Extracto
El uso de líneas celulares o modelos animales tiene desventajas significativas cuando se trata de un conjunto de enfermedades heterogéneas como el cáncer epitelial de ovario. Esto tiene relevancia clínica en la que los biomarcadores desarrollado utilizando modelos de líneas celulares o animales a menudo no son transferibles a la práctica clínica. En este estudio, se describe el desarrollo de un protocolo robusto para el desarrollo de cultivos primarios de cáncer de ovario que superar algunas de estas dificultades. Las mujeres sometidas a cirugía para el cáncer de ovario fueron reclutados y muestras de ascitis y depósitos de tumores sólidos se utilizaron para desarrollar cultivos primarios. Las células se caracterizaron utilizando un panel de anticuerpos inmunofluorescentes antes de su uso en una variedad de ensayos que incluyen la evaluación funcional de las vías de reparación del ADN. Durante el período de estudio de cuatro años, cultivos viables, confirmaron que ser de origen epitelial fueron generados a partir de 156 de 172 (91%) casos reclutados. Caracterización se llevó a cabo utilizando un panel de anticuerpos que incluyen pancytokeratin, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 y vimentina. La senescencia se produjo entre el 2
ª y 8
º pasajes en todas las culturas, excepto uno, en el que se produjo la inmortalización espontánea. Las células podrían cultivarse con éxito incluso después de un periodo de almacenamiento a 4 ° C y las células cultivadas son capaces de ser utilizados para una variedad de aplicaciones, incluyendo ensayos funcionales. Tras la evaluación funcional, hubo poca heterogeneidad intra-tumoral. Por tanto, es posible derivar los cultivos de células de cáncer de ovario viables en la mayoría de los pacientes sometidos a cirugía. Las células cultivadas directamente de los cánceres de pacientes proporcionan un modelo preciso y altamente diversa
Visto:. O'Donnell RL, McCormick A, Mukhopadhyay A, Woodhouse LC, Foso M, Grundy A, et al. (2014) La utilización de células de un cáncer ovárico de pacientes sometidos a cirugía para generar cultivos primarios capaz de someterse a análisis funcional. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10.1371 /journal.pone.0090604
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Noviembre 2013; Aceptado: February 2, 2014; Publicado: 6 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 O'Donnell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de mortalidad por cáncer ginecológico. en todo el mundo [1] ya pesar de mucha investigación en el tratamiento del cáncer de ovario la mortalidad global ha cambiado poco en los últimos 20 años, con una supervivencia global a los 5 años del 30-39% [2]. Durante mucho tiempo ha sido reconocido por los médicos de que el cáncer de ovario es un conjunto de enfermedades heterogéneas pero a pesar de este carcinoma de ovario sigue siendo tratado clínicamente como una enfermedad única utilizando una combinación de cirugía de citorreducción y quimioterapia basada en platino. La variación observada en el comportamiento clínico de cáncer de ovario junto a los crecientes informes de datos heterogeneidad molecular sugiere que un modelo heterogéneo para el estudio del cáncer de ovario es desde hace mucho tiempo. El concepto emergente de la medicina personalizada basada en biomarcadores de respuesta a nuevos tratamientos dirigidos defectos específicos en la reparación del ADN tumoral sólo es posible si los biomarcadores pueden ser probados utilizando un modelo realista.
líneas celulares establecidas proporcionan una valiosa herramienta para el estudio biológico funciones a nivel molecular y celular. líneas celulares de cáncer de ovario humano existentes poseen la ventaja de una alta capacidad proliferativa, clonogenecity y su vida útil extendida en la cultura. Sin embargo, la mayoría han adquirido alteraciones genéticas significativas de sus células de origen, incluyendo la eliminación de importantes genes reguladores del ciclo celular que apoyan la inmortalidad. Además, hay evidencia que sugiere que muchas líneas celulares contienen una identificación errónea significativa, la duplicación, y pérdida de la integridad [3].
Las células primarias aisladas de pacientes a menudo son considerablemente diferentes de líneas celulares establecidas de origen similar. La capacidad de la cultura y caracterizar OSE recién aisladas (epitelio superficial del ovario) y EOC (cáncer de ovario epitelial) células de pacientes ofrece un importante sistema experimental que tiene el potencial para asemejarse a la situación del paciente con mayor precisión [4], [5].
