Extracto
no pequeñas carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) es una importante causa de muerte en el cáncer relacionados con la muerte humana . Su intervención terapéutica requiere molécula eficiente superiores (s), ya que a menudo se vuelve resistente a presentar opciones de quimioterapia. Aquí mostramos que el vapor de compuestos volátiles del petróleo obtenidos a partir de
Litsea cubeba
semillas muertas células de NSCLC humano, A549, a través de la inducción de la apoptosis y la detención del ciclo celular. Vapor generado a partir de los aceites combinados (VCO) desactivada Akt, un jugador clave en la supervivencia y proliferación de células cancerosas. Curiosamente VCO dephosphorylated Akt tanto Ser
473 y Thr
308; a través de la supresión de la mTOR y pPDK1 respectivamente. Como consecuencia de esto, la disminución de la fosforilación de Bad se produjo junto con la disminución de la expresión de Bcl-xL. Este posteriormente mejorado los niveles de Bax que permitan la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, que forma concomitante activa la caspasa 9 y caspasa 3 como resultado la muerte celular por apoptosis. Deterioro de la activación de Akt por el VCO también desactiva Mdm2 que efectúa la sobreexpresión de p53 que a su vez aumentó la expresión de p21. Esto provoca una mayor unión a la ciclina D1 que detuvo G1 a la fase S progresión p21. Tomados en conjunto, VCO produce dos efectos de puntas en las células de cáncer de pulmón, induce apoptosis y bloqueó la proliferación de células de cáncer, tanto se produjo debido a la desactivación de Akt. Además, tiene otra ventaja crucial: VCO podría ser entregado directamente al tejido de cáncer de pulmón por inhalación
Visto:. Sello S, P Chatterjee, Bhattacharya S, D Pal, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) de vapor de los aceites volátiles de
Litsea cubeba
Semilla induce la apoptosis y provoca la detención del ciclo celular en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10.1371 /journal.pone.0047014
Editor: Gobardhan Das, Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología, India
Recibido: 28 Junio, 2012; Aceptado: September 11, 2012; Publicado: 16 de octubre 2012
Copyright: © Seal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación trabajo fue apoyado financieramente por la subvención del CSIR-NEEP Proyecto (PS-005). Los autores de la SS y PC están agradecidos al Departamento de Ciencia & amp; Tecnología, Gob. de la India, Nueva Delhi; Sushmita Bhattacharya, DP y RK están en deuda con Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), Nueva Delhi, para la concesión de becas de investigación. SD es agradecido a UGC para el Dr. D. S. Kothari PDF & amp; CSIR-NEIST para QHF; y Samir Bhattacharya a la Academia Nacional de Ciencias de la India por su posición INSA científico mayor. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El co-autor Prof. Samir Bhattacharya es un miembro del Consejo Editorial PLOS. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón es uno de los cánceres más prevalentes y una causa importante de cáncer en todo el mundo relacionado la muerte de aproximadamente 1,4 millones de pacientes cada año [1]. Entre cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) comprende ~ 80% y dentro de la cual adrenocarcinoma es considerablemente alta en la tasa de aparición y la mortalidad [2]. La quimioterapia y /o radiación por lo general falla porque las células NSCLC son intrínsecamente resistentes a este tipo de terapias, por otra parte pronóstico de NSCLC es notablemente pobre [3], [4]. Todos estos afectados una opción terapéutica muy limitado para el cáncer de pulmón. Por lo tanto hay una necesidad crucial para desarrollar una determinada intervención quimio-objetivo para retardar la proliferación del cáncer o para inducir la apoptosis o ambas para gestionar el problema de NSCLC.
