Extracto
El ácido ursólico (UA), un ácido carboxílico triterpenoides pentacıclico natural distribuido en hierbas medicinales, ejerce efectos antitumorales y está surgiendo como un compuesto prometedor para la prevención y el tratamiento del cáncer, pero sus mecanismos especiales de acción en las células de cáncer de colon sigue siendo en gran parte desconocido. Aquí, hemos identificado los mecanismos moleculares por los cuales UA inhibió la proliferación celular y la apoptosis inducida en células SW480 y LoVo de cáncer de colon humano. El tratamiento con UA condujo a las inhibiciones significativas en la viabilidad celular y la formación de clon y cambios en la morfología celular y la difusión. UA también suprimió la migración de células de cáncer de colon mediante la inhibición de MMP9 y aumentando la expresión de CDH1. Otros estudios demostraron que la AU inhibe la fosforilación de las proteínas Akt y ERK. El tratamiento previo con un inhibidor de Akt o ERK-específica abrogada considerablemente la inhibición de la proliferación por la UA. UA también inhibió significativamente las células del cáncer de colon de la COX-2 y la producción de PGE2. El tratamiento previo con un inhibidor de la COX-2 (celecoxib) abrogó la proliferación celular inducida por UA. Además, encontramos que la UA promueve eficazmente NF-kappa B y la translocación p300 a partir de núcleos de células de citoplasma, y atenúa la acetilación p300 mediada por NF-kB y CREB2. El pretratamiento con un inhibidor de la p300 (roscovitina) abrogó la proliferación celular inducida por UA, que se invierte por la sobreexpresión p300. Además, el tratamiento inducida UA apoptosis de las células del cáncer de colon, el aumento de la escisión de PARP, caspasa-3 y 9, y trigged la liberación de citocromo c desde el espacio inter-membrana mitocondrial en el citosol. Estos resultados indican que la AU inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis en células de cáncer de colon mediante la modulación simultánea de las múltiples vías de señalización tales como MMP9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, y citocromo c /caspasa vías
Visto:. Wang J, Liu L, H Qiu, Zhang X, W Guo, Chen W, et al. (2013) El ácido ursólico blancos simultáneamente múltiples vías de señalización para suprimir la proliferación e inducir la apoptosis en células de cáncer de colon. PLoS ONE 8 (5): e63872. doi: 10.1371 /journal.pone.0063872
Editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Enero, 2013; Aceptado: April 10, 2013; Publicado: 30 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071687, 81272195), el Estado "Programa 863" de China (SS2012AA020403), la Fundación de Programas de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20110171110077), y el Laboratorio Estatal de Oncología en el sur de china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado la afiliación (s) de Wenlin Huang a "Guangzhou Doble Bioproducto Cª". Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Cáncer de colon y de recto (cáncer colorrectal, el CRC), el tercer cáncer más común en todo el mundo , se ha convertido en una de las principales causas de muerte por cáncer [1]. La cirugía, la quimioterapia y la radioterapia son los tratamientos primario y comunes para el cáncer colorrectal. Aunque la quimioterapia adyuvante a la cirugía es, la tasa de curación de cáncer colorrectal fue todavía no es ideal, especialmente para los pacientes de etapas más avanzadas. La metástasis y la recurrencia después de la cirugía o la resistencia a la quimioterapia produce por lo general conduce a la muerte final. Por lo tanto, la estrategia de tratamiento alternativa y complementaria se ha convertido en necesario para mejorar la tasa de supervivencia de pacientes con cáncer de colon. La medicina herbal china se está volviendo más y más popular en tratamientos contra el cáncer en combinación con la terapia convencional debido a su origen natural, baja toxicidad y la eficacia para prevenir y tratar el cáncer, incluyendo el cáncer de colon [2].