Hay dos fuentes de material clínico que se han utilizado para generar cultivos primarios en cáncer de ovario: líquido ascítico y el tejido de tumor sólido. estudios de expresión génica han indicado diferentes perfiles biológicos en las células cancerosas derivadas de estas dos fuentes del mismo paciente en términos de la metástasis, invasión y la angiogénesis [6]. El líquido ascítico tiene varias ventajas sobre el tejido de tumor sólido en la generación de cultivos primarios. El líquido ascítico es relativamente fácil de obtener y cultivar las células en suspensión es técnicamente sencillo. culturas ascíticos se han demostrado para generar una rica población de células epiteliales homogénea en comparación con los obtenidos a partir de tejidos sólidos. Un porcentaje importante de pacientes con cáncer de ovario presente en una fase avanzada y tienen grandes volúmenes de líquido ascítico que se puede obtener durante la cirugía o la paracentesis. Sin embargo, como la mayoría de los pacientes con grandes ascitis de volumen tienen tumores de un subtipo histológico seroso de alto grado, ascitis solamente de muestreo subrepresentar los otros subtipos histológicos. Por lo tanto, se requiere también la cultura de tumor sólido, sobre todo en ausencia de ascitis para capturar a un grupo representativo de muestras.
cultivo de células primarias de cualquier fuente podría proporcionar un recurso para probar el perfil molecular y la realización de estudios funcionales de individuo tipos de cáncer. En los últimos años la asociación entre el tumor heterogeneidad molecular, la supervivencia y /o la respuesta al tratamiento ha sido reconocida [7] y ha impulsado la búsqueda de biomarcadores para predecir la respuesta a nuevas terapias dirigidas vías de reparación del ADN desregulados en el cáncer de ovario.
se han descrito varios métodos para el cultivo de células de cáncer de ovario primarios aislados a partir de ascitis [8]. Sin embargo estos métodos requieren procedimientos complejos de múltiples pasos. Dunfield
et al
y Shepherd
et al
describir un método de cultivo más simple y fiable que implica ascitis de mezcla directamente con un medio que se traduce en cultivo de células epiteliales [4], [9]. Esta técnica ha sido adaptada por nuestro grupo para su uso en la investigación sobre el estado funcional de los mecanismos de reparación del ADN y aquí nos presenta la experiencia de esta técnica.
Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el comité de ética local (Reino Unido IRAS Noroeste comité de ética - 12 /NW /0202). y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito
Reactivos
Rucaparib fue un regalo de Clovis (EE.UU.) y es un potente inhibidor de PARP-1 y -2 proteínas (con una constante de inhibición de & lt; 5 nM). Todos los demás productos químicos y reactivos de cultivo de tejidos fueron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Reino Unido), a menos que se indique lo contrario.
Cell Cultura y
Recogida de muestras.
La ascitis y sólida el tejido se recogió de los pacientes sometidos a cirugía dado su consentimiento para el cáncer de ovario en el hospital Queen Elizabeth, Gateshead, Reino Unido. Los detalles clínicos se registraron y especímenes registrados y manipulen de conformidad con la Ley de Tejidos Humanos. Las muestras se les asigna un número de referencia PCO (cultivo primario de ovario) para retener el anonimato.
transporte de la Muestra y preparación.
La ascitis se aspiró directamente del paciente en una botella de succión estéril. tumor sólido se colocó en un medio de cultivo que contiene universales estéril (RPMI 1640 suplementado con 20% de FCS, 20 mM de L-glutamina y 1% de penicilina y estreptomicina) previamente calentada a 37 ° C. Las muestras fueron transportadas desde el hospital al laboratorio de inmediato en cumplimiento de la normativa del Reino Unido de la categoría B UN3373.
cultivo primario de ascitis.