Para abordar el tema de la alarmante situación del NSCLC, varios intentos han sido hecho para buscar objetivos moleculares adecuados para intervenir células de cáncer de progresión y apoptosis. En las células de NSCLC, Akt /PKB es la quinasa constitutivamente activa, que promueve la supervivencia celular [5]. La activación de Akt se produce cuando es reclutado por la membrana celular a través de su dominio PH y fosforilados en Thr
308 y Ser
473 a través de la mediación de PDK1 (quinasa dependiente de fosfoinositido 1) y mTOR (diana de la rapamicina), respectivamente [6], [7]. Curiosamente, la activación de Akt aberrante contribuye en gran medida a la carcinogénesis de pulmón [8]. Akt fosforilada (pAkt) es un potente promotor de la supervivencia celular, ya que mantiene esta vía vivo mediante la protección de Bcl-xL y antagonizar diversos componentes de las cascadas de apoptosis [9]. Aunque la respuesta de apoptosis debido a la inhibición de Akt se ha observado en diversos grados en varios tipos de cáncer [10], [11] que podría ser crucial en el cáncer de pulmón porque mejorada forma fosforilada de Akt se produce perpetuamente [12].
Akt regula p53, una proteína supresora de tumor que controla la progresión del ciclo celular, a través de Mdm2 (murino doble mutante-2), una ligasa de ubiquitina. Mdm2 es un sustrato de Akt, la fosforilación de Mdm2 por ubiquitinación efectos Akt y la degradación proteasomal de p53 [13]. Por lo tanto, se activa Akt elimina un obstáculo importante para la progresión de las células cancerosas. Otra dimensión importante de Akt es su efecto inhibidor sobre la vía apoptótica. Bad, un miembro de Bcl
2 de la familia se ha encontrado para ser la primera proteína que inicia la apoptosis mediante el desplazamiento de Bcl
2 o Bcl-xL que permite Bax para oligomerizar y crear poros en la membrana mitocondrial a la liberación del citocromo c en el citosol [14], [15]. Activado Akt fosforila malo en Ser136 haciendo que se disocian de Bcl-XL de la membrana mitocondrial y asociarse con un adaptador de proteínas 14-3-3 que resulta inadecuado el secuestro de al citosol [16], [17]. mejora basada objetivo de la progresión de células NSCLC o destrucción es todavía disponible y dado que es constitutivamente activa de Akt aquí y la quinasa bien caracterizado conocido para apoyar la supervivencia celular y la progresión del cáncer, su desactivación sería la mejor opción para tratar NSCLC.
en este informe se demuestra que los compuestos volátiles del petróleo extraídos y purificados a partir de las semillas de
LITSEA cubeba gratis (Lour.) Pers. (Lauraceae), una planta ampliamente disponibles en la región noreste de la India, destruye las células del cáncer de pulmón a través de la desactivación de Akt. Curiosamente, es el vapor de los aceites que induce apoptosis y previene la proliferación de células de NSCLC mediante la producción de defectos en la fosforilación Akt. El vapor de los aceites demostró dos efectos del diente, es decir, la inducción de la muerte apoptótica y el retraso de la progresión del ciclo celular, tanto se produce a través de la desactivación de Akt. Por lo tanto, este informe se espera tener un atractivo especial como la destrucción de vapor inducida de células de cáncer de pulmón tendría dimensión significativa en relación con su entrega al tejido diana.
Materiales y Métodos
Reactivos
Todos los materiales de cultivo celular se obtuvieron de Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, EE.UU.. Los anticuerpos primarios para pAkt (Thr308; sc-135650), pAkt1 /2/3 (Ser473; sc-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241; sc-101775), Bcl XL (sc-7195), pBAD (Ser136; sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166; sc-293105), p53 (sc-6243), p21 (SC-756), ciclina D1 ( SC-753), poli [ADP-ribosil] polimerasa (PARP) (SC-7150), el citocromo c (SC-7159) y β-actina (sc-130657) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc., California, EE.UU. y mTOR (# 2983) se adquirió de Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, EE.UU.. La fosfatasa alcalina y anticuerpos secundarios conjugados con FITC, kit de detección de apoptosis con anexina V-Cy3, proteína A agarosa y CHAPS se adquirieron de Sigma Aldrich, St. Louis MO, EE.UU.. kit de ensayo de MTT se adquirió de Millipore, Temecula, CA, EE.UU.. Caspasa-Glo ™ kit de ensayo de 3/7 fue adquirido de Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.. Mitotracker se adquirió de Molecular Probes, MD, EE.UU., JC-1 membrana mitocondrial kit de ensayo de potencial se adquirió de Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI, EE.UU.). kit kit de escalera y BrdU etiquetado de ADN de apoptosis se adquirieron de Roche Diagnostics (GmbH, Alemania).