El ácido ursólico (UA) , un ácido carboxílico triterpenoides pentacıclico natural extraído de hierbas medicinales y plantas comestibles, ejerce una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo hepatoprotector [3], anti-bacteriana [4], antiviral [5], y anti-inflamatoria [6]. Además, se ha implicado en la prevención y protección contra los cánceres [7]. Su acción anti-tumor se atribuye a su capacidad para prevenir la tumorigénesis [8], inhibir la proliferación de células de cáncer, e inducir la apoptosis de células de cáncer [6], [9]. Las vías de señalización implicadas en la actividad UA pueden ser diferentes en diferentes líneas celulares de cáncer, y las vías de señalización parciales pueden ser regulados de forma simultánea o sucesiva y sinérgica para contribuir al tratamiento UA. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos de la UA participan en la inhibición de la proliferación y la inducción de la apoptosis en el cáncer colorrectal todavía no eran lo suficientemente clara
.
La enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2), responsable de la catálisis de la conversión de los araquidónico ácido a las prostaglandinas y tromboxano a
2, es conocido por estar involucrado en varios procesos fisiopatológicos, incluyendo la inflamación y la tumorigénesis [10], [11]. COX-2 no es detectable en la mayoría de los tejidos normales, pero comúnmente se sobreexpresa en muchos premalignas, los cánceres humanos malignos y metastásicos, incluyendo cáncer colorrectal, con su prostaglandina producto aguas abajo E2 (PGE2). La evidencia creciente indica las principales funciones de la COX-2 en la carcinogénesis y la progresión del cáncer son a través de la participación en la iniciación del tumor, promover el mantenimiento y progresión del tumor, y el fomento del tumor diseminación metastásica [12], [13]. La inhibición selectiva de la actividad COX-2 invierte la carcinogénesis del cáncer colorrectal y se ha demostrado que induce la apoptosis, y de inhibir la proliferación y la angiogénesis [14], [15]. Algunas de sus inhibidores incluso se han demostrado ser fármacos quimioterapéuticos potencialmente atractivas en el tratamiento del cáncer colorrectal en combinación con otros agentes quimioterapéuticos comunes [16], [17]. COX-2 expresión está estrechamente regulada a nivel de transcripción a través de la unión de transactivadores tales como NF-kB, CREB2 y co-activadores tales como p300 a los sitios correspondientes situados en su promotor [18] - [21]. Sin embargo, si la UA juega su efecto anti-tumoral a través de reglamentos de la COX-2, NF-kB y la señalización p300 aún es poco conocido en el cáncer colorrectal humano, y los relacionados con las vías de señalización que subyace siendo difícil de alcanzar.
A continuación, se evaluó el efecto de la UA sobre la proliferación de células de cáncer de colon, la migración y la apoptosis en células de cáncer de colon y analizamos su Reglamento sobre las proteínas clave de algunas vías de señalización implicadas en la proliferación celular, la migración y la apoptosis. Los resultados mostraron las anti-proliferación, anti-migración y pro-apoptóticos efectos de la UA en células de cáncer de colon fueron mediadas a través de la modulación simultánea de múltiples vías de señalización, incluyendo MMP9 /CDH1, Akt /ERK, la COX-2 /PGE2, p300 /NF vías de caspasa-dependiente -κB /CREB2 y el citocromo c /. Nuestro estudio no sólo descubre los mecanismos moleculares subyacentes de actuación UA en células de cáncer de colon humano, sino que también sugiere el gran potencial de la AU en la prevención del cáncer colorrectal humano y el tratamiento.
Resultados
UA celular inhibida proliferación y Formación Clone e inducidos Morfología celular Cambio
Se analizaron primero cuantitativamente el efecto de la UA sobre la proliferación celular a las 48 horas después del tratamiento en las células SW480 y LoVo mediante un ensayo MTT. El tratamiento con UA a la dosis de 10 mM a 60 mM viabilidad celular, inhibió de una manera dependiente de la concentración, lo que resulta en un 20% a una inhibición 83% en las células SW480 y una inhibición del 5% al 55% en las células LoVo, respectivamente ( Fig. 1A). También determinamos los efectos de la UA en clonogenicidad de las células tumorales. UA formación clon también marcadamente inhibida de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1B), dando como resultado una inhibición significativa de la proporción de formación clon tanto en las células SW480 y LoVo (Fig. 1C).
