Extracto
La relación fuerte y consistente entre la irradiación a una edad temprana y el cáncer de tiroides posterior proporciona un excelente modelo para el estudio de carcinogénesis de la radiación en los seres humanos. por tanto, se evaluó la expresión diferencial de genes en el tejido tiroideo en relación con yodo-131 (I-131) dosis recibida por el accidente de Chernobyl. Sesenta y tres de 104 cánceres papilares de tiroides diagnosticados entre 1998 y 2008 en la cohorte ucraniano-americano con las estimaciones de dosis de tiroides individuales I-131 habían emparejado muestras de ARN de tumor fresco congelado (T) y el tejido normal (N) proporcionados por el Chernobyl Banco de Tejidos y criterios de control de calidad satisfechos. En primer lugar, hibridizado 32 asignados al azar pares de muestras de ARN (T /N) en 64 microarrays de todo el genoma (Agilent, 4 × 44 K). Asociaciones de la expresión diferencial de genes (log
2 (T /N)) con dosis se evaluó mediante pruebas de tendencia de Kruskall-Wallis y en modelos de regresión lineales mixtos. Si bien ninguno de los genes resistió la corrección de la tasa de falso descubrimiento, se seleccionaron 75 genes con
a priori
pruebas o Kruskall P /P tendencia & lt; 0,0005 para la validación de QRT-PCR en los 31 pares de RNA de muestras restantes ( TENNESSE). Los datos de QRT-PCR se analizaron mediante modelos de regresión lineales mixtos que incluyen la dosis de radiación como una variable categórica u ordinal. Once de 75 genes de QRT-PCR (ensayada
ACVR2A
,
AJAP1
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
GALNT7
,
LMO3
,
MTA1
,
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) se confirmó que tener una relación estadísticamente significativa diferencia de dosis-expresión. Nuestro estudio es uno de los primeros en proporcionar datos humanos directos sobre la expresión génica diferencial a largo plazo en relación con individuales I-131 dosis y para identificar un conjunto de genes potencialmente importantes en la carcinogénesis de la radiación
Visto:. Abend M, Pfeiffer RM, Ruf C, M Hatch, Bogdanova TI, Tronko MD, et al. (2012) El yodo-131 Dosis expresión génica dependiente de cáncer de tiroides y los tejidos normales correspondientes Tras el accidente de Chernobyl. PLoS ONE 7 (7): e39103. doi: 10.1371 /journal.pone.0039103
Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia |
Recibido: 20 Marzo, 2012; Aceptado: 16-may de 2012; Publicado: July 25, 2012
Derechos de Autor © 2012 Abend et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado principalmente por el Ministerio de Defensa de Alemania. Fondos adicionales fueron aportados por el Programa de Investigación Intramural, División de Epidemiología del Cáncer y Genética, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran por la presente que uno de los co-autores de ser recientemente por Investigación NOVA compañía no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. El co-autor trabajaba en el Instituto de Radiación Subdirección de Epidemiología /Nacional del Cáncer (REB /NCI) antes de que ella cambió a NOVA Empresa e Investigación, donde se emplea ahora. En el momento de /Instituto de Radiación Subdirección de Epidemiología Nacional del Cáncer (REB /NCI) realizó su contribución.