Extracción y purificación de aceites esenciales de
Litsea cubeba
semillas
Cerca de 250 gm semillas maduras frescas de
Litsea cubeba
, recogidos durante los meses de agosto a octubre de 2009-2011 granja experimental CSIR-NEIST, Jorhat, Assam se remojan en agua destilada y se extrajeron usando un aparato de Clavenger durante 6 horas. El aceite esencial depositado encima de la capa de agua se separó usando un embudo de separación y se secó sobre sulfato de sodio anhidro (neutral) y se filtró para dar un aceite (6,25 g, 2,5% de rendimiento). La cromatografía en capa fina del aceite bruto indicó la presencia de cuatro puntos distintos. El aceite en bruto (1 g) se sometió a purificación cromatográfica en gel de sílice (20 g, malla 100-200, Rankem) columna (diámetro de 1 pulgada & amp; 50 cm de longitud) empaquetada en hexano. 30 ml se recogieron fracciones en el siguiente orden: fracciones 1-10 (hexano), 11 a 20 (1% acetato de etilo en hexano), 21-35 (2% acetato de etilo en hexano), 36-60 (3% acetato de etilo en hexano), y la fracción de 61-hasta la finalización de la elución de los compuestos (4% de acetato de etilo en hexano). Las fracciones 11-20 que contiene 1 (en adelante como compuesto 1 o C1) (TLC) se reunieron y concentraron en un evaporador rotatorio para dar un aceite (100 mg) y esto fue identificado como citronelal de la comparación con material auténtico (TLC, IR, RMN, MS). Las fracciones 23-35 que contiene 2 (de ahora en adelante se hace referencia como compuesto de 2 o C2) (TLC) se reunieron y concentraron en un evaporador rotatorio para dar una sustancia oleosa (86 mg) y se identificó como neo-isopulegol por comparación de su
1H espectro de RMN con los reportados en la literatura [18]. Las fracciones 40-60 que contiene el compuesto 3 (en adelante como compuesto 3 o C3) (TLC) se combinaron y se concentraron en un evaporador rotatorio como se explicó anteriormente para dar un residuo oleoso (120 mg) y esto se identificó como isopulegol por comparación directa con
espectro 1H NMR con los reportados en la literatura [18]. Las fracciones 64-76 que contiene el compuesto 4 (de ahora en adelante se hace referencia como compuesto 4 o C4) (TLC) se reunieron y se concentraron para dar un aceite espeso (55 mg) que se identificó como citronelol de comparación de su
espectro 1H RMN con muestra auténtica .
El compuesto 1 (C1):
IR (CHCl
3): υ 2925, 1724, 1457, 1437, 1219, 1040, 772 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 300 MHz): δ 0,96 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, CH
Me
), 1,30 a 138 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,98 (s, 3H, = C
Me
), 1,98-2,06 9m, 3H, = C
CH
2 CD - & amp; -C
H
Me-), 2,24 (dd,
J
= 7,9, 2,6 Hz, 1H, -C
H
HCHO), 2,37 (dd,
J
= 5,4, 1,6 Hz, 1H, CH
H
CHO), 5,06 (t,
J
= 7,0 Hz, 1H, -C
H
= CMe
2), 9,75 (s, 1H, -C
H sobre O). MS (ESI): 155 (M
++ 1); pb 206 ° C (lit. 207 ° C)
El compuesto 2 (C2):.