línea celular de cáncer de colon humano SW480 y LoVo y líneas de células normales CCD841 y LO2 fueron tratados con UA a las dosis indicadas. A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante un ensayo de MTT (A, E), y la formación inducida por el clon de células tumorales se analizó (B, C). Se observaron los cambios en la morfología celular, difusión y formación de ampollas en las células tratadas sin o con UA (10 M y 20 M) durante 48 h y las células se fotografiaron usando un microscopio equipado con cámara digital (D). La relación de la formación de la viabilidad celular por ciento o clon en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con vehículo de control DMSO. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *,
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. & Lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control de DMSO
A continuación analizaron los cambios mediados-UA en la morfología celular y la propagación de las células SW480 y LoVo . El tratamiento de células con DMSO, un vehículo de control, forma una capa de células, y no se observaron más difusión, filopodios y formación de ampollas. Por el contrario, el tratamiento UA provocado una marcada reducción de contacto célula a célula, y tenía menor difusión con menos formación de filopodios tanto en las células SW480 y LoVo, y formación de ampollas en la membrana inducida en células tratadas con UA (Fig. 1D).
también se evaluó el efecto de la UA sobre la proliferación celular en líneas celulares CCD841 humana normal y LO2. El tratamiento con UA a las dosis ≤20 mu M no inhibió la viabilidad celular en ambas líneas celulares normales, lo que demuestra la especificidad potencial de la AU en la inhibición de proliferación de células tumorales en el M dosis ≤20.
UA MMP9 específicas /CDH1 Signaling en inhibir migración celular
a continuación examinó el efecto de la UA sobre la migración celular mediante el empleo de un ensayo de cero. Consistente con los datos de la proliferación celular y la inhibición clonogenicidad, el tratamiento con UA en 5 M efectivamente inhibe la migración de células, tanto en células LoVo (Fig. 2A) y SW480. La parte de la brecha o hiriendo espacio entre las capas de células después de hacer un rasguño fue ocupada por completo por las células que migran después de 56 h. Por el contrario, el espacio vacío de las células no fue ocupada por las células que migran tratados con UA (Fig. 2A).
(A), la migración celular se analizó mediante un ensayo de cero. células SW480 y LoVo se hicieron crecer hasta confluencia completa. Las monocapas de células fueron heridos con una punta de pipeta estéril, y se lavaron con medio para eliminar las células desprendidas de las placas. Las células se dejaron sin tratar o tratados con dosis indicadas de UA. Después de 56 h, se observó la brecha de la herida y se fotografiaron las células. (B, C), SW480 células fueron tratadas con UA a las dosis indicadas. En 56 horas después del tratamiento, la expresión de MMP9 (B) o CDH1 (C) se analizó cuantitativamente por un análisis de qPCR a tiempo real. *,
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. & Lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos tratados con el acceso universal y los grupos tratados con DMSO
MMP9 y CDH1 son dos moléculas clave que participan en la invasión celular y vía de señalización relacionada con la migración [22], [23]. A continuación analizaron cuantitativamente los efectos de la UA sobre la expresión de MMP9 y CDH1 por un análisis qPCR en tiempo real en las células SW480. Como era de esperar, UA a 20 mM y 40 mM marcadamente suprimida el nivel de mRNA del gen de MMP9 (Fig. 2B), mientras que el tratamiento UA condujo a un aumento significativo en la expresión de mRNA CDH1 (Fig. 2C). Estos resultados indican que la AU juega un papel importante en la supresión de la migración y la invasión a través de la modulación de la señalización de MMP9 y CDH1.