Introducción
Una de las consecuencias más importantes de salud del accidente de Chernobyl planta de energía nuclear es 1986 un aumento dramático en la incidencia de cáncer de tiroides entre los que eran niños o adolescentes en el momento [1], [2]. Numerosos estudios epidemiológicos han establecido que esto se relaciona principalmente con yodo-131 (I-131) la exposición del accidente a la glándula tiroides [3] - [7]. A pesar de las diferencias en las poblaciones de estudio, diseños y métodos dosimétricos, informaron las estimaciones del riesgo relativo (RR) por unidad de dosis de radiación absorbida en gray (Gy) para aquellos expuestos durante la infancia son notablemente similares entre la mayoría de los estudios (3-6) y por Gy compatible con los riesgos estimados para el cáncer de tiroides de la exposición de los niños a la radiación externa [3] - [8]
el estudio de carcinogénesis de la radiación en los seres humanos puede tomar ventaja de los casos en que las relaciones son fuertes y consistentes, como en el. situación en la que la glándula tiroides se irradia a una edad temprana. La oportunidad para la investigación molecular del cáncer de tiroides relacionados con la radiación se ve facilitada por los recursos del Banco de Tejidos de Chernobyl (CTB), que recoge sistemáticamente muestras biológicas de pacientes con patología tiroidea relacionada con Chernobyl [9]. A principios de los estudios post-Chernobyl informaron diferencias genéticas entre los tumores relacionados con la radiación y esporádicas, incluyendo
RET /PTC
reordenamientos de genes específicos [10] - [12]. Sin embargo, los análisis posteriores que utilizan las muestras CTB atribuyen las asociaciones a la edad más temprana de los pacientes expuestos a Chernobyl en lugar de a su exposición a la radiación [13], [14]. nuevos genes específicos a la radiación 'Estudios recientes utilizando los materiales de CTB y tecnologías de alto rendimiento han identificado [15] - [20]. Quizás el hallazgo más convincente deriva de un informe que compara los casos expuestos y cáncer papilar de tiroides no expuesta (PTC) con edad temprana de aparición de Ucrania, que encontró una ganancia de la banda cromosómica 7q11 basado en la hibridación genómica comparativa, confirmó en casos independientes por fluorescencia
in situ
hibridación (FISH) y la reacción cuantitativa en tiempo real en cadena de polimerasa (QRT-PCR) [20]. Sin embargo, los resultados a nivel de genes son generalmente consistentes entre los estudios potencialmente debido al pequeño tamaño de la muestra, el uso de controles de diferentes poblaciones, falta de validación metodológica en muestras independientes y diferentes enfoques analíticos. Más importante aún, ninguno de los estudios anteriores habían dosis de radiación individuales suponiendo que todos los casos expuestos recibieron la misma dosis. Dependiendo de la verdadera relación dosis-expresión, esta suposición podría causar falsas asociaciones positivos o falsos negativos.
Para mejorar la comprensión de las consecuencias moleculares de la I-131 de la exposición, se evaluaron para la expresión diferencial de genes primera vez en la tiroides tejido, que se define como una diferencia en los niveles de expresión de genes entre el tumor y el tejido de la tiroides normal correspondiente, en relación con estimaciones de las dosis individuales de tiroides I-131. La hipótesis de que si relacionados con la dosis patrones de expresión génica en el tejido tumoral reflejan realmente un evento importante en la carcinogénesis de radiación en lugar de un efecto de larga duración de exposición a la radiación, deben diferir de patrones observados en el tejido normal; por lo tanto, nuestro enfoque de análisis diferenciales relaciones dosis-expresión en el tumor en relación con emparejado muestras normales. Nuestro estudio utilizó muestras de ARN de la CTB de los pacientes que se sometieron a cirugía de tiroides para el cáncer de tiroides en el estudio de cohorte ucraniano-estadounidense compuesta de aproximadamente 13.000 residentes de CH Ucrania; 18 años en el momento del accidente con las mediciones de radiactividad individuales se toman dentro de dos meses después de la accidente [21].
en el presente estudio, se llevó a cabo en primer lugar una pantalla inicial en la mitad de los casos para identificar candidatos prometedores de genes que son expresados diferencialmente en las muestras de tejido normal en relación al tumor y dosis I-131 basan en microarrays de todo el genoma de ARN (fase I). a continuación, se validó los mejores candidatos en muestras de tejidos tumorales y normales de la segunda mitad de los casos utilizando QRT-PCR (fase II). Para los candidatos validados que, además, caracterizamos la relación de la expresión génica por separado en el tumor y el tejido normal.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos
Como resultado de cuatro secuencial exámenes de detección, 110 carcinomas de tiroides incidentes y prevalentes fueron diagnosticados en la cohorte ucraniano-estadounidense entre 1998 y 2008 en el Laboratorio de Morfología del sistema endocrino, del Instituto de Endocrinología y Metabolismo (IEM, Kiev, Ucrania) [3]. El Grupo Internacional de Patología, establecido en el marco del proyecto CTB, revisó todos los diagnósticos patológicos. Para disminuir la heterogeneidad fenotípica de los casos, se excluyeron 5 folicular y 1 carcinoma medular de tiroides resultantes en 104 PTC elegibles para el análisis; de estos 74 (71%) habían almacenado alícuotas de ARN de tumor y /o tejido normal en el CTB. Los casos incluidos y no incluidos en los análisis de la expresión génica fueron similares en muchas características, incluyendo la I-131 dosis y por lo tanto es probable que sea imparcial muestra de nuestro estudio. Todas las muestras de tejido fueron tomadas durante la cirugía después de los pacientes firmaron los formularios de consentimiento informado aprobado por las juntas de revisión institucional (IRB) del IEM y el Centro de Coordinación del proyecto CTB (Comité de Ética de Investigación Imperial College, Londres, Reino Unido). Revisión anual de la totalidad del proyecto también fue proporcionada por el IRB del Instituto Nacional del Cáncer en los EE.UU.
