Extracto
Como agentes individuales, ABT-263 y ABT-737 (ABT), antagonistas moleculares de la familia Bcl-2, se unen fuertemente a Bcl-2, Bcl-xL y Bcl-w, pero no MCL-1, e inducir la apoptosis sólo en tipos de células limitados. El compuesto 2-desoxiglucosa (2DG), en contraste, bloquea parcialmente la glucólisis, la desaceleración del crecimiento celular, pero rara vez causando la muerte celular. Se inyecta en un animal, 2DG se acumula predominantemente en los tumores pero no daña a otros tejidos. Sin embargo, cuando las células que eran altamente resistentes a ABT fueron pre-tratados con 2DG durante 3 horas, ABT se convirtió en un potente inductor de la apoptosis, la liberación rápida del citocromo c de la mitocondria y la activación de caspasas en concentraciones submicromolares de una manera Bak /Bax-dependiente. Bak se secuestra normalmente en complejos con MCL-1 y Bcl-XL. 2DG ceba células al interferir con Bak-MCL-1 asociación, por lo que es más fácil para ABT para disociar Bak de Bcl-xL, liberando Bak para inducir apoptosis. Un transportador de glucosa altamente activo y Bid, como un agente del bucle de amplificación de la señal apoptótica mitocondrial, son necesarios para la inducción de apoptosis eficiente en este sistema. Este tratamiento de combinación de los ratones portadores de cáncer era muy eficaz contra el xenoinjerto de tumor de las células de cáncer de próstata hormona independiente altamente metástasis de quimioterapia resistente a humanos, lo que sugiere que el tratamiento de combinación puede proporcionar una alternativa segura y eficaz para genotoxina basados en terapias contra el cáncer.
Visto: Yamaguchi R, Janssen E, G Perkins, Ellisman M, Kitada S, Reed JC (2011) Eliminación eficiente de las células cancerosas mediante la terapia desoxiglucosa-ABT-263/737 de combinación. PLoS ONE 6 (9): e24102. doi: 10.1371 /journal.pone.0024102
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2011; Aceptado: 31 de julio de 2011; Publicado: 19 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Yamaguchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. EJ recibido Institutos nacionales de Salud (NIH) /Instituto Nacional del cáncer de subvención CA138617, me recibieron subvención NIH P41RR004050, y JCR recibieron CA113318, CA055164, y CA081534. Algunos de los trabajos descritos aquí se llevó a cabo utilizando las instalaciones del Centro Nacional de Microscopía y Imaging Research de la Universidad de California en San Diego, apoyado por el NIH CNRR través de la subvención número P41RR004050 para mí. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
2-desoxi-D-glucosa es una molécula de glucosa que tiene el grupo 2-hidroxilo sustituido por hidrógeno. 2DG se transporta a través de la membrana plasmática por un transportador de glucosa [1]. Una vez en el citosol, 2DG se fosforila por la hexoquinasa II y su producto, 2-desoxiglucosa 6-fosfato, es atrapado en el citosol y se convierte en un inhibidor de hexoquinasas, al igual que la glucosa se convierte en glucosa 6-fosfato y se convierte en un inhibidor de hexoquinasas. Sin embargo, como la glucosa 6-fosfato es hidrolizado por la glucosa 6-fosfatasa muy rápidamente, produciendo NADPH y la generación de energía, su contraparte, 2-desoxiglucosa 6-fosfato, es un sustrato pobre de la glucosa 6-fosfatasa. En consecuencia 2-desoxiglucosa 6-fosfato se acumula en el citosol, la inhibición de hexoquinasas y reducción de los niveles de energía celular. Se estima que la vida media intracelular de 2-desoxiglucosa 6-phsophate es de aproximadamente 50 min en células de cáncer [2]. Por lo tanto 2DG actúa como un inhibidor de la vía glicolítica.
Las velocidades de hidrólisis más lentas de 2-desoxiglucosa 6-phsophate permiten la captación de glucosa a ser medido en los animales vivos por
18F-fluoro-2-desoxiglucosa basado Tomografía por emisión de positrones (PET-FDG). Los recientes avances en FDG-PET ha demostrado claramente tasas mucho más altas de las actividades de transportadoras de glucosa in vivo, de casi todos los tumores sólidos en comparación con los tejidos sanos normales, lo que confirma el efecto Warburg [1]. FDG-PET también se ha convertido en una forma muy sensible para detectar los tumores en una etapa muy temprana, por ejemplo, etapa temprana el cáncer de páncreas asintomática. Desde 2DG se acumula predominantemente en las células cancerosas y parcialmente inhibe-mucho utilizado glicólisis en estas células, la administración de 2DG es una manera segura y efectiva de frenar el crecimiento del cáncer [1]. Sin embargo, la actividad citostática de 2DG es generalmente de corta duración, que dura sólo alrededor de una semana [3]. Por lo tanto 2DG se ha tratado en combinación con otros agentes quimioterapéuticos, pero de nuevo con resultados mixtos. En algunos casos, se podría reducir la eficacia de otros tratamientos [4]. Una razón de disminución de la eficacia en estas terapias de combinación podría ser que en algunas células, 2DG activa un factor de crecimiento receptor similar a la insulina (IGFR), lo que podría activar la vía de mTOR-AKT PI3K pro-supervivencia [5], [6].