IR (CHCl
3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 300 MHz): δ 0,87 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, CH
Me
), ,92-,95 (m , 1H), 1.8 a 1.12 (t,
J
= 6,6 Hz, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,68-1,75 (m, 3H), 1,79 (s, 3H,
Me
C = CH
2), 1,95-1,99 (m, 2H), 3,98 (m, 1H, C
H
OH), 4,78 (s, 1H, = C
H
2), 4,95 (s, 1H, = C
H
2); MS (ESI):. 154 (M
+)
El compuesto 3 (C3):
IR (CHCl
3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 300 MHz): δ 0,90-1,03 (m, 2H), 0,95 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, CH
Me
), 1,30-1,35 (m, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,63-1,65 (m, 1H), 1,69 (d,
J
= 1,5 Hz, 3H,
Me
C = CH
2), 1,87-1,89 (m, 1H), 2.3 a 2.6 (m, 2H), 3,50 (dt, 1H,
J
= 10,4, 4,2 Hz , C
H
OH), 4,85 (s, 1H, = C
H
2), 4,89 (s, 1H, = C
H
2); MS (ESI): 154 (M
+); pb 213 ° C (lit. 212 ° C)
El compuesto 4 (C4):.
IR (CHCl
3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 300 MHz): δ 0,91 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, CH
Me
), 1,15 a 129 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,33-1,45 (m, 2H, -C
H
2
CH
2OH ), 1,51-1,53 (m, 1H, -C
H
Me-), 1,60 (s, 3H, = C
Me
), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,96-2,01 (m, 3H, = C
CH
2 CD - & amp; O
H
), 3,61-3,74 (m, 2H, - C
H
2OH), 5,07 (t,
J
= 7,0 Hz, 1H, -C
H
= CMe
2); MS (ESI): 157 (M
++ 1); pb 223 ° C (lit. 222 ° C).
Cultivo de células y tratamientos
La línea celular A549 de cáncer de pulmón, fue una especie de regalo del Dr. P. Partha Banerjee (Georgetown Universidad Médica Centre, Washington DC, EE.UU.), que se obtiene a partir de la American Type Culture Collection (ATCC), EE.UU.. Las células se cultivaron en DMEM que contenía sales de Earle y aminoácidos no esenciales suplementados con 10% de suero bovino fetal, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) en una atmósfera humidificada de 95% O
2/5% CO
2 atmósfera a 37 ° C. Las células confluentes se subcultivaron mediante tripsinización y posteriormente se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos que contenían DMEM con suplementos esenciales.
Las células se sembraron en una placa de seis pocillos de mantenimiento de un pozo desprovisto de células. Cuando alcanzó la confluencia, el petróleo crudo o de cada compuesto individual o VCO se diluyeron en DMEM y se aplican en el pozo vacío de la placa de cebado para el tratamiento. VCO medios que contienen se reponía cada 24 h durante la duración del experimento. Las células se incubaron a diferentes períodos de tiempo con varias diluciones de VCO como se menciona en las figuras. Las células de control se mantuvieron en una incubadora separada para evitar cualquier exposición de VCO. Al final de la incubación, las células se lisaron, se centrifugaron durante 10 min a 10.000 g a 4 ° C y se recogió el sobrenadante. El contenido de proteína de sobrenadante se determinó siguiendo el método de Lowry et al. [19]. Revueltos o siRNA p53 o Sp1 siRNA fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
MTT ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó usando el kit de ensayo de MTT (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se expusieron a diversas diluciones de los aceites de petróleo o de vapor de crudo de 72 h o VCO para diferentes períodos de tiempo. se añadieron 10 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2-5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) a cada pocillo durante 4 horas a 37 ° C. Después de la solubilización en 100 l 1 (N) isopropanol /0,04 (N) HCl, absorbancia se leyó a 595 nm en un lector de microplacas (Thermo Electron Corporation, MA, EE.UU.).
AnnexinV-Cy3 ensayo de detección
AnnexinV-Cy3 kit de detección de apoptosis, adquirida de Sigma Aldrich, St. Louis MO, EE.UU. se utilizó para diferenciar entre vivo (fluorescencia verde), necrótico (fluorescencia roja) y las células apoptóticas (verde y la fluorescencia roja). las células A549 incubadas con o sin VCO de dilución (2 × 10
3) durante 36 h se lavaron a fondo con PBS, se recogieron y 50 l de suspensión de células fue descubierto en poli portaobjetos de vidrio recubierto de L-lisina. Las células fueron lavadas tres veces con tampón de unión y se tiñeron con solución de tinción doble etiquetado (Anexina V-Cy3 y 6 carboxi fluoresceína Di-acetato (CFDA) para 10 min. agente de marcado en exceso se eliminó lavando las células tres veces con tampón de unión y la se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania).