.
procedimientos de operación detalladas para la recogida, documentación y procesamiento de muestras congeladas de tumores y tejidos normales de la tiroides están disponibles en el . CTB página web [22] y fueron desarrollados en conjunto con el Laboratorio de Morfología del sistema endocrino del IEM y el Banco cáncer Gales
Dosimetría
métodos dosimétricos se han descrito en otra parte [23] - [ ,,,0],25]. En pocas palabras, la I-131 dosis individuales de tiroides y sus incertidumbres se estimaron a partir de la combinación de medidas de radiactividad de la tiroides, los datos sobre los hábitos dietéticos y de estilo de vida y modelos de transferencia ambientales utilizando un procedimiento de Monte-Carlo con 1.000 realizaciones por individuo [23]. Para el análisis, se utilizó la media aritmética de 1.000 realizaciones de cada individuo como la mejor estimación de la I-131 dosis corregida para las masas tiroideas típicos de la población de Ucrania [3].
La extracción de RNA y Control de Calidad
los detalles completos de la extracción de RNA se pueden obtener de la página web de CTB [22]. En resumen, el tejido tiroideo congelado se homogeneizó usando un Lyser tejido (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se extrajo usando sistemas basados en columnas Qiagen. El ARN se congeló a -80 ° C en alícuotas estándar 5 mg en 20 microlitros. Calidad y cantidad de ARN total aislado se mide por espectrofotometría (NanoDrop, PEQLAB Biotecnología, Erlangen, Alemania) y la integridad del ARN se evalúa por el Agilent 2100 Bioanalyser (Vida Science Group, Penzberg, Alemania). Para nuestro análisis, hemos utilizado sólo muestras de ARN con una relación A
260 /A
280 ≥ 2,0 (Nanodrop) y el número de la integridad del ARN (RIN) ≥7.5 ≥5.5 o para el conjunto de microarrays genoma y QRT-PCR análisis, respectivamente (IMGM laboratorios, Martinsried, Alemania).
a pesar de que el CTB proporcionó 137 muestras de ARN para 71 personas con PTC, hemos sido capaces de utilizar 126 pares de muestras tumorales (normales) /ARN correspondientes a 63 individuos (Figura 1 ). Once ARN las muestras de ocho individuos fueron excluidos debido a la falta de tejido complementario (n = 5) o debido a fallar con los criterios de calidad especificados anteriormente (n = 6).
Genoma análisis de microarrays (fase I)
Genoma de perfiles de expresión amplia se llevó a cabo usando el microarray oligo Agilent (4 × 44 K formato) combinado con un protocolo de hibridación basado de un solo color en 64 muestras de ARN emparejadas de 32 individuos seleccionados al azar (media del conjunto de muestras) . Para asegurar que los individuos seleccionados para el análisis de microarrays de expresión génica (n = 32) y los que quedan para el análisis de validación de QRT-PCR (n = 31) fueron similares, que confirmaron que sus distribuciones de sexo, edad, lugar de residencia, y la I- 131 dosis fueron similares.