UA inactivada Akt y ERK Signaling para inhibir la proliferación celular
La PI3K /Akt y MAPK vías de señalización desempeñan papeles críticos en el control de la proliferación celular y la tumorigénesis. Para evaluar si la AU es capaz de modular la PI3K /Akt y MAPK señalización para dirigir a la inhibición de la proliferación celular, se examinaron los efectos de la UA sobre la fosforilación de las moléculas de señalización en estas dos vías en las células SW480 mediante análisis de transferencia Western. El tratamiento con UA a 20 mM inhibió considerablemente la expresión de la proteína fosforilada Akt y mTOR, pero el aumento de expresión de PTEN fosforilada (Fig. 3A). También se detectó una marcada reducción de las proteínas ERK fosforiladas de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3B). Los niveles de la expresión de la proteína total de Akt, mTOR, PTEN (Fig. 3A) y ERK (Fig. 3B) no se modificaron.
(A, B), SW480 células fueron tratadas con UA a 20μM o 40 M durante 48 h. La expresión de la PI3K fosforilada o total, Akt, mTOR, PTEN, JNK, /2 proteínas ERK1 se detectó por Western blot. GAPDH se utilizó como control para la carga de la muestra. (C, D), SW480 células fueron tratadas con una PI3K /Akt inhibidor selectivo LY294002 (LY, 5 M) (C) o con un U0126 inhibidor de ERK-selectivo (20 M) (D) durante 4 horas, y después se trató con la UA a 20 mM. A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante análisis MTT. El porcentaje de viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se calculó en relación con las células tratadas con el control del vehículo DMSO. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *,
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control
Para confirmar aún más la participación de las vías de señalización Akt y ERK en la inhibición mediada por la AU de. la proliferación celular, que analiza a continuación los efectos del inhibidor de Akt o ERK-selectivo en la inhibición de la proliferación mediada por UA en las células SW480. El pretratamiento de las células con el inhibidor de PI3K /Akt LY294002 (LY) en 5μM (Fig. 3C) o ERK inhibidor U0126 en 20 mM (Fig. 3D) inhibió la proliferación celular, y una combinación de UA (20 M) con estos inhibidores se incrementaron ligeramente el inhibición de la proliferación celular (Fig. 3C y 3D). Sin embargo, la adición de UA no cambió de manera significativa la inhibición de la proliferación en las células SW480 tratadas previamente con inhibidor de Akt LY (Fig. 3C) o ERK U0126 inhibidor (Fig. 3D), lo que confirma el papel de la UA en la regulación de la señalización de Akt y ERK.
UA Targeted COX-2 y PGE2 señalización para inhibir la proliferación celular
COX-2 expresión se ha demostrado que regular positivamente el EGFR, PI3K /Akt y ERK señalización, con lo que inducen la proliferación de células tumorales, la migración y la invasión [24], [25]. Para determinar si la inhibición mediada por UA de la proliferación celular está mediada a través de la modulación de la COX-2 de señalización en células de cáncer de colon, se evaluó el efecto de la AU en COX-2 expresión en la proteína y los niveles de mRNA mediante transferencia Western y RT-PCR. El tratamiento con UA a las dosis de 20 mM y 40 mM inhibió drásticamente la expresión de la proteína COX-2 (Fig. 4A) y de ARNm (Fig. 4B) en las células SW480 y LoVo. El análisis de densitometría cuantitativa también mostró que la AU a 20 mM y 40 mM contención significativa de la COX-2 mRNA en las células SW480 y LoVo (Fig. 4C).
(A-D), se trataron células SW480 y LoVo
con angina inestable durante 48 h. La expresión de la proteína COX-2 (A) y el ARNm (B) se analizaron por transferencia de Western y RT-PCR, respectivamente. Las densidades de la COX-2 mRNA y la relación de COX-2 /GAPDH se analizaron cuantitativamente (C). La producción de PGE2 se detectó por análisis de ELSIA (D). GAPDH se utilizó como controles para la carga de la muestra. (E), SW480 células fueron tratadas con un celecoxib inhibidor de COX-2 selectivo (CB, 20 mM) durante 4 horas, y después se trató con UA a 20 mM. A las 48 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se determinó mediante análisis MTT. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. *,
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PGE2 es un producto derivado de la COX-2, y que se sintetiza a través de la ciclooxigenasa y la prostaglandina vías sintasa. Se han tratado las células SW480 y LoVo con AI en 20 mM y se determinó el efecto de la UA sobre la producción de PGE2. Los resultados mostraron que el tratamiento UA redujo significativamente la producción de PGE2 en las células (Fig. 4D).