El cultivo celular se realizó utilizando una técnica aséptica en un nivel de contención laminar II fluya cabina de seguridad microbiológica. Se añadieron 20 ml de ascitis a 20 ml de medio de cultivo calentado (RPMI con FCS, como por encima de 20%) en matraces T75 (Corning, EE.UU.) y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2, 95% de aire humidificado . El medio se aspiró y se reemplazó 13 ml de medio fresco calentado en días 3 a 5. El medio fue reemplazado cada 4 a 5 días hasta que las células acercado confluencia. Las células se pasaron, congelados y descongelados como se describe anteriormente [10]. Los cultivos celulares fueron puestos en cuarentena en una incubadora de primaria a la espera de los resultados formales de examen patológico y para asegurar que las muestras infectadas no se introdujeron en la cultura general.
El cultivo primario de tumor sólido.
Una vez en el laboratorio, el tumor sólido se disecó en ~ 3 mm
3 piezas con un bisturí estéril y se transfirieron a matraces T25 suficiente solución de colagenasa /dispasa (Roche, Reino Unido) (1 mg /1 ml en medio completo) que contienen para sumergir completamente la muestra. Las células se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en un agitador orbital (IKA-Vibrax-VKR) a 2 x g. La suspensión celular se transfirió a un recipiente universal y se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos, se lavó PBS, re-suspendieron en medio completo y se colocaron en un matraz T25 durante 30 minutos para permitir la siembra de fibroblastos. La suspensión de células epiteliales se transfirió a un matraz T25 para
optimización en curso de cultivo de células. Cultura y
cultivo directo en cubreobjetos.
Tiempo desde la recogida hasta la evaluación funcional puede ser hasta 14 días. Para reducir la longitud de la cultura y gastos de envío antes de su uso, y se añadió medio líquido ascítico (01:01 v:v) directamente sobre la cubierta se desliza estéril para su análisis inmediato.
citogiro.
ascítico fluido se cytospun directamente sobre portaobjetos de microscopio después de la optimización de la velocidad de centrifugación, el volumen de la muestra y el enriquecimiento de líquido ascítico mediante la adición de tampón de lisis de glóbulos rojos. Tras cytospining, los portaobjetos se secaron al aire, se fijaron con metanol al 100% y se almacenaron a -20 ° C para su caracterización posterior.
Caracterización
El cáncer de ovario es un conjunto de enfermedades heterogéneas. Además, el líquido ascítico contiene una variedad de tipos de células y por lo tanto un solo marcador es insufficent para diferenciar de manera fiable las células de cáncer de ovario epiteliales de otros tipos de células. Un panel de caracterización que consiste en la morfología de cultivo celular, la tinción de inmunofluorescencia de células fijadas, así como el examen patológico e inmunohistoquímica estándar se combinó para asegurar caracterización epitelial precisa de todas las culturas.
Morfología.
características morfológicas se estudiaron en un microscopio invertido Olympus CK40 a 20 × magnificación. Las imágenes fueron capturadas usando software VisiCam (VWR, EE.UU.).
inmunofluorescencia.
Las técnicas estándar para la inmunofluorescencia se utilizaron para teñir para pancytokeratin, molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), antígeno de cáncer 125 (CA125 ), relacionados con el antígeno epitelial (MOC-31), D2-40 y vimentina, Tabla 1. Ninguno de los marcadores positivos se expresan de manera uniforme en todas las células EOC pero interpretada en combinación permiten la selección de cultivos apropiados.
histopatología formal
examen patológico y citológico formal de ascítico y muestras de tumores sólidos de pacientes que donan muestras de PCO se llevó a cabo y se utiliza para caracterizar mejor las culturas.
Cuando todas las caracterizaciones están en consonancia con epitelial origen ovárico, las muestras se utilizó en experimentos posteriores. Cuando los resultados fueron inconsistentes con origen epitelial, se descartaron las culturas.