Varios medicamentos dirigidos a Bcl-2 y MCL-1 han sido probados por su capacidad de inducir la apoptosis en células de cáncer [7]. El más destacado entre ellos son los antagonistas de Bcl-2 ABT-737 y ABT-263 [8], [9]. ABT-737 se une específicamente y con alta afinidad a la familia Bcl-2 de proteínas, incluyendo Bcl-2, Bcl-xL y Bcl-w, pero no a MCL-1. ABT-737 fue modificada en tres sitios para crear ABT-263 para mejorar la biodisponibilidad oral sin la pérdida de la afinidad a la familia Bcl-2 de proteínas [9]. Como agente único, sin embargo, ABT-263/737 (ABT) induce la apoptosis sólo en los tipos de tumores limitados, tales como linfomas y algunos pequeños carcinomas de pulmón de células [8], [9], [10]. La razón de diversas sensibilidades a ABT no está del todo claro.
La apoptosis tiene lugar típicamente o bien la vía intrínseca, en el que el citocromo c es liberado de las mitocondrias de manera Bax /Bak-dependiente, la activación de apoptosomes en el citosol, o la vía extrínseca, en el que las caspasas se activan directamente aguas abajo de los receptores de muerte (revisado por Salvesen & amp; Riedl [11]). A menudo existe diafonía entre estas dos vías. Debido ABT se une proteínas mitocondriales, se piensa que la apoptosis inducida por ABT que se produzca a través de la vía intrínseca, pero no se sabe exactamente cómo se hace esto.
El paso crítico en la vía intrínseca de la apoptosis es cuando citocromo c es liberado de las mitocondrias porque una vez que el citocromo c se libera en el citosol, que estimula la formación de apoptosomes, el verdugo de muerte. Por esta razón, la liberación del citocromo c se llama a menudo el punto de no retorno [12]. Hasta hace unos años, se pensaba que los poros de transición de permeabilidad mitocondrial activados por calcio (MPTP) pueden ser necesarios para la liberación del citocromo c en la vía intrínseca de la apoptosis. Sin embargo, se demostró que la inducida por tBid la liberación del citocromo c y la posterior apoptosis podrían tener lugar en ausencia de VDAC [13] y la ciclofilina D [14], [15], dos componentes esenciales de la MPTP (revisado en Yamaguchi & amp; Perkins [dieciséis]). En cambio, el dogma predominante es que la liberación del citocromo c se produce a través de poros outermembrane mitocondriales (MOMPs). Aunque MOMP es un concepto bien establecido, su existencia sigue siendo hipotética porque a diferencia de los poros nucleares o MPTP, no hay imágenes de EM MOMPs. Del mismo modo, MOMPs no se han aislado como una entidad biológica. Por lo tanto, no se sabe si Bak o Bax residen en MOMPs. El análisis más detallado de la formación MOMP durante la apoptosis, salió del estudio de vesículas lipídicas ensambladas con proteínas mitocondriales outermembrane. En estos estudios, Bax activado por tBid se usa para estimular la Asamblea MOMP en las vesículas [17], la estimulación de la liberación de proteínas tan grandes como 2000 kDa [18] a través de los poros con diámetros de 25 a 100 nm [19]. Si MOMPs en las mitocondrias son aproximadamente del mismo tamaño, se podría esperar para verlos mediante microscopía electrónica (EM), pero no han sido fotografiadas. Por lo tanto, la existencia de MOMPs sigue siendo hipotética. Sin embargo, desde un punto de vista mecanicista, la existencia de MOMPs compuesta en su totalidad o en parte por Bax y Bak tiene sentido.
BH3-sólo las proteínas tales como tBid, Bims se llaman "activadores" debido a que interactúan directamente con Bax o Bak, el cambio de su conformación y la inducción de la oligomerización, en otras palabras "activación", lo que lleva a la liberación de citocromo c y la apoptosis. Hallazgos más recientes, sin embargo, sugieren otro escenario en el que la apoptosis tiene lugar en ausencia de proteínas activadoras. En primer lugar, Huang y sus colegas demostraron que Bak es normalmente secuestrado por MCL-1 y Bcl-XL, y Bak deben ser liberados de ambos antes de que pueda formar oligómeros [20]. La idea de que la inactivación de algunas proteínas anti-apoptóticas sin la ayuda de algún activador puede inducir la apoptosis, no está exenta de controversia [21], [22]. Estamos a favor de la idea porque Huang y sus colegas encontraron que la inactivación de Bcl-XL y MCL-1 fue suficiente para inducir la apoptosis en una oferta y Bim MEFs knockout [23], y Hayashi y sus colegas encontraron la misma en las células de plaquetas deficientes Oferta y Bim [24 ].