Para confirmar aún más que la inhibición mediada por UA de la proliferación celular es a través de la regulación de la COX-2 de señalización en células de cáncer de colon, pretratados células SW480 con celecoxib (CB, 10 mM), un inhibidor de la COX-2 selectivo, y probamos el efecto de la UA sobre la inhibición mediada por celecoxib de la proliferación celular. Como se muestra en la Fig. 4E, pre-tratamiento con celecoxib (CB) la viabilidad celular inhiba considerablemente, mientras que a las 20 UA M no alteró significativamente la inhibición mediada por celecoxib. Estos resultados mostraron que la inhibición de la proliferación de células de cáncer de colon por UA podría ser también parcialmente mediada por la inhibición de la señalización de la COX-2.
UA inducida por translocación de NF-kappa B y p300 de núcleos celulares a Citoplasma
la expresión de COX-2 se regula por la translocación y la interacción de transactivador NF-kappa B y p300 coactivator en los núcleos de células tumorales. A continuación realizó ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de la AU en la localización nuclear y la interacción de la NF-kappa B y p300 en las células SW480 y LoVo con cáncer de colon. Detectamos la translocación constitutiva de p50 y p65 de NF-kappa B y p300 a la celda núcleos (Fig. 5A y 5B) y la co-localización de p65 con p50 (Fig. 5A) o p300 (Fig. 5B), tanto en SW480 y LoVo Células. El tratamiento con UA a 20 mM y 40 mM inducidos translocación del NF-kB (Fig. 5A) y P300 (Fig. 5B) a partir de núcleos de células de citoplasma. Los resultados indican que la AU como objetivo la NF-kB y la señalización p300 mediante la promoción de su translocación a partir de núcleos de células de citoplasma de las células de cáncer de colon.
Células
SW480 y LoVo humano cultivadas en cámara de diapositivas fueron tratados con UA. A las 48 horas después del tratamiento, la localización subcelular de p50, p65 y p300 y la co-localización de p65 con p50 (A) o p300 (B) se examinaron por análisis de microscopía confocal con un microscopio confocal. Más de 100 células fueron inspeccionados por experimento, y se presentaron células con morfología típica.
UA dirigida Señalización P300 para inhibir NF-kB /CREB-2 La acetilación y la proliferación celular
La acetilación p300 mediada por transactivadores y su unión al gen de la COX-2 promover jugar un papel crucial en la expresión de COX-2. Se determinó el efecto al lado de la AU en la acetilación P300 mediada por transactivadores NF-kB y CREB2 en las células SW480 del cáncer de colon. El tratamiento con UA a 20 M en las células SW480 P300 transfectadas marcadamente inhibida los niveles acetilados de p50 /p65 y CREB-2 proteínas (Fig. 6A), mientras que la expresión de estas proteínas no cambió (Fig. 6B).
(a, B), SW480 células fueron transfectadas con FLAG-p300 durante 24 horas y después se trató con UA durante 48 h. Los extractos nucleares se prepararon y p50, p65 y CREB2 se inmunoprecipitaron con un anticuerpo acetil-lisina. Las proteínas acetilados (A) y la expresión de la proteína (B) de p50, p65 o CREB2 se analizaron por Western blot. (C, D), células SW480 se pretrataron con un inhibidor de la roscovitina p300 selectivo (ROSC, 20 M) (C), o transfectadas con un vector p300 que expresan (D) durante 8 horas, y después se trató con UA. A las 40 horas después del tratamiento, se determinó la viabilidad celular. vector vacío (EV) se utilizó un control de transfección. Cada barra representa la media ± SD de tres experimentos. *,
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. & Lt; 0,05, diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y grupos de control
Para comprobar el papel de la UA en la regulación de la señalización p300 en células de cáncer de colon, pretratados con roscovitina, un inhibidor de p300 (Fig. 6C), o transfectadas con un vector p300 que expresan en las células SW480 (Fig. 6D), y los efectos de la UA se analizaron en roscovitina o la proliferación celular mediada por p300. El tratamiento de células con roscovitina (ROSC, 20 mM) inhibió significativamente la viabilidad de las células, mientras que a las 20 UA M no cambió significativamente la inhibición mediada por la roscovitina (Fig. 6C). Por el contrario, la sobreexpresión p300 invierte significativamente la inhibición mediada por UA en las células SW480 en comparación con la transfección con un vector vacío (EV) (Fig. 6D). Estos resultados demuestran que p300 es un objetivo importante de la UA y que la inhibición inducida por UA de la proliferación celular está mediada al menos en parte a través de la vía de señalización de p300 en células de cáncer de colon.