ImageStream X caracterización
PCO culturas establecidas y ascitis frescas.
células cultivadas OPC, utilizando los métodos anteriormente, se tripsinizaron, se fijaron con paraformaldehído al 0,4% durante 20 minutos a 4 ° C, y se permeabilizaron con BD PhosFlow Perm /lavado I (BD Biosciences, EE.UU., una y diez v:v agua destilada).
para ascitis frescas, se filtró a diez ml de líquido ascítico de excluir los desechos grandes (180 micras filtro de nylon de poro, Millipore, UK). Como líquido de ascitis se contamina con frecuencia con la sangre, la adición de un fijador que contiene tampón de lisis de glóbulos rojos (01:05 v:v BD PhosFlow Lyse /Fix tampón de lisis de glóbulos rojos, BD Biosciences, EE.UU.) el agotamiento permitido de las células rojas de la sangre. Las células se permeabilizaron con BD PhosFlow Perm /lavado I y la muestra enriquecida por agotamiento de las células blancas de la sangre utilizando EasySep Human CD45 agotamiento Kit (tecnologías StemCell, Francia), según las instrucciones del fabricante.
Todas las muestras fueron incubadas immunoflourescent con anticuerpos marcados durante 12 horas a 4 ° C incluyendo pancytokeratin, EpCAM, CA125, DRAQ5 tinción nuclear y el antígeno leucicytoe común (CD45) para identificar las células blancas de la sangre. Las muestras se procesaron usando ImageStream
X (Amnis, EE.UU.) con software IDEAS utilizado para cuantificar la proporción de células que expresan los tres marcadores epiteliales, así como proporcionar una evaluación de co-expresión.
Crecimiento y citotoxicidad ensayos
SRB.
a (SRB) ensayo de rutina sulforrodamina B se utilizó para evaluar la citotoxicidad y el crecimiento celular como se ha descrito anteriormente [11]. Brevemente, las células se sembraron a una concentración de 1000 células /pocillo y después de la adhesión, se trata con diversas concentraciones de rucaparib durante 10 días antes de la fijación, la tinción y evaluación espectrofotómetro.
clonogénicos ensayos.
clonogénico los ensayos se consideran estándar de oro para la evaluación de la citotoxicidad. 50.000 células /pocillo se sembraron en una placa de 6 pocillos durante 24 horas. Las células se incubaron a continuación durante 24 horas con diversas concentraciones del agente citotóxico antes de la resiembra en concentraciones de 2.500, 5.000 y 10.000 células para cada tratamiento de drogas. Las células se incubaron a 37 ° C durante 14 días. El medio se aspiró, las placas se lavaron en PBS y después se fija mediante fijador del Carnoy (ácido acético: metanol 1:3 v /v).., Seguido de tinción con 1% de cristal violeta
clonogenics Agar
50.000 células fueron sembradas en pocillos que contienen los medios de comunicación y se trataron como anteriormente durante 24 horas en los medios de agarosa. Las células fueron entonces trysinised, se lavan y resembrado en agarosa semisólida medios (Promega, Reino Unido), en una variedad de concentraciones, y se incubaron durante 14 días. Las colonias fueron teñidas utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT).
Transfección de células
plásmido que expresa
luciferasa pGL2 (Promega, EE.UU. ) se transfectaron usando dos métodos. En primer lugar, se utilizó el protocolo del fabricante (Invitrogen, EE.UU.) para la transfección de células con lipofectamina TM LTX con Plus reactivo para transfectar cultivos PCO con 1-6 g de ADN por pocillo. En segundo lugar, 250 l de suspensión de células PCO que contiene 1 × 10
6 células /ml se mezcló con 1-5 g de pGL2 plásmido en 4 cubetas de electroporación mm (Eurogentec, Bélgica). La electroporación se llevó a cabo usando un electroporador EPI-2500 a 100-500 voltios. Los transfectantes de ambos métodos se cosecharon 48 horas después de la transfección y se ensayaron para actividad de luciferasa.
