ± 0,4 nM); y aptámeros 28 (K
d = 6,9 ± 0,2 nM).
fluorescencia cuantificación de los aptámeros FAM-marcado unido a las células de HF. curvas de unión de aptámeros (línea de datos y puntos) se generaron mediante la representación gráfica de la fluorescencia media con las barras de error representan el error estándar de la media para cada punto de datos (n = 4 por punto de datos). Estos datos se ajustaron al modelo Y = Bmax * X (Kd + X) (línea continua) que se generó mediante análisis de regresión no lineal para la unión específica de un sitio: aptámero 13 (K
d = 2,5 ± 0,5 nM); aptámero 14 (K
d = 7,1 ± 0,4 nM); aptámero 20 (K
d = 1,6 ± 0,4 nM); y aptámero 28 (K
d = 6,9 ± 0,2 nM).
aptámero especificidad para el, línea celular de cáncer cervical por VPH-transformado no tumorigénicas
Para investigar si la aptámeros evolucionado para unirse a células de HF no tumorigénicas estaban reconociendo diferencias de la superficie celular específica de revertientes no tumorigénicas, que también examinó la unión a un clon independiente de revertientes no tumorigénicas de las células HeLa (HA) y a otro carcinoma cervical HPV-transformado línea celular (SiHa). Las incubaciones de la FAM etiquetados aptámeros con las líneas celulares de HA y SiHa (Figura 6) ilustran que los aptámeros específicos para las células no transformadas HF también ligados al clon revertientes HA pero no se unen a las células SiHa transformadas. Estos resultados indicaron que los aptámeros evolucionado contra las células revertientes HF son específicos para los epítopos que se perdieron durante la transformación inducida por el VPH de las células del cuello uterino. Los estudios que utilizan los reactivos de aptámeros para cromatografía de afinidad están en curso para purificar e identificar las macromoléculas que albergan los epítopos.
Las imágenes que representan la reversión no transformada, línea celular HA y la línea celular de cáncer cervical por VPH-transformado, SiHa, después de la incubación con aptámeros FAM etiquetados. Los aptámeros generados para apuntar el revertientes no transformada, línea celular HF también reconocen la revertientes no transformada, la línea celular HA. Observe también que estos aptámeros no reconocen epítopos en la línea celular de cáncer cervical SiHa, similar a los resultados que observamos con la línea celular de cáncer cervical HeLa. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que estos aptámeros están reconociendo epítopos que se pierden como resultado de la transformación de las células epiteliales del cuello uterino por el VPH. Todas las imágenes son de 40 × y son de células dentro de las 24 horas después de la incubación con aptámeros 2000 nm y la posterior fijación y montaje de porta con Aquamount.
Discusión
biomarcadores altamente sensibles y específicos son extremadamente útiles para el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de los casos de cáncer. Cell-SELEX es un
in vitro
procedimiento a través del cual los aptámeros se pueden elegir por su capacidad para unirse diferencialmente a las células [14], sin ningún conocimiento previo de los cambios celulares. Los aptámeros pueden unirse con alta afinidad y especificidad a una variedad de moléculas de [15], [16], [17] y ofrecer una alternativa única a los anticuerpos que son mucho más grandes, fácilmente degradado, costoso y requiere mucho tiempo para desarrollar, y requieren la uso de los animales [18]. de ácido nucleico basada en aptámeros son fácilmente sintetizados y pueden sufrir desnaturalización reversible para la amplificación PCR. También pueden reconocer moléculas pequeñas como las toxinas [19], [20] y las moléculas que no son complejos no inmunogénicas [21] y aptámeros pueden ser fácilmente modificada con moléculas indicadoras u otras moléculas para mejorar sus propiedades (es decir, la mitad de la vida) [18 ]. Los aptámeros también adoptan formas tridimensionales únicas dependientes de la secuencia, por lo que son en cierto sentido, librerías de formas y puede unirse a una celda en función de su secuencia, la conformación y /o carga a través de las interacciones con los bolsillos de unión, enlaces de hidrógeno, el apilamiento de aromáticos anillos, fuerzas de van der Waals, o una combinación de éstos [22]. Los aptámeros pueden interferir con las interacciones proteína-proteína, y competir por interferir con los sitios de unión, interferir con el accesorio de virus-célula, la transcripción y la traducción del ARNm [23]. Debido a su pequeño tamaño, aptámeros también pueden ser capaces de acceder a epítopos que son normalmente bloqueados /ocultos a otras sondas /terapéutica. Estas propiedades deseables, aptámeros permitirse la capacidad de servir como agentes terapéuticos [21], [24], [25], [26], [27].