JC-1 mitocondrial potencial de membrana de ensayo
JC-1 tinción se realizó mediante el uso de JC- 1 membrana mitocondrial kit de ensayo de potencial, Cayman Chemical Company, (Ann Arbor, MI, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. En pocas palabras, las células tratadas control y VCO (2 × 10
3 dilución) se sometieron a JC-1 tinción (10 g /ml) durante 20 min a 37 ° C. El cambio de fluorescencia debido al tratamiento VCO se observó bajo el microscopio de fluorescencia (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania).
ensayo de fragmentación de DNA
ADN de bajo peso molecular fue extraído de 1 × 10
6 de control o VCO (2 × 10
3dilution) células tratadas mediante el uso de kit de escalera de ADN de apoptosis de Roche Diagnostics, (GmbH, Alemania) siguiendo el instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN eluido se cargaron entonces sobre el bromuro de etidio manchadas 1,5% en gel de agarosa y la imagen fue capturada por Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EE.UU. utilizando el software Image Lab.
Electroforesis e inmunotransferencia
60 mg de la proteína de control o lisados de células tratadas se resolvieron en 10% o 12,5% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA) con la ayuda de Semi-Dry aparato de transferencia trans (TE77 unidad de transferencia Semi-Dry, GE Salud, CA, EE.UU.). Las membranas se incubaron primero durante la noche a 4 ° C con diferentes anticuerpos primarios a diluciones 1:500 seguido de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina respectivo en diluciones 1:2000 a temperatura ambiente durante 2 h. Las bandas de proteínas se detectaron mediante el uso de 5-bromro 4-cloro-indolil fosfato 3 /nitroazul de tetrazolio (BCIP /NBT). La intensidad de las bandas se evaluó mediante el software Image Lab (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EE.UU.).
estudio de inmunofluorescencia del citocromo c
A549 células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento estériles. Tanto las células tratadas y de control del VCO (2 × 10
3 dilución) se tiñeron con Mitotracker (Molecular Probes, MD, EE.UU.) a 1:10,000 diluciones (en DMEM) durante 15 minutos. Las células se lavaron adicionalmente con DMEM y se procesan para la fijación. Después de la fijación, las células se incubaron con anticuerpo anti-c citocromo (1:100) durante 2 h seguido por incubación con anticuerpo secundario conjugado con FITC (1:50) para otra 1 h a temperatura ambiente. Las células se tiñeron contador y se montaron con medio de montaje DAPI y se observaron al microscopio de fluorescencia (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania).
caspasa-Glo 3/7 ensayo
células A549 se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos y se incubaron con o sin VCO de dilución (2 × 10
3) para diferentes periodos de tiempo. A la terminación de las incubaciones, la actividad de caspasa se midió mediante el uso de la caspasa-Glo ™ 3/7, Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU. de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se midió en un detector multimodo DTX-800 (Beckman Coulter, CA, EE.UU.).
incorporación de BrdU ensayo
síntesis de ADN se monitorizó midiendo la incorporación de análogo de timidina 5-bromo-2 ' desoxiuridina (BrdU) en las células cancerosas utilizando BrdU etiquetado y kit de detección cada vez mayor. (2 × 10
3) dilución células A549 tratadas y de control del VCO se actualizan con medio completo que contiene el reactivo marcador BrdU y se incubaron durante 1 h. Las células fueron lavadas a fondo con tampón de lavado y se fijaron con fijador de etanol durante 20 min a -20 ° C. Las células fijadas se lavaron y se incubaron con solución de anticuerpo anti-BrdU seguido de una solución de fluoresceína anti-Ig de ratón. Las células fueron montados en portaobjetos de vidrio y se observaron al microscopio de fluorescencia (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania).