Además culturas PCO fueron transfectadas utilizando MISSION ™ shRNA partículas de transducción lentiviral (Sigma-Aldrich, EE.UU.), según el protocolo del fabricante.
homóloga ensayo de recombinación
Las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio y se trataron con radiación y 2Gy rucaparib ionizante a 10 concentración mu M durante 24 horas para inducir roturas de la cadena doble (DBL). Todos los experimentos se llevaron a cabo junto con los controles no tratados con equivalente DMSO 0,1%. Las células fueron fijadas y rehidratadas antes de la tinción con anticuerpos con apropiado monoclonal de ratón anti-1:100 γH2AX (Upstate, Millipore Corp., EE.UU.) y 1:100 policlonal de cabra anti-Rad51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., EE.UU.) anticuerpos conjugados con fluorocromo secundarias, como se describe anteriormente [5].
software Image J conteo [12], [13] se utilizó para contar γH2AX y Rad51 focos nucleicos. Las células se clasifican como recombinación homóloga (HR) competente, si había algo más que un aumento de 2 veces en Rad51 focos después de daño en el ADN, confirmado por un aumento de 2 veces en γH2AX.
Resultados
Generación de cultivos primarios de ascitis
La ascitis se recogió de 172 pacientes con cáncer sometidos a ováricos primarios (67%) o la cirugía primaria tardía (después de tres a cuatro ciclos de quimioterapia neoadyuvante con base en platino; 33%) entre 2008 y 2013 . culturas viables se generan en 166/172 (97%) casos. Eritrocitos y restos de células de ascitis no se adhirieron al matraz de cultivo y se retiraron tras cambio de medio. En general, la aparición de cada cultivo era la de un patrón de adoquines monocapa, la Figura 1 (A), como se describe por Dunfield
et al
[4]. El líquido ascítico se compone de múltiples componentes celulares y con el fin de confirmar el crecimiento exclusivo de cáncer de células caracterización de las células cultivadas se requiere. Caracterización immunoflourescent de las culturas se llevó a cabo utilizando el panel de anticuerpos a detetct expresión de CA125 pancytokeratin, EpCAM, MOC-31, D2-40 y vimentina, la Figura 1 (B-F). 10/166 (6%) fueron rechazadas, ya que no pudieron demostrar más de un 95% de positividad citoqueratina. La tasa de éxito en general, por tanto, para la creación de cultivos primarios epiteliales ascíticos de pacientes sometidos a la cirugía fue de 156/172 (91%). examen histopatológico de rutina de los tejidos FFPE de cada paciente se llevó a cabo, la Tabla 2. El subtipo histológico más predominante fue el cáncer seroso de alto grado
A:. Brightfield demostrando monocapa de adoquines; immunoflourescent imágenes con anticuerpos dirigidos contra: B: FITC anti-pancytokeratin; C: Alexafluor 596 anti-CA125; D: Alexflour 488 anti-EpCAM; E: 596 Alexafluor anti-MOC 31; F: 596 Alexaflour anti-vimentina
En un subgrupo de muestras, evaluación immunoflourescent de expresión CA125 en la muestra PCO se comparó con la expresión CA125 en el análisis inmunohistoquímico de tejidos FFPE del mismo paciente Figura 2. Correlación de los resultados de las dos evaluaciones se observó en 8/11 (72%) casos. En los tres casos restantes, dos mostraron IHC expresión de CA125 solamente, mientras que uno mostró SI expresión sólo
PCO 158 A:. La detección inmunohistoquímica de CA125 en el tejido FFPE; B: Detección Immunofluourescent de CA125 con Alexaflour596 de cultivo primario correspondiente
La morfología celular se estudió con el tiempo y se ha visto que la mayoría de los cultivos fueron de la morfología de adoquines pero las células de paso tardío (normalmente tras el paso 4 /5) desarrollaron un fenotipo mesenquimal más, llegando a ser alargada y que presenta una tasa de crecimiento marcadamente reducida. La senescencia se produjo entre las 2 y el 8 pasajes, más comúnmente entre los días 4 y 5
ª, haciendo así aún más la caracterización a finales de paso imposible. Los cultivos se consideraron sin éxito cuando no hay crecimiento se registró después de 28 días. Una cultura inmortalizada espontáneamente y se ha aumentado a más de 20 pasajes. No está claro por qué la cultura de la ascitis no tiene éxito en una proporción de los casos, la razón por la senescencia ocurre en pasajes variables o por qué sólo una cultura ha inmortalizado. Sin embargo, es probable que esto es una consecuencia de la falta de factores esenciales necesarios para el crecimiento que se proporcionan
in vivo
por las complejas interacciones dentro del microambiente del tumor y que faltan en el ambiente de cultivo artificial.