Chemicals, kits, y software para todo el ensayo de genoma de microarrays fueron proporcionados por Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania. 500 ng de ARN total por muestra (enriquecida con un control de etiquetado interno) se introdujeron en una reacción RT-IVT y luego se convirtió en cDNA cRNA marcado por vitro en-etapa de transcripción (un color Quick-Amp kit de marcaje). Calidad de cRNA no fragmentada marcado se analizó (RNA 6000 Nano LabChip kit), y el cRNA se limpió y se cuantificó (NanoDrop ND-1000 Spetralphotometer). Por último, 1,65 g de cada muestra de cRNA marcado se fragmentó y se preparó para la hibridación basado de un solo color (kit de hibridación de la expresión génica). La hibridación se produjo a 65 ° C durante 17 horas en microarrays de sondas separadas que consisten 41.000 destinatarios específicos de genes (genes) ~20,000 y miles de sondas de control. Después de tres lavados con cada vez más restrictivos, se detectaron intensidad de la señal fluorescente en el escáner de microarrays de ADN de Agilent y extraen de las imágenes utilizando software de extracción de Agilent. cuantil normalización se aplicó a los datos
Fase I:. Análisis estadístico de los datos Microarray y Selección de genes candidatos para la validación independiente
Se analizó la expresión génica diferencial en el tumor en comparación con el tejido normal, obtenido por restando de registro
2 señales de la sonda transformadas de tejido normal (N) a partir del tejido tumoral correspondiente (T), ingrese
2 (T) -log
2 (N), en relación con la I-131 dosis estimados. Este enfoque reduce la variabilidad en la expresión de genes. Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis (P Kruskall) para comparar la expresión diferencial de genes a través de tres categorías de dosis (≤0.30, 0,31 a 1,0, & gt; 1,0 Gy) con aproximadamente puntos de corte correspondiente a los terciles de la distribución de dosis entre casos y modelos de regresión lineal con la prueba de tendencia (P lineal) para la dosis continua. Sólo las transcripciones de genes que tenían una llamada "presente" en al menos 50% de las muestras de ARN de tumor y el tejido normal se incluyeron en el análisis de la expresión diferencial de genes (~15,000). Hemos corregido para comparaciones múltiples utilizando la tasa de falsos descubrimiento (FDR) [26]. Como ninguno de los valores de p siguió siendo significativa después de la corrección FDR, adoptamos los siguientes criterios para seleccionar a los candidatos prometedores para la validación y cuantificación de QRT-PCR: (P Kruskall ≤0.001) o (0.001 & lt; P y P Kruskall ≤0.01 lineal ≤0.01 ) o (0,01 & lt; P Kruskall & lt; 0,05 y P lineal ≤0.001). En general, 106 candidatos de entre aproximadamente 2.500 genes expresados diferencialmente transcripciones en relación con la dosis satisfechos los criterios de selección. Redujimos aún más esta lista de 41 genes que mostraron los valores más bajos de P (P Kruskall & lt; 0,0005 o lineal P & lt; 0,0005) y tenía al menos una diferencia de dos veces (aumento /disminución) de la expresión génica diferencial entre más alta con respecto a la más baja la dosis categoría. Otros 34 genes adicionales con P Kruskall & lt; 0.005 se incluyeron en la validación porque no había evidencia en la literatura para la amplificación de genes (número de copias alteración, CNA & gt; 3) o fuerte arriba /abajo-regulación en otros estudios de cáncer de tiroides en irradiado poblaciones [19], [27]. Por lo tanto, se seleccionaron 75 genes para la validación mediante QRT-PCR (Tabla S1). Además, para evaluar acuerdo entre microarrays de todo el genoma y las mediciones QRT-PCR, nos encontramos con QRT-PCR (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) para estos genes entre los 32 individuos incluidos en la Fase I.