UA citocromo c Targeted /caspasa Signaling para inducir apoptosis de las células
también se examinó el efecto de la UA sobre la apoptosis celular en células de cáncer de colon mediante un ensayo FACS basada en la tinción con anexina-V a las 48 h después del tratamiento. El tratamiento de células con UA en 20 mM y 40 mM dio lugar a una inducción dependiente de la dosis de las células apoptóticas positivas (Fig. 7A), lo que lleva a una inducción 6,3% a 14,2% en las células SW480 y 2,8% a 53,4% de inducción en LoVo las células (Fig. 7B). La activación de caspasas es un evento importante en aguas abajo vía apoptótica. A continuación se determinó si la apoptosis inducida por UA está relacionado con el aumento de la activación de la ruta de la caspasa en células SW480. Los efectos de la UA sobre la expresión de las proteínas escindidas de tres proteínas clave relacionados con la apoptosis: PARP, caspasa-3 y caspasa-9, se detectaron a las 48 horas después del tratamiento mediante análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 7C, el tratamiento con UA en 20 mM y 40 mM dio lugar a un marcado aumento de la PARP escindida, caspasa-3 y caspasa-9 proteínas, lo que sugiere que la AU puede funcionar como un mediador importante y específica para facilitar la activación de cascadas de caspasa.
células SW480 y LoVo fueron tratados con UA (20 mM y 40 mM). A las 48 horas después del tratamiento, la apoptotsis se determinó mediante un análisis FACS basada en la tinción AnnexinV-FITC (A, B). Los niveles de los escindidos de caspasa-3, caspasa-9 y PARP proteínas en las células SW480 se analizaron mediante transferencia Western (C). La liberación de citocromo c (cito-c) del espacio inter-mitocondrial en el citosol se determinó por análisis de imágenes de inmunofluorescencia (D). células SW480 fueron transfectadas con siRNA p300 durante 24 horas y seguido por el tratamiento con UA (20 M). A las 48 horas después del tratamiento, la apoptotsis se determinó mediante análisis FACS (E). La apoptosis están representados por porcentajes relativos de células apoptóticas en comparación con la de las células tratadas con DMSO. *,
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El citocromo c (cito-C) es la molécula de aguas arriba de la caspasa vía de la apoptosis dependiente. A continuación realizó el análisis de imágenes de inmunofluorescencia (IFI) para monitorear los cambios en la localización subcelular de cito-c en las células SW480 y LoVo tratados con UA para determinar si la AU podría provocar la liberación de cito-c. El tratamiento con UA (20 M) promueve eficazmente la liberación de cito-c del espacio inter-mitocondrial en el citosol (Fig. 7D). Estos resultados indican que la AU coordinado liberación cito-c del espacio de la membrana inter-mitocondrial y facilitó la activación de las caspasas aguas abajo en el citosol.
También examinó el efecto de la inhibición de p300 sobre la apoptosis inducida por la UA. Las células SW480 se transfectaron con un p300 siRNA específico (si-p300) y después se trató con UA (20 mM), y el efecto de la inhibición de la p300 sobre la apoptosis mediada por UA fueron analizados. Los resultados mostraron que desmontables de expresión p300 por si-p300 notablemente mejorada la inducción de la apoptosis mediada por UA (Fig. 7E), lo que confirma el papel de la señalización de p300 en la regulación de la apoptosis inducida por UA en células de cáncer de colon.