Cultura y el crecimiento
Las tasas de crecimiento de 30 culturas PCO, cultivadas en medio RPMI suplementado con 20% de FCS, se midieron mediante ensayos utilizando células SRB principios de paso para generar tiempos de duplicación. los tiempos de duplicación entre las culturas PCO fueron muy variables, con una mediana de tiempo de 100 horas (rango de 79 hasta 195 horas), Figura 3. Sin embargo duplicar, las células de la misma cultura probados en diferentes pasaje mostraron una variabilidad mínima en el tiempo de duplicación (diferencia media de 0,9 horas ; SEM 4.8). No se demostró la correlación entre la tasa de crecimiento, subtipo histológico o fase de la enfermedad en la presentación. La tasa de crecimiento relativamente lento visto también puede ser una consecuencia del medio ambiente culturee articial y la falta de factores de la micronvironment tumor.
La media y la SD de 6 repeticiones para cada punto de tiempo se representan, normalizado a 1 día.
El cultivo primario de tumor sólido
En paralelo con ascitis, se recogió tejido sólido de 11 pacientes y se procesa como se ha descrito. Establecimiento de cultivos de células de explantes de tejido se logró en 100% de los casos. La morfología de explante se perdió 72 horas post-siembra como células adquieren una apariencia de adoquines monocapa con el tiempo y pases. Los cultivos mostraron una apariencia morfológica similar a los derivados de cultivo de células de ascitis, Figura 4. contaminación de fibroblastos se redujo al mínimo en placas las células de incubación de 30 minutos antes de retirar el sobrenadante rico epitelial y replating, Figura 5.
A: Passage 0 a las 48 horas; B: Paso 0 a las 72 horas; C: Paso 1 a los 14 días
A: crecimiento de las células epiteliales de sobrenadante retirado 30 minutos después de la siembra inicial (x 20 aumentos); B: Las células se adhieran durante la incubación inicial de 30 minuto fueron casi en su totalidad de fibroblastos (x 10 aumentos)
transporte de muestras
Transporte optimización
Lugar de recogida de muestras.. es frecuentemente distantes de las instalaciones de laboratorio. Para utilizar este modelo en el trabajo de colaboración traslacional establecimiento exitoso de la cultura después del transporte debe tenerse en cuenta. Por lo tanto, comparamos el éxito de caracterización de cultivo y ensayos funcionales después de diversos métodos de transporte
Grupo 1 - ascitis frescas (n = 10):. transporte al laboratorio con el procesamiento dentro de las 6 horas de la recogida, utilizando el método descrito anteriormente .
Grupo 2 - muestras de la temperatura ambiente (n = 7):. ascitis se almacenó a temperatura ambiente en un recipiente estéril durante 24 horas antes de la mezcla 01:01 con los medios de comunicación en un matraz que el anterior
Grupo 3 - refrigerado muestras (n = 10): ascitis se almacenó a 4 ° C durante 24 horas antes de la mezcla 1:01 con medio como arriba
Grupo 4 - Las muestras congeladas (n = 6):. pareadas conjuntos de 50 ml partes alícuotas de líquido de ascitis se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos. Los sedimentos celulares resultantes se congelaron, se almacenaron a -80 ° C y -120 ° C y se descongelaron a 6 semanas y 6 meses.
El éxito de las culturas se han alcanzado de todos los grupos de transporte, sin embargo en los casos con la cultura retardada era preferible para mantener los cultivos a 4 ° C. No hubo diferencias en la morfología de los cultivos desarrollados de cada grupo, la Tabla 3.
celular ascítico pellets (Grupo 4) almacena a -80 ° C y -120 ° C se descongelaron a las 6 semanas y 6 meses. Los cultivos se desarrollaron con éxito de las dos condiciones de almacenamiento después de 6 semanas sin diferencia observada en la morfología, la tasa de crecimiento o la evaluación funcional. Sin embargo, después de 6 meses de almacenamiento, no se observó una diferencia significativa en el éxito de cultivo posterior de las dos condiciones. Bolitas de ascitis almacenados a -120 ° C fueron cultivadas con éxito en el 83% de los casos. No hay culturas almacenados a -80 ° C podrían cultivarse con éxito.