Los aptámeros que ya se están utilizando en la biología del cáncer y la medicina del cáncer [28], [29], [30]. El uso de aptámeros alta afinidad por células SELEX, los investigadores han identificado que aumentan la sensibilidad de cáncer pancreático a agentes quimioterapéuticos [31], entregar agentes terapéuticos en las células del cáncer [32] o reconocer células de cáncer en muestras biológicas [8], [9]. SELEX también ha permitido a los investigadores a identificar aptámeros que se dirigen a antígenos de transformación específico, tales como las oncoproteínas E6 y E7 de HPV-16, en extractos de células de cáncer cervical [33], [34]. Aquí nos muestran que el AC-SELEX también se puede utilizar para identificar marcadores de la superficie celular que se alteran durante la transformación celular inducida por el VPH.
Para evolucionar aptámeros que diferencian las células HPV-transformado de células no transformadas cervical sin
a antes
selección de epítopos o blancos, que adapta su conjunto de células en SELEX para su uso en líneas de células adherentes (Figura 1). Usando este enfoque, hemos identificado y validado de forma independiente aptámeros que tienen alta afinidad por las proteínas o antígenos de la superficie celular que son específicos para y presente en la superficie de revertientes nontumorigenic de células HeLa, pero no están presentes sobre el VPH transformado líneas celulares de carcinoma de cuello uterino (Figura 3 ). Es importante destacar que, dos líneas de células revertientes derivados de forma independiente (HF y HA) continuar expresando las oncoproteínas HPV E6 y E7, pero a diferencia de las células HeLa parentales, las líneas de alta frecuencia y de células HA tienen una morfología no transformado, el crecimiento inhibido de contacto, redujo significativamente la clonación eficiencia en agar blando, y la incapacidad de formar tumores en ratones nude [10], [11]. En una sola pantalla, hemos sido capaces de identificar secuencias de aptámero único once que reconocen específicamente y se unen a ligandos presentes en las células revertientes HF no transformadas, pero no en las células HeLa (Tabla 1). En base a los resultados, aptámeros 13, 20 y 28 se unen a epítopos de alta frecuencia de la superficie celular específico, mientras aptámero 14 es vinculante a la superficie celular y se internaliza en el citoplasma de la célula (Figura 4). La capacidad de abolir la unión con el pretratamiento de las células con proteasa aptámero sugirió que tres de los cuatro aptámeros ensayados epítopos en proteínas de superficie celular reconocidos. Aptámero 14 fue capaz de entrar en las células independientes de proteínas de la superficie celular de unión, o se reconoce un epítopo resistente a la proteasa de la superficie celular que se internaliza el complejo de aptámero. En conjunto, estos hallazgos indican que el AC-SELEX fue capaz de evolucionar aptámeros que reconocen los cambios en las macromoléculas de la superficie celular que distinguen el tumorigénico de las células no tumorigénicas infectadas por el VPH, lo que sugiere utilidad como sondas diagnósticas.
Para explorar su potencial de pronóstico , aptámeros 13, 14, 20 y 28 fueron probados con una línea independiente VPH-positivo de células de cáncer de cuello uterino, SiHa, y una línea adicional, no tumorigénicos de reversión celular, HA. De manera significativa, se observó que los aptámeros reconocían sus epítopos de células de HA no tumorigénicas, pero no se unió a las células SiHa tumorigénicas (Figura 6), que apoya la hipótesis de que los aptámeros reconocen marcadores perdidos durante la transformación del VPH mediada por las células epiteliales del cuello uterino . Dado que las líneas celulares de alta frecuencia, HA y HeLa son isogénicas, esperamos que las diferencias en la expresión de genes no relacionados con la transformación de ser mínimos, y por lo tanto que los aptámeros evolucionado es probable que reconocer biomarcadores indicativos y epítopos de tumorigenicidad de células del cuello uterino importantes. Estos resultados indican que los aptámeros generados por AC-SELEX tienen la capacidad de reconocer preferentemente líneas celulares de cáncer de cuello uterino altamente tumorigénicas en relación con revertientes línea celular de cáncer de cuello uterino no tumorigénicas.