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
chip de ensayo se llevó a cabo mediante el uso de un kit de chip de ensayo (Upstate, Temecula, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante utilizando anticuerpos anti-p53. Se utilizaron cebadores para amplificar conocido elemento de respuesta a p53 en p21 promotor y estos son - RE1: hacia adelante: 5'-3 'y CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-inversa: 5'-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3'; RE2: hacia adelante: 5'-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 'y revertir: 5'-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3' [20] y los productos de PCR se resolvieron en tiñeron con bromuro de etidio 2% en gel de agarosa y la imagen fue capturada por Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EE.UU. utilizando el software Image Lab.
Co-inmunoprecipitación (Co-IP) de ensayo
200 g de proteína de las células tratadas VCO control o se incubaron durante la noche con 2 g de anti-p21 y anti β-actina anticuerpo a 4 ° C con agitación continua. La proteína se añadió después una de agarosa y se incubó durante 4 horas a 4 ° C. Los complejos antígeno-anticuerpo se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se lavó 3 veces para eliminar cualquier proteína no unida y se hierve con tampón de muestra 4 × durante 5 min en un baño de agua hirviendo. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se cargó en 10% SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-ciclina D1 o anti-β-actina.
Flow-citometría Análisis
Para ciclo celular análisis, control y VCO (2 × 10
3dilution) se tripsinizaron las células A549 tratadas, se lavaron dos veces con PBS, y después se fijaron en etanol al 70% durante 24 h antes del análisis de ADN. Después de la eliminación del etanol por centrifugación, las células se lavaron dos veces con PBS. Las células fueron incubadas con RNasa (100 mg /ml) durante 30 min y luego se tiñeron con yoduro de propidio (PI-5 mg /ml) durante 15 min. La fluorescencia de las células tratadas PI se midió con citómetro de flujo (BD FACSAria ™ II). Los porcentajes de G1, S, G2 y células-M se determinaron utilizando el Software Diva FACS.
cultivo primario de células pulmonares normales
células pulmonares normales se aislaron de ratas Sprague Dawley macho siguientes Phan et al. [21], en pocas palabras, las ratas normales y sanos fueron anestesiados y los pulmones fueron perfundidos con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) a través del ventrículo derecho hasta que estaban pálidos. Entonces se retiraron los pulmones, picada y digeridos en PBS que contenía 0,5% de tripsina durante 45 minutos a 37 ° C. células digeridos se separan de tejido no digerido y los residuos mediante filtración a través de malla de nylon. Después, las células se lavaron con PBS y luego con DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal y antibióticos, y finalmente se resuspendieron en el medio. Las células se sembraron en una placa de seis pocillos de mantenimiento de un pozo desprovista de las células y se incubaron en una atmósfera humidificada de 95% O
2/5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C. Después de 1 hora, las células se incubaron con 2 × 10
3 dilución de C2 o C3 o C4 o VCO durante 12 horas. Las células de control se mantuvieron en una incubadora separada para evitar la presencia de vapor. Al final de la incubación, las células se lisaron, se centrifugaron durante 10 min a 10.000 g a 4 ° C y se recogió el sobrenadante. El contenido de proteína de sobrenadante se determinó siguiendo el método de Lowry et al. [19].
El análisis estadístico
Los datos se obtuvieron a partir de al menos tres experimentos independientes y se analizó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), donde el valor de F indica significación, medias se compararon mediante una prueba de rangos múltiples post hoc. Todos los valores fueron las medias ± SEM.
Resultados
bioactividad guiada aislamiento y purificación de los aceites de la semilla de
Litsea cubeba
El vapor de aceite crudo extraído de
LITSEA cubeba
semillas se examinó la actividad anti-cáncer en las células de cáncer de pulmón A549. Varias diluciones de petróleo crudo se prepararon y se añadió cada dilución en una de las 6 pocillo de placas de cultivo, mientras que otros 5 pocillos contenían células de NSCLC A549. Se esperaba que el vapor generado a partir de cada dilución estar extendiéndose a lo largo de la placa y llegar a las células cancerosas. la exposición dependiente de la dosis de vapor disminuyó la viabilidad de las células A549 de manera significativa a las 72 h con [10
3] y [10
2] diluciones mientras que hasta [10
4] diluciones el vapor no tuvo ningún efecto notable en la supervivencia de las células (Fig. 1A). La purificación cromatográfica del
Litsea cubeba
semillas aceites esenciales dieron lugar a cuatro tipos de compuestos, identificados a través de la misa y
espectro de 1H RMN con compuestos auténticos y su naturaleza química se detectó la siguiente manera - C1: citronelal; C2: neo-isopulegol; C3: isopulegol y C4: citronelol (Fig. 1B), cada uno se añadió por separado a una dilución de las células A549 [2 × 10
3] en una de la placa de cultivo de 6 pocillos, otros 5 pocillos contenían. Los vapores generados después de la adición del aceite a la bien fueron expuestos a las células durante 72 h. Podría verse en la figura. 1C que C1 había poca actividad, C2 y C3 exhibido 3 veces mayor actividad en comparación con C1, mientras que C4 tenía actividad más alta, la mortalidad celular hasta ahora se refiere.