culturas cubreobjetos
El aspecto morfológico de los cultivos celulares cubreobjetos era similar a cultivos paralelos procesado utilizando el método estándar. Caracterización immunoflourescent fue consistente en todos los casos PCO entre cubreobjetos y culturas método tradicional. Se obtuvo tinción immunoflourescent óptima para la caracterización si se realiza más de 24 horas después de la siembra.
citogiro
Los parámetros óptimos para equilibrar la adhesión celular máxima con la preservación de la morfología nuclear eran 200 l de líquido de ascitis (concentración de 10 × 10
4 células por ml) cytospun a 80 × g durante 5 minutos. A pesar de las medidas adoptadas para agotar la muestra de líquido ascítico de las células epiteliales no deseados y los escombros, las diapositivas se mantuvieron muy contaminadas, confirmada por tinción de citoqueratina sub-óptima y la mala expresión CA125. La contaminación hecha la evaluación de la morfología, la caracterización immunoflourescent y evaluación funcional de la condición de HR sin éxito.
ImageStream
X Evaluación de las culturas PCO
La introducción de ImageStream
tecnología X con su capacidad de combinan citometría de flujo con alta resolución microscopía immunoflourescent permitido la evaluación de la expresión de un número de marcadores inmunofluorescentes marcado dentro de las células individuales simultáneamente a alta velocidad y alta resolución. immunoflourescent la detección de los tres marcadores epiteliales de ovario (pancytokeratin, EpCAM y CA125), evaluó mediante inmunofluorescencia fijo estándar y la tecnología ImageStream
X fue consistente en 13/15 casos (87%), la Tabla 4. Además ImageStream
X permitido a la cuantificación de la expresión porcentual y evaluación de co-expresión.
ImageStream
X evaluación de ascitis muestras frescas
se recogió y analizó desde las siete de ovario diez ml de ascitis frescas pacientes con cáncer utilizando ImageStream
X. Las células se clasifican en epiteliales si estaban nucleados, negativo para CD45 y positivas para EpCAM, CK o CA125. La población de células epiteliales en cada muestra ascítico se puede dividir en un número de sub-poblaciones basadas en el patrón de etiquetado de anticuerpos, la Figura 6a y b, y demostró gran heterogeneidad inter-tumor. La proporción de células con tinción positiva para EpCAM fue muy variable con una mediana de 52% (0-98%). No hubo correlación entre el ImageStream
X determina la expresión de marcadores epiteliales y el estado tal como se determina por inmunofluorescencia fijo (curva ROC, no mostrado, AUC de 0,5). Es posible que algunas de estas subpoblaciones pueden representar células no epiteliales (es decir, células mesoteliales), pero también es posible que se encuentren en las células epiteliales de datos y se someten a cambio fenotípico como consecuencia de el método de cultivo; o que el método de cultivo selecciona positivamente a cabo subpoblaciones. Clasificación de células con perfiles moleculares posterior de cada una de las subpoblaciones aclararía esto y permitir mayores diferencias moleculares en subconjuntos de EOC para ser explorados
A:. Parcela celular de las células ImagestreamX representativos que demuestran los tres principales subpoblaciones celulares dentro de líquido ascítico,; i) CK positiva solamente, ii) CK y CA125 positivo y iii) EpCAM, CK y CA125 positivo. B: Las subpoblaciones identificadas en la población de células epiteliales en el líquido ascítico EOC (n = el número total de células epiteliales identificados en 10 ml de ascitis) guía empresas
transfección celular
A. número de ensayos funcionales requiere la transfección de vectores en células [14], [15]. A pesar de la optimización, ambos métodos de transfección lipofectamina y electroporación fallaron para producir una alta eficacia de transfección suficiente para ensayos funcionales.