Discusión
En este estudio, se analizó la respuesta de las células de cáncer de colon humano para el tratamiento UA. UA inhibió significativamente la proliferación celular, la migración y la apoptosis inducida de una manera dependiente de la dosis. Hemos demostrado que la AU induce la liberación de citocromo c, por lo tanto la activación de caspasas y apoptosis causada. UA también regula la expresión de genes y MMP9 CDH1 y se inhibe la fosforilación de las proteínas Akt y ERK, dando lugar a una inactivación de la migración celular y vías de señalización relacionadas con la proliferación. Nuestro estudio también mostró que la UA suprimida COX-2 expresión y la producción de PGE2. Por otra parte, hemos demostrado que la supresión mediada por la AU de expresión y células de la COX-2 proliferación está mediada por la modulación simultánea de los P300, NF-kappa B, y la señalización CREB2. UA inhibe la acetilación P300 mediada por NF-kB y CREB2, y también promovió la translocación de p65 NF-kB y P300 a partir de núcleos de células de citoplasma. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que demuestra que la AU objetivos simultáneamente las múltiples vías de señalización para inhibir la proliferación de células de cáncer de colon e inducir la apoptosis
UA se ha estudiado intensivamente en el pasado.; principalmente como un compuesto anti-cáncer y por sus propiedades de protección cardiovascular. La polémica de los informes sugiere que los efectos anti-angiogénicos y citotóxicos de la UA en un lado y los efectos protectores cardiovasculares y endoteliales en el otro lado. Actualmente, no hay pruebas suficientes para recomendar una dosis humana ideal. Los estudios en animales sugieren que el uso de beneficios entre 0,05-0,2% de la dieta de rata como UA. Suponiendo un intervalo de 10-40 mg /kg de peso corporal, los beneficios en estudios con ratas asociados con la UA son aproximadamente iguales a una dosis humana de 01.06 a 06.04 mg /kg de peso corporal (110 a 440 mg para una persona de 150 libras).
Los efectos secundarios de la UA desde incluyen principalmente dos aspectos: la fertilidad masculina y el daño del ADN. estudio previo ha puesto de manifiesto que la AU tiene el potencial de la inhibición de la motilidad del esperma y puede servir como un anticonceptivo vaginal tópica [24], [25]. En concreto, se hace que la rotura de los puentes entre las células que son pronto a ser de esperma, y las células dañadas entonces recoger para formar symplasts en los túbulos seminíferos que están asociados con la infertilidad masculina. UA como un anti-angiogénesis, anti-cáncer y localmente aplicados fármaco cardiovascular puede ser útil. Sin embargo, la actividad que daña el ADN de la AU puede también constituir un problema serio. UA fue capaz de inducir la muerte celular en las células endoteliales cuando la concentración supera 12,5 mu M [26].
La expresión de COX-2 juega un papel clave en cánceres humanos. COX-2 expresión y la producción de PGE2 se han demostrado para regular positivamente la PI3K /Akt y señalización de ERK, la angiogénesis inducida de este modo, la proliferación celular, la migración y la invasión [27], [28]. COX-2 inhibición puede resultar en la supresión del crecimiento celular y la apoptosis e inducir epitelial-mesenquimal transición [29] - [32]. Sin embargo, el mecanismo por el que la COX-2 es altamente expresado en la tumorigénesis no se entiende completamente. COX-2 regulación transcripcional se ha caracterizado ampliamente [33] - [35]. P300 ha demostrado ser esencial para la expresión COX-2 y ejerce un efecto global sobre la COX-2 estructura de la cromatina promotor para aumentar la unión de transactivadores [20], [21]. P300 se expresa en abundancia en las células cancerosas y la sobreexpresión de p300 aumenta COX-2 de activación transcripcional [36], [37]. Sirve como un coactivador de la transcripción para salvar las transactivadores promotor ligado con factores de transcripción en la maquinaria de transcripción [20], [21]. P300 SOMBRERO acetylates histonas abriendo así la estructura de la cromatina y promueven el acceso de elementos potenciadores a transactivadores. P300 HAT también es capaz de acetilar transactivadores tales como NF-kB, de ese modo potenciar la unión transactivador [21]. Consistente con los informes anteriores, nuestro presente estudio también mostró que p300 desempeña un papel crucial en la regulación de NF-kB y la acetilación y la proliferación celular CREB2 en células de cáncer de colon humano. objetivos UA P300 señalización para inhibir la acetilación de NF-kappa B y CREB2, por tanto, inhibe la proliferación celular. Se ha demostrado que p300 HAT está regulada por la fosforilación de p300 o acetilación [38]. Es posible que la AU suprime la fosforilación de p300, p300 altera conformación HAT y la actividad catalítica, e inhibe la modificación post traduccional de HAT p300, bloqueando así la actividad HAT en células de cáncer de colon. Se necesitan más estudios para dilucidar el mecanismo por el cual inhibe la señalización UA p300.