Fase II: Análisis de RT-PCR cuantitativa
Para validar nuestros resultados de microarrays, se evaluó la expresión de genes de QRT-PCR (ensayos de primer sonda TaqMan) en 62 muestras de ARN a partir de los pares restantes 31 individuos. Todos los productos químicos para QRT-PCR utilizando la química TaqMan fueron proporcionados por Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania. Debido a razones técnicas ensayos de sonda cebador individual fueron ya sea en un plazo de 96 pocillos plataforma de QRT-PCR o usando otra plataforma llamada matriz de baja densidad (LDA). Veinticuatro de los 75 genes se midieron por duplicado, a causa de espacio disponible en las plataformas y con el fin de mejorar la estadística. A 0,75 g de ARN alícuota de cada individuo se sometió a transcripción inversa usando un protocolo de PCR de dos pasos (High Kit capacidad). cDNA 50 l (equivalente a aproximadamente 0.25 g de ARN) se mezcló con 50 l 2 x RT-PCR mezcla maestra y se pipeteó en 2 de 8 puertos de llenado de la LDA. Tarjetas se centrifugaron dos veces (1200 rpm, 1 min, Multifuge3S-R, Heraeus, Alemania), sellados, y se transfieren a la 7900 instrumento QRT-PCR. El QRT-PCR se realizó durante dos horas siguiendo el protocolo QRT-PCR para el formato de LDA 384 pocillos. química Taqman para la plataforma de 96 pocillos se utiliza de manera similar, excepto el volumen por reacción se ajustó a 20 l. Todos los procedimientos técnicos para QRT-PCR se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar implementados en nuestro laboratorio en 2008, cuando el Instituto de Radiobiología Bundeswehr se acreditó según la norma DIN EN ISO 9001/2008.
Nos encontramos con cuatro muestras de ARN in por triplicado en tres LDAs diferentes para establecer un límite superior de la gama lineal dinámica de los ciclos umbral (Ct). El límite superior de la TC fue de 30, por lo que utiliza sólo los valores de CT & lt; 30 para su análisis. valores de CT se normalizaron con respecto a la expresión de genes mediana de los genes examinados. Este enfoque ha demostrado ser más robusto en comparación con el uso de los duplicados 18S rRNA visto en cada LDA para los propósitos de normalización. El coeficiente medio de variación (CV) de las mediciones de QRT-PCR fue & lt; 2,5% y el 95% de las mediciones por triplicado tenido CV & lt; 4% (Figura S1). La expresión génica diferencial que refleja factor de cambio diferencias de número de copias de ARN en el tejido tumoral con relación al tejido normal correspondiente (se utiliza como calibrador) se calculó restando los valores de CT asociados (delta-delta-CT-enfoque).
La fiabilidad y la Comparación de los resultados de diferentes técnicas en la fase I y fase II
Los dos métodos de medición en 32 individuos incluidos en la fase I mostraron resultados comparables en el 70,6% (Figura S2A). La media de la expresión diferencial de genes de todo el genoma de microarrays examinado en la fase I individuos también fue altamente correlacionados con las mediciones de QRT-PCR examinado en la fase II de los individuos (comparación de los diferentes métodos en diferentes individuos, r
2 = 0,81, Figura S2 B). Por último, las mediciones de QRT-PCR de los individuos incluidos y no incluidos en la fase I también están altamente correlacionados (r
2 = 0,98, Figura S3), el apoyo a la fiabilidad de los métodos
Fase II: Análisis estadístico de. QRT-PCR
para confirmar los resultados de la fase I, la fase II análisis utilizaron sólo los individuos (n = 31) no incluidos en la fase I. Después de un poder o registro de la transformación y /o remoción de los valores extremos de los genes seleccionados, normalizado valores CT de todos los genes se distribuyen normalmente. Nos residuales primera computados a partir de modelos lineales estándar instalados en los valores de la expresión de genes
y
de ajustar por edad en el momento de la cirugía de tiroides (3 categorías), el sexo y la oblast o estado de residencia (Chernigov, Zhitomir, Kiev), (1) donde μ es el nivel de expresión media global. Luego se evaluó la relación entre la dosis de I-131 y la expresión de genes en modelos lineales mixtos con muestras individuales como la variable de resultado. Estos modelos representan correlaciones del tumor y el tejido normal de las mediciones tomadas en el mismo individuo, y también dar cabida a las mediciones por duplicado en la misma persona por el mismo tipo de tejido.