En resumen, el presente estudio demostró la viabilidad de Adherente Cell-SELEX, así como su utilidad en la detección de epítopos que se pierden como resultado de la transformación de las células epiteliales del cuello uterino por el VPH. Los paneles de los aptámeros como estos, evolucionado frente a diferentes líneas de células tumorales para distinguir los tipos de cáncer y subtipos pueden ser útiles se utiliza para relacionar el diagnóstico y pronóstico y para determinar la quimioterapia y la susceptibilidad a la enfermedad (es decir, las diferencias genéticas).
Materiales y Métodos
Cell Culture
el paso ATCC CCL2 clon temprana de las células HeLa, así como la línea celular de carcinoma de cuello uterino SiHa se obtuvieron de la American Type Culture Collection. células de HF y HA se obtuvieron de experimentos llevados a cabo con anterioridad en el que la selección de revertientes no transformados se obtienen a partir de la pérdida de rodamina 123 de las mitocondrias de las células [11]. células HeLa, HF, HA y SiHa fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (Gibco) con suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1%.
SELEX Biblioteca y cebadores
Escoger secuencias de ADN de cadena con 52 nucleótidos aleatorios flanqueados por conocidos sitios de los cebadores 18-nt se obtuvieron de Integrated DNA Technologies. El primer secuencias fueron 5'-ATACCAGCTTATTCAATT y 5'-AGA TAG TAA GTG CAA TCT. La FAM etiquetados cebadores fueron creados como 5'-FAM ATACCAGCTTATTCAATT y la biotina etiquetados cebadores fueron creados como 5'-Biotina-AGATTGCACTTACTATCT.
Procedimientos SELEX
Antes de comenzar, a partir de una biblioteca de aproximadamente 1,6 × 10
15 aptámeros se incubó con células HeLa que la no diana y, a continuación, los aptámeros no unidos se recuperaron y se prepararon para la primera ronda de la CA-SELEX. Antes de cada ronda, los aptámeros se desnaturalizaron por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos y después se enfrió brevemente en hielo durante 2 minutos. Para cada ronda de incubaciones, 3 × 10
5 HF células se enjuagaron con PBS y se incubaron en hielo con la biblioteca de aptámeros en tampón (1% de BSA en PBS con sales) de unión con agitación suave. Después las células se enjuagaron con PBS y los aptámeros que unido a las células de HF se eluyeron a través de la adición del tampón de elución (NaCl 100 mM, Tris 7,5 10, EDTA 1 mM y SDS al 1%) y se recuperó utilizando el prep de ADN Hirt método [35] que implicaba la extracción con fenol, extracción con fenol-cloroformo, cloroformo extracción. También incorporamos un paso atrás-extracción para asegurar la recuperación adecuada aptámero. Después se retiró el ADN genómico a partir de la solución de etanol. Los aptámeros se recuperaron de la solución por precipitación con etanol (3 M NaOAc en 100% de etanol) y se dejó sedimentar durante la noche a -20 ° C. Después, la muestra resultante se centrifugó y el sedimento se enjuagó dos veces con 70% de etanol y se dejó secar. El sedimento se reconstituye en tampón de unión y se incubó con 10 células
6 HeLa para contra-selección aptámero. Después las células se enjuagaron con PBS y los aptámeros no vinculantes fueron recuperados de este agua de enjuague de nuevo utilizando el método de Hirt, que incluye una etapa de extracción de la espalda, seguido de precipitación con etanol de aptámeros. Las bibliotecas de aptámero resultantes se amplificaron mediante PCR con un cebador biotina-etiquetados y un cebador no-biotina-etiquetados (Integrated DNA Technologies), y los aptámeros de doble cadena resultantes se separan entonces usando perlas recubiertas con estreptavidina y centrifugación en columna para separar los no deseados secuencia de biotina-etiquetados de la secuencia de aptámero deseada (Ver PCR y aptámeros Strand Separación). Los aptámeros de una sola hebra resultantes se precipitaron y se utilizaron para la siguiente ronda de la CA-SELEX.