(A) La viabilidad celular de células de cáncer de pulmón A549 se midieron cuando se expone a vapores de diferentes diluciones (10
6-10
2) de petróleo crudo durante 72 h utilizando el ensayo de MTT y los datos se expresaron como% de supervivencia de células en relación con el control. (B) Las estructuras químicas de los cuatro compuestos más disponibles (C1-C2-citronelal; neo-isopulegol; C3-C4; isopulegol citronelol) aisladas de
Litsea cubeba
semilla de aceite esencial. se observó (C) Porcentaje de muerte celular cuando las células A549 fueron expuestas individualmente con estos compuestos para 72 h. (D) Efecto de VCO (C2:C3:C4 como 01:01:01) y C4 sobre la muerte celular en 72 h se observó por el ensayo MTT, que fue visualizado por imágenes microscópicas. (E) la supervivencia celular se midió a diferentes intervalos de tiempo (24, 48, 72 h) con la exposición VCO en células A549. (F) de transferencia de Western de la fosforilación de Akt en Thr
308, Ser
473 y Akt total de en las células A549 tratadas sin (Con) con C1, C2, C3, C4 y VCO durante 36 horas. β-actina sirvió como control de carga interna. Los valores son medias ± SEM de 3 experimentos individuales. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente al control y#p. & Lt; 0,05 frente a C4
Hemos combinado C2, C3 y C4 en relación de 01:01:01 para observar si el vapor de estas combinaciones pueden producir efecto adicional o sinérgico en la muerte celular a través de C4. El vapor de los aceites combinados (VCO) exhibió significativamente (p & lt; 0,05) mayor actividad en la eliminación de células A549 en comparación con el vapor de C4 sola (Fig 1D.) Lo que indica que C2 y C3 producen efectos adicionales a C4. Por ello, utilizó el vapor de estos aceites combinados es decir VCO. Cuando VCO se expuso en diferentes períodos de tiempo, se produjo la muerte de las células linealmente en función del tiempo (Fig. 1E), lo que indica la posibilidad de inducción de apoptosis por VCO. Hemos realizado experimentos para examinar el potencial del compuesto C1, C2, C3, C4 mediante la determinación de la inhibición de la activación de Akt. Puesto que en las células de cáncer de pulmón A549 pAkt se expresa constitutivamente, la fosforilación de Akt se tomó como marcador para evaluar el efecto contra el cáncer. C4 mostró mayor efecto inhibidor en comparación con otros compuestos (C1, C2, C3,) pero VCO que es una combinación de C2, C3, C4 y producen significativamente mayor efecto inhibidor en comparación con C4 (Fig. 1F). En este punto, si VCO produce efecto citotóxico sobre las células pulmonares normales sería una cuestión relevante. Para observar este, el vapor de C2, C3, C4 individual y VCO se expuso a cultivo primario de células pulmonares preparados a partir de rata. Vapor a partir de los aceites y VCO no produjo ningún efecto adverso en la morfología celular en comparación con las células no tratadas. Además, también hemos determinado la inhibición de pAkt debido a VCO en las células pulmonares normales y encontró que no había alteración en pAkt (Fig. S1A y B). Todos estos sugieren que a esta dosis de VCO, pulmones normales las células no se ven afectados mientras misma dosis efectúa mortalidad considerable de células de cáncer de pulmón.