Sin embargo, las células continuaron creciendo en medios puromicina después de la transfección usando MISSION ™ shRNA partículas de transducción lentiviral que sugieren transfección exitosa. transfección a largo plazo no puede ser evaluada debido a la corta duración de vida útil de las culturas PCO.
funcionales ensayos de recombinación homóloga y la citotoxicidad
El ensayo de RAD51 para el estado de la reparación del ADN de recursos humanos se llevó a cabo con éxito en todos los cultivos primarios, que se habían criado con éxito de todos los grupos de transporte. HR estado de las culturas del mismo donante PCO utilizando la siembra directa en cubreobjetos y culturas de ascitis fueron consistentes. El cultivo directamente sobre cubreobjetos reduce el tiempo necesario de la colección para determinar el estado de recursos humanos de aproximadamente 14 a 5 días.
Como era de esperar el IG
50 valores después del tratamiento con rucaparib para cada cultivo PCO fueron variables, sin embargo, una clara diferenciación de las muestras sensibles y resistentes fue visto como [5] se ha descrito anteriormente. En la mayoría de los casos, como se esperaba, las muestras de PCO con el estado defectuoso de recursos humanos fueron sensibles a rucaparib, mientras que los que tienen categoría de recursos humanos competentes eran resistentes, Tabla 5.
A pesar de la optimización de las diversas técnicas estándar clonogénico, colonia no se observó la formación y, por tanto, los ensayos de la clonigénicas abandonada en cultivos de OCP. trabajo de la línea celular ha demostrado previamente una relación lineal entre los resultados obtenidos a partir de SRB y clonogenics y, por tanto, SRB fue adoptado como la técnica estándar en este estudio [16].
Discusión
La capacidad de generar y utilizar cultivos primarios de cáncer de ovario tiene varias ventajas sobre otros modelos que incluyen líneas celulares establecidas y modelos animales. Ahora se reconoce que muchas líneas celulares en cultivo a largo plazo van a someterse a otras aberraciones genéticas haciéndolos diferente de su tejido de origen. Además, incluso un gran panel de líneas de células no puede recapitular la tremenda heterogeneidad que se observa en el cáncer de ovario epitelial. Muchos modelos animales no son más que xenoinjertos utilizando estas líneas de células y por lo tanto conservan el mismo conjunto de problemas. modelos de ratones transgénicos tienden a haber sido generado mediante la integración de un pequeño número de mutaciones [17] y por lo tanto no muestran la inestabilidad cromosómica masiva que es un sello reconocido de cáncer de ovario [18].
Aquí hemos descrito nuestra hallazgos propios para generar cultivos primarios de cáncer de ovario, el uso de células derivadas de ambos ascitis y depósitos sólidos de la enfermedad. La capacidad de la cultura de ambos de estos materiales es importante ya que, dependiendo de la situación clínica, sólo uno de estos materiales puede estar disponible. Por ejemplo, en recaída de la enfermedad no es raro ver a ascitis en ausencia de depósitos sólidos grandes en contraste con el ajuste inicial de presentación en el que sólo la enfermedad sólido puede estar presente. Hemos informado de un juego de muestras para demostrar la tasa de éxito para generar culturas. 156/172 (91%) muestras recogidas dio lugar a un cultivo viable de las células epiteliales. Esta cifra es lo suficientemente alto como para justificar el uso posible de estas técnicas en la práctica clínica habitual, si se desarrollaron las pruebas de diagnóstico para su uso con este material.
A menudo, de hecho, en nuestro caso, puede ser significativo separación geográfica entre la sala de operaciones y el laboratorio de diagnóstico. La capacidad para el transporte de muestras sin pérdida de la integridad tanto, es esencial y hemos descrito técnicas que demuestran que estas muestras de manera segura pueden mantenerse en cualquiera de 4 ° C o -20 ° C durante hasta 24 horas antes de cultivo. Por otra parte, la capacidad de almacenar cultivos a largo plazo en nitrógeno líquido permite la posibilidad de colaboración para la investigación o
post hoc
análisis de diagnóstico.
Sobre todo en la etapa alta cuando los tumores se difunden por toda la cavidad abdominal y más allá, muchos tumores demostrarán significativa heterogeneidad intra-tumor [19], [20] aunque a menudo estos cambios están más relacionados con la reacción estromal local que a la presencia o ausencia de mutaciones conductor clave [21].