Los modelos fueron (2) donde r
ij denota el residual de modelo (1) para los sujetos i (i = 1, 2, ..., 31) en el j
ésima muestra (j = 1, 2 para el tumor y el tejido normal), y ε
ij es normalmente distribuida término de error que también incorpora correlaciones a partir de mediciones repetidas de la misma muestra. El efecto de la dosis en muestras de tumores se cuantifica por dosis
tumor y el efecto de la dosis en el tejido normal es dada por dosis
normal. Para evaluar las diferencias en efecto dosis por tipo de tejido, se prueba la hipótesis nula H
0: dosis
= dosis tumoral
normal. De nuevo, se usó I-131 dosis de dos maneras: en 3 grupos de dosis independientes, lo que conduce a un 2 grado de libertad Wald valor de prueba P para H
0, y el uso de los 3 grupos de dosis ordenados, que corresponde a un 1 grado de la prueba de la libertad para H
0. el parcelas muestran los residuales y las pendientes de dosis empotrados para el tejido normal y tumoral. Plegables cambios en la expresión asociada con la dosis se calcularon como dos a la potencia de la diferencia en las pendientes, es decir, 2 (dosis
tumor - dosis
normal). Los parámetros para los modelos mixtos se calcula utilizando el método de máxima verosimilitud restringida incorporado en PROC MIXED, SAS 9.1.3 [28].
Resultados
Características de los PTC Casos
63 casos en nuestro estudio, el 56% eran mujeres y el 54% eran residentes de la región administrativa Chernígov (Tabla 1). Edad en la fecha del accidente varió de 0 a & lt; 18 años (media 7,9 años) y los cánceres se diagnosticaron 12.5-21.6 años después del accidente (media 16,5 años). La dosis media de la tiroides I-131 fue de 1,25 Gy, que oscila entre 0,008 y 8,6 Gy. Medios para las 3 categorías de dosis fueron de 0,11, 0,57 y 2,62 Gy, respectivamente. El subtipo histológico más común de PTC se mezcló (48%) y el resto consistió en folicular (25%), papilar clásico (19%), y (8%) subtipos sólidos. La media del diámetro del tumor más grande fue de 16,0 mm, con un rango de 6,0 a 45,0 mm.
Todo el genoma de microarrays
De 19,596 41,079 ARNm de genes (transcripciones) manchas en la totalidad microarrays genoma, en promedio 73,4% (rango: 63,3% -91,0%) eran distinguibles de fondo (expresado). El número total de las transcripciones de genes expresados diferencialmente en relación a la dosis de I-131 era 2500; de éstos se seleccionaron 75 genes candidatos para la validación de QRT-PCR (Tabla S1)
QRT-PCR
De los 75 genes ensayados, 15 desarrollaron no hay gráficas de amplificación, 5 dio resultados en. & lt; 10 personas, 6 y exhibió una alta variabilidad, probablemente causadas por un diseño de la sonda imprimación insuficiente haciendo estos 26 genes no informativo. Para 11 de los 49 genes restantes, la expresión relacionada con la dosis en el tejido tumoral fue estadísticamente significativamente diferente de la expresión relacionada con la dosis en el tejido normal cuando se utilizó la dosis como una variable categórica u ordinal en los modelos lineales mixtos (Tabla 2). No se encontraron asociaciones significativas tanto para la dosis categórica ordinal y de los 6 genes siguientes:
ACVR2A
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
LMO3
,
MTA1 gratis (Tabla 2). Tres genes (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) tuvieron diferencias estadísticamente significativas en la expresión diferencial de genes para la dosis categórica (2 grados de libertad pruebas), pero no para ordinal dosis, lo que sugiere las relaciones dosis-expresión no lineales; y dos genes (
AJAP1
,
GALNT7
) tuvieron una diferencia estadísticamente significativa en la relación dosis-expresión de dosis ordinal, pero no para la dosis categórica. Para
SLC43A3
las asociaciones entre la expresión génica y la dosis se limita a tejido tumoral (2 grados de libertad de prueba) y para
FAM38A (página 2 grado de libertad y 1 grado de libertad pruebas),
SLC43A3 gratis (2 grados de libertad de prueba),
LMO3 gratis (1 grado de libertad de prueba),
MTA1 gratis (1 grado de libertad de prueba) con el tejido normal (Figuras 2 y 3). Para
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, y
SLC43A3 de
existe una buena separación en la expresión entre el tumor y el tejido normal en cada nivel de dosis, así como una sugerencia de tendencias opuestas con la dosis. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las diferencias significativas en la respuesta a la dosis por tipo de tejido que parecía ser debido a la heterogeneidad de los patrones de dosis-respuesta en ausencia de una monótona dosis-respuesta en cualquier tipo de tejido.