VCO induce apoptosis en células de cáncer de pulmón
Para examinar el VCO efecto sobre la muerte de las células del cáncer de pulmón A549, que utiliza doble tinción de fluorescencia con CFDA-6 y Anexina V-Cy3 para la diferenciación de las células vivas, apoptóticas y necróticas. VCO inducida por la translocación de fosfatidilserina desde el interior hacia el exterior prospecto de la membrana plasmática fue reconocido por la proteína de unión a fosfatidilserina-anexina V conjugada con Cy3. A las 36 h, las células A549 de control mostraron tinción solamente con 6-CFDA (verde) mientras que el tratamiento con VCO aumentó el número de Anexina V-Cy3 (rojo) y 6-CFDA (verde) células de doble manchado (Fig. 2A) y este aumentó con el tiempo que indica la mejora de células apoptóticas (Fig. 2B). Para ampliar aún más nuestra observación, se utilizó JC-1 tinte fluorescente para examinar el potencial de membrana mitocondrial. En células vivas, debido a la potencial de membrana fisiológica, JC-1 asociada a la membrana y forman mitocondriales J-agregados que emiten fluorescencia roja, mientras que la membrana mitocondrial despolarizada en células apoptóticas contenía monomérica JC-1 que presentan fluorescencia verde. Podría verse en la figura. 2C que las células A549 se emite fluorescencia roja mientras que VCO incubaron células fueron marcadas con fluorescencia verde que indica la apoptosis celular. VCO muerte celular inducida por apoptosis en células de cáncer de pulmón también fue evidente a partir de escalera de ADN debido a la fragmentación oligonucleosomal de la cromatina (Fig. 2D). Estos resultados indican que VCO induce la apoptosis sólo en células de cáncer de pulmón.
(A) Anexina-Cy3 (rojo) y 6-CFDA (verde) doble tinción de células apoptóticas se examinó por microscopía de fluorescencia donde VCO tratada células A549 mostraron manchas tanto verdes y rojos y las células control (sin tratar) teñidas de verde solamente. (B) Porcentaje de células A549 de apoptosis se midió a diferentes puntos de tiempo (0 h, 12 h, 24 h, 36 h) con tratamientos VCO. (C) el potencial de membrana mitocondrial se observó en el control y la VCO expuesto células de cáncer (36 h) A549 de pulmón mediante el ensayo de tinción de JC-1. la fragmentación de ADN apoptótico (D) se observó por VCO tratado-549 A las células en la electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los datos se presentan como medias ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente al control (0 h). Barra representa 20 micras.
La inhibición de la fosforilación de Akt por el VCO afecta adversamente aguas abajo de señalización para la supervivencia celular
En la mayoría de las células cancerosas, Akt es una elección primaria para la intervención terapéutica desde que desempeña un papel clave en la promoción de la inmortalidad y la proliferación de células cancerosas. La fosforilación de Akt en Thr
308 y Ser
473 son críticos en el mantenimiento de estas dos características vitales. tratamiento VCO se redujo drásticamente la fosforilación de Akt en Thr
308 y Ser
473 sin ninguna alteración notable del nivel total de proteína Akt en las células cancerosas A549 (Fig. 3A, panel superior B). 36 h de tratamiento VCO reducen pAkt Thr
308 nivel en un 70% y pAkt Ser
473 nivel en un 95% en comparación con el 0 h es decir, controlar las células cancerosas (Fig. 3A, B panel inferior). Esto indica que VCO desactiva fuertemente Akt que permite la apoptosis vía para el progreso. La activación de Akt está regulada por dos mTOR kinases- discreto y PDK1, primero es responsable de la fosforilación de Akt en Ser
473 mientras que este último fosforila en Thr
308. tanto, nuestro estudio fosforilación de PDK1 y la expresión de mTOR en respuesta al VCO. No hubo disminución significativa de la fosforilación de PDK1 y la expresión mTOR en células A549 debido a la exposición VCO (Fig. 3C, D). Desde Akt media su efecto sobre la inhibición de la apoptosis a través de Bad, desactivación de Akt debido a VCO podría compromete seriamente con la activación de Bad.