Estudios anteriores demostraron que la AU induce la apoptosis en los cánceres humanos [39]. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos y vías de señalización mediante el cual UA induce la apoptosis siguen sin estar claros. Curiosamente, nuestros datos demuestran que la inducción de apoptosis por UA es principalmente a través de la activación mediada por UA de la vía apoptótica dependiente de caspasa. El tratamiento de células con AI desencadena la liberación de citocromo c (cito-c) al citosol, y luego estimula la activación de las caspasas, la apoptosis inducida por ello.
También encontramos que la AU como objetivo la Akt y ERK-dependiente las vías de señalización para inhibir la proliferación de células de cáncer de colon. La Akt fosforilada y ERK son los mediadores de la proliferación celular y la supervivencia y la respuesta clínica a los inhibidores de tirosina quinasa (TKI), y una reducción de la Akt fosforilada y expresión ERK es un evento importante en la sensibilización de células tumorales para el tratamiento TKI. UA inhibió la fosforilación de las proteínas Akt y ERK, lo que resulta en una inactivación del crecimiento celular y la vía de señalización relacionadas con la supervivencia Akt /ERK. Nuestros resultados tienen implicaciones importantes en la exploración de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de colon.
En resumen, hemos demostrado que la AU inhibe la proliferación celular y la migración e indujo apoptosis en células de cáncer de colon mediante la modulación simultáneamente el MMP9 /CDH1, Akt /ERK , vías de señalización de la COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, y el citocromo c /caspasa-dependiente (Fig. 8). Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de la inhibición mediada por la AU proliferación y apoptosis de inducción y sugieren que la AU puede ser un agente prometedor para la prevención y el tratamiento de cáncer de colon humano.
UA inhibe la proliferación celular y la migración y inducida por la apoptosis en células de cáncer de colon mediante la modulación simultáneamente el /CDH1, Akt /ERK, la COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, y el citocromo c /vías de señalización dependiente de caspasas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y productos químicos
de colon humano líneas celulares de cáncer (SW480, LoVo) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en RPMI 1640 medios suplementados con suero fetal inactivado por calor al 10% bovino, 100 mg /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina, y se mantiene en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C . En todos los experimentos, se probaron las células con 60% de confluencia. El ácido ursólico (UA), celecoxib y la roscovitina se adquirieron de (Sigma (St. Louis, MO). Una solución de 100 mM de fármaco se prepara en dimetil sulfóxido (DMSO), almacenado como pequeñas alícuotas a -20 ° C y después se diluyó como necesaria en medio de cultivo celular.
viabilidad celular ensayo
viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT (Roche Diagnosis, Indianapolis, IN). brevemente, las células en placas de 96 pocillos (3000 células /así) se trató con UA a varias dosis. a las 48 h después del tratamiento, se determinó la viabilidad celular.
Colonogenic Ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos se trataron con UA. después de 24 h , las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron. Luego, las células se sembraron a 100 células /pocillo en placas de 6 pocillos, y se dispersan uniformemente agitando ligeramente los platos y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2 durante 21 días. El medio se