Nota: la media de la expresión génica residual después de la eliminación de los efectos de la edad, oblast, y el sexo se representa por separado para el tejido normal (parte izquierda de la gráfica) y tejido tumoral (parte derecha de la gráfica) en contra de la media de tres dosis I-131 categorías (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Círculos con rellenos de gris corresponden a los valores medios de expresión génica para el tejido normal y plazas con rellenos negros corresponden a valores medios de expresión génica para el tejido tumoral. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%. P-valores para la asociación con dosis se basan en una prueba de 2 grado de libertad y un 1 grado de libertad prueba de tendencia, respectivamente, y por separado para el tejido normal y tumoral en la parte inferior de cada panel.
Nota: media de la expresión génica residual después de la eliminación de los efectos de la edad, oblast, y el sexo se representa por separado para el tejido normal (parte izquierda de la gráfica) y tejido tumoral (parte derecha de la gráfica) en contra de la media de tres I-131 las categorías de dosis (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Círculos con rellenos de gris corresponden a los valores medios de expresión génica para el tejido normal y plazas con rellenos negros corresponden a valores medios de expresión génica para el tejido tumoral. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%. P-valores para la asociación con dosis se basan en una prueba de 2 grado de libertad y un 1 grado de libertad prueba de tendencia, respectivamente, y por separado para el tejido normal y tumoral en la parte inferior de cada panel.
Discusión
Debido a la relación entre la irradiación a una edad temprana y el riesgo de cáncer de tiroides es sorprendentemente fuerte y consistente, este tumor ofrece un excelente modelo para el estudio de carcinogénesis de la radiación en los seres humanos. Aquí, hemos empleado basadas en la medición I-131 dosis individuales estimados para una cohorte de los residentes de Ucrania que se encontraban Se convierte la 18 años en el momento del accidente de Chernobyl y el ARN especímenes de tejido tiroideo fresco congelado proporcionada por el CTB. Por primera vez, se realizó el análisis de la expresión génica dependiente de la dosis en el carcinoma papilar de tiroides con respecto al tejido tiroideo normal de los mismos individuos en todo el genoma y confirmó los hallazgos de 11 genes de QRT-PCR en muestras de ARN a partir de un conjunto separado de los casos .
Varios puntos deben ser considerados al comparar nuestros resultados con estudios anteriores. transcripcional de perfiles utilizando microarrays, que permite la evaluación simultánea de miles de genes transcripciones se ha utilizado ampliamente para hacerse una idea de los cambios moleculares inducidos por la radiación [29] ionizante - [35]. Sin embargo, se aplica principalmente a diversos tipos de células
in vitro
: cultivos celulares de queratinocitos humanos [31], células linfoblastoides [34], etc. En algunos estudios, incluyendo modelos animales o pacientes tratados con radioterapia investigado la expresión de genes poco después de
in vivo
la irradiación [32], [33], [35]. Los genes que mostraron cambios relacionados con la dosis después de la exposición a la radiación ionizante en estos estudios son más propensos a ser útiles como criterios de valoración y /o biomarcadores de exposición biológicas tempranas. Su utilidad en términos de riesgo de cáncer a largo plazo en los seres humanos aún no se ha establecido. También hubo algunos estudios sobre el mecanismo que compararon la expresión de genes en los cánceres relacionados con la radiación con la expresión de genes en cánceres esporádicos o tejido normal [15] correspondiente - [20], pero ninguna de estas estimaciones de dosis individuales involucrados. Nuestro estudio ha tratado de llenar este vacío. Utilizando las estimaciones de dosis individuales I-131, se evaluó la dosis en tres categorías, sin supuestos sobre la forma de dosis-respuesta y suponiendo una relación dosis-respuesta lineal. Debido a que diferentes mecanismos radiobiológicas podrían ocurrir con el aumento de las dosis de radiación, incluyendo la muerte celular y la inducción de reordenamientos cromosómicos persistentes, que a su vez se sabe que siga relación no lineal [36], [37], una relación curvilínea para la expresión génica diferencial es plausible. En consonancia con esta idea, al menos algunos genes (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) exhibieron una sugerencia de la no linealidad de la dosis-respuesta diferencial.