PCR y aptámeros Strand Separación
Los aptámeros resultan de la etapa contra-selección se reconstituyeron con tampón de elución (100 mM NaCl, mM Tris 7,5 10, EDTA 1 mM y 1% SDS) y se amplificó mediante PCR con los cebadores de biotina marcada con (94 ° C durante 30 seg, 46 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg) en un Eppendorf AG-22331 termociclador (Hamburgo, Alemania). Las condiciones para la amplificación por PCR de bibliotecas de aptámero difiere de la de ADN homogénea. PCR se optimizó alrededor de la realización de 18 rondas de AC-SELEX. La investigación con un nucleótido al azar de esta longitud similar ha demostrado que la formación de producto alcanza un máximo a los 18 rondas y si no se realiza más de 20 rondas de PCR, subproductos comenzar a formar y hay un riesgo de pérdida completa de producto aptámero [36 ]. Los aptámeros de doble cadena de biotina-etiquetados resultantes se hirvieron durante 5 minutos, flash enfrió en agua con hielo durante 3 minutos, y se incubaron con perlas recubiertas con estreptavidina en tampón de la columna de unión (NaPO4 20 mM, NaCl 150 mM) antes de la centrifugación de la columna. Los aptámeros de cadena sencilla resultantes se precipitan a partir de la columna de flujo a través a través de la precipitación con etanol. Después, el sedimento aptámero se reconstituyó en PBS con 1% de BSA y esta solución aptámero se utilizó para la siguiente ronda de la CA-SELEX.
aptámero Clonación
Después de 18 rondas de AC-SELEX, la piscina aptámero resultante se amplificó por PCR con cebadores no modificados. A continuación, la biblioteca de aptámeros resultante se ligó en plásmidos y se clonó en Escherichia coli utilizando el kit de
TOPO TA
clonación que contiene pCR®2.1-
TOPO
® (
Invitrogen
, K4500-01). Los plásmidos se purificaron utilizando QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, 27106). Las concentraciones de los plásmidos purificados resultantes se determinaron utilizando el Nanodrop TM 1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific). entonces PCR seguida de electroforesis en gel se realizó en las muestras de plásmido purificado para asegurar una inserción de la longitud apropiada.
aptámero Secuenciación
aptámeros de doble cadena fueron secuenciados utilizando el M13 cebadores directo e inverso proporcionados en el kit de clonación TOPO 10. Los plásmidos fueron secuenciados por la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey Facilidad de ADN Core (Piscataway, NJ).
Las predicciones plegables ADN
Las estructuras secundarias de los aptámeros de ADN de cadena sencilla se prevé utilizar software mfold UNAfold (http://mfold.rna.albany.edu). Las estructuras que se presentan son emitidas desde sir_graph ® desarrollado por D. Steward y M. Zuker [13].
Imaging de Cell-aptámero Complejos
aptámeros FAM 5 'de etiquetado se sintetizaron por el ADN integrado tecnologías. Las células fueron cultivadas en portaobjetos de cámara, que se cultiva durante la noche, se lavó con PBS y luego se dejaron incubar con el aptámero marcado con fluorescencia (s) en PBS con 1% de BSA en hielo durante 45 minutos. Las células fueron lavadas con PBS antes de la fijación con 4% de paraformaldehído. Las células fijadas se aclararon con PBS y rápidamente con DNasa libre de agua y se montaron usando Aquamount (Polysciences, Inc.). aptámeros por células unidas se entonces imágenes utilizando un microscopio confocal Leica.
fluorescencia Cuantificación Análisis
La fluorescencia de los complejos de células aptámero se midió utilizando software Leica Lite. Las células se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio confocal Leica y cuantificados individualmente utilizando software Leica Lite. Cuatro células fueron cuantificados por punto de datos después de la sustracción del fondo. La fluorescencia media se representa gráficamente con las barras de error representan el error estándar de la media para cada punto de datos. valores de Kd aparentes para cada aptámero se determinaron por regresión no lineal para en el sitio de unión de acuerdo con la ecuación: Y = Bmax * X /(Kd + X) utilizando GraphPad Prism versión 5.04 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California EE.UU., www. graphpad.com [37].
proteinasa tratamiento de las células
Hemos diseñado nuestro procedimiento de AC-SELEX para permitir la unión a la superficie epítopos de proteínas que pueden ser sensibles a las proteasas aptámero. con el fin de determinar que los epítopos aptámero fueron sensibles a las proteasas, se trataron las células diana con proteasas un mínimo de 4 veces para cada proteinasa y aptámero y se determinó la unión de aptámeros. las células se trataron con tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM en HBSS o 0,1 mg /ml de proteinasa K en PBS a 37 ° C durante 2 y 10 min. a continuación, se utilizaron las células diana tratadas proteinasa de aptámero marcado con fluorescencia de unión como se ha descrito anteriormente.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a la doctora Denise Galloway para la línea celular de cáncer cervical SiHa, el Dr. Paul Thomas y el Dr. Carol Gardner para obtener ayuda con los equipos y protocolos, y Christal Lewis por su ayuda en la optimización de la PCR.