Los 11 genes que fueron validados en un caso independiente creado por QRT-PCR en nuestro estudio (Tabla S2) están situados en cromosomas diferentes y pertenecen a diferentes procesos biológicos, incluyendo la adhesión celular (
AJAP1
,
FAM38A
), el metabolismo energético (
CA12
), la transcripción o la metilación del ADN (
LMO3
,
ZNF493
,
MTA1
,
SLC19A1
), y el crecimiento /diferenciación (
CDK12
,
ACVR2A
). Todas estas vías se han implicado en las respuestas celulares a la radiación ionizante [31], [34]. Más importante aún, cuatro genes específicos (
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, y
SLC43A3)
anteriormente se presentaban por Stein et al. para ser desregulado en el cáncer de forma única el accidente de Chernobyl tiroides [19] y un gen (
FAM38A
) fue identificado previamente por Ory et al. en un estudio de cáncer de tiroides después de la irradiación para una primera cáncer primario en la infancia [27]. Además de la búsqueda de estos cinco genes expresados diferencialmente en un conjunto independiente de los casos irradiados, nos presentó pruebas de que su expresión diferencial parece ser dependiente de la dosis. Por lo tanto, estos genes son candidatos particularmente atractivas para nuevos estudios de validación que se centran en los mecanismos de la carcinogénesis radiación. Ninguno de los genes prometedores identificados en nuestro estudio estaba ubicado en 7q11.22-11.23; ganancia en esta región cromosómica se informó en la edad de aparición posterior a la de Chernobyl PTC [20].
Varias pistas surgieron de nuestro estudio que podría guiar los futuros estudios de carcinogénesis por radiación. Dependencia de la dosis para la expresión génica diferencial detecta años después de la exposición probablemente representa un efecto duradero tarde y /o larga de la radiación. Un mecanismo por el que los cambios inducidos por la radiación podrían ser sostenidos en el tiempo es a través de la herencia de los daños del ADN [38]. Se ha informado de que la radiación ionizante es capaz de inducir un tipo específico de daño en el ADN, en particular copiar alteraciones en el número (CNA) [39]. Numerosos estudios de cánceres esporádicos han establecido que CNA puede dar forma a la transcriptomes de tejido y la influencia de la expresión génica [40]. Por lo tanto, si se mantienen CNA inducidos por la radiación durante la tumorigénesis, la expresión diferencial de genes relacionados con la dosis podría ser parcialmente atribuirse a cambios en CNA relacionada con la dosis. Esta idea encuentra algún apoyo en los estudios que informó superposición en los CNA y los genes desregulados en los tumores de forma única el accidente de Chernobyl [19] y la sobreexpresión de un gen significativa entre varios examinada dentro de la región 7q11.22-7q11.23 ganado [20]. Otro mecanismo que emerge a través del cual la radiación puede inducir y perpetuar los cambios de larga duración en la expresión génica es la epigenética [41], [42]. Los cambios epigenéticos afectan indirectamente a ADN mediante la alteración de la metilación del ADN, remodelación de la cromatina y la expresión de microARN (miARN) en lugar de la estructura del ADN. Nuestro hallazgo de expresión dependiente de la dosis de ciertos genes (
FAM38A
,
SLC43A3
,
LMO3
,
MTA1
) en el tejido normal de la tiroides puede estar relacionado a los cambios epigenéticos inducidos por la radiación. Por otra parte, relacionados con la dosis cambios de expresión en el tejido normal podrían ofrecer una oportunidad adicional para evaluar la susceptibilidad individual a la exposición a la radiación [43], [44]. La evaluación simultánea de la expresión génica, CNA, y cambios epigenéticos podría proporcionar pistas sobre los complejos efectos de la radiación y la carcinogénesis radiación ionizante
.
Nuestro estudio tiene varias fortalezas únicas. En primer lugar, hemos utilizado las estimaciones de dosis individuales I-131 basado en mediciones de radiactividad tomadas poco después del accidente [3], [6]. En segundo lugar, los casos surgieron dentro de una cohorte bien caracterizada de detección del cáncer de tiroides según un protocolo estandarizado y con independencia de la dosis, lo que minimiza el impacto de los factores de confusión no medida.