Si se asume que Bim y Bid no están implicados en la apoptosis inducida por ABT, podemos especular razones variadas sensibilidades a ABT-737. Desde ABT-737 se une a Bcl-XL, la inactivación de ella, pero no se une a MCL-1, si hay menos MCL-1 proteínas presentes, entonces la eficacia de ABT-737 debe aumentar. De hecho, Huang y sus colegas encontraron que al agotar MCL-1 a partir de células HeLa con siRNA, se convirtieron en sensibles a ABT-737 [25]. Muchos grupos también reportaron correlaciones inversas entre la sensibilidad de las células cancerosas a ABT-737 y MCL-1 los niveles de expresión en muchos tipos de cáncer (ver información S1). Sin embargo, hay excepciones; células de leucemia promyerlocytic humanos HL-60 expresan razonablemente grandes cantidades de MCL-1, pero son, sin embargo, sensible a ABT-737 [26]. Por lo tanto la forma ABT-737 induce la apoptosis en algunas células cancerosas y no en otros, sigue siendo poco entendido.
inició este proyecto con el fin de buscar agentes que pueden aumentar la eficacia de la ABT. líneas de células tumorales humanas con ABT y fármacos que interfieren con el metabolismo celular específica del cáncer Cuando co-tratado, se encontró que 2DG pre-tratamiento mejoró enormemente la eficacia de ABT sin dañar las células sanas. Se demuestra que 2DG-ABT induce apoptosis sin alterar los niveles MCL-1 en las células ABT-resistentes. Cuando las células cancerosas resistentes a ABT son pre-tratados con 2DG, los niveles de proteína de MCL-1 siguen siendo los mismos, pero se pierde Bak-MCL-1 asociación, las células de la apoptosis inducida por la sensibilización de ABT. Cómo el tratamiento de células de cáncer de 2DG interrumpe Bak-MCL-1 no se conoce. Por lo tanto, la sensibilidad de las células cancerosas a ABT parece estar determinada no sólo por los niveles de proteína de MCL-1, sino también por la cantidad de Bak es secuestrado por su asociación con MCL-1.
Resultados
2DG-ABT induce la apoptosis de manera eficiente de las células cancerosas
aplica como un agente único, 30 nM de ABT-737 mató el 90% de RS (4; 11) células de linfoma de células B no Hodgkin en 9 horas ( Fig. 1a). Sin embargo, un 1-hora pre-incubación de RS (4; 11) células con 5 a 10 mM de 2DG en medio que contiene glucosa 10 mM aumentó la eficiencia de ABT dramáticamente, matando a 90% de las células con sólo 3 nM ABT-737. 2DG solo no causó muerte celular durante la incubación de 10 horas. Cuando probamos para la activación de la caspasa, se encontró que tan poco como 1 nM de ABT-737 podría activar las caspasas en 3 horas, siempre y cuando las células se pre-incubaron con 2DG durante 3 horas. No activación de la caspasa más allá del fondo se observó en células que se incubaron con 2DG solo. Por lo tanto, se puede concluir que 2DG sensibiliza RS (4; 11) las células a la apoptosis inducida por ABT. Repetimos el experimento utilizando varias concentraciones de ABT-263 y células contadas por el colorante azul de tripano consigue marcar las células muertas de 24 horas después de la adición de ABT (Fig. S1a). El resultado también mostró un efecto sinérgico de 2DG y ABT
a, RS (4; 11). Las células pre-tratadas con fructosa 20 mM o 0-10 mM 2-desoxi-D-glucosa en un medio ordinario de RPMI que contiene glucosa 12 mM, durante 1 hora antes de la adición de ABT-737 a las concentraciones indicadas. 9 horas después, las células se analizaron por FACS para Anexina-V positividad. Prueba de Chi cuadrado de independencia de dos variables, 2DG y ABT, fue de P (x ~
1
2 & gt; 193.35) = 0,000000. Dado que la combinación era claramente mejor que los valores esperados, la estadística sugiere interacción sinérgica entre 2DG y ABT-737. b, las células HeLa se trataron previamente durante 1 hora con o sin 10 mM desoxiglucosa en DMEM que contiene glucosa 12 mM, antes de la adición de ABT-737. Seis horas después, las células se analizaron por FACS para la tinción de Anexina-V. c, las células HeLa se trataron previamente durante 3 horas con 2DG antes de la adición de ABT-737. Las células se ensayaron para determinar la actividad de la caspasa a las 3 horas después de ABT-737 adición. d, células HeLa, PPC-1 y MCF-7 fueron tratados con 2DG 10 mM durante 3 horas antes de la adición de 1 M ABT-263 para la incubación durante la noche. Trypan azul-negativas se contaron y se representan células (viables) (media ± dev std; n = 3). e, la terapia de combinación reduce la supervivencia clonogénico de células PPC-1. células PPC-1 se trataron sólo una vez durante 24 horas con mM 2DG 5, 1 M ABT-263, ambos, o se dejaron sin tratar. 250-1000 células se cultivaron por 30 mm placa, y 12 días más tarde, las colonias de células fueron teñidas.
A continuación, hemos probado si 2DG podría sensibilizar a las células tumorales resistentes a la ABT-ABT-737 o ABT -263. Los experimentos iniciales se realizaron con células de cáncer cervical HeLa. Las células HeLa se pre-trataron durante 1 hora con 2DG antes de la adición de ABT-737. Nueve horas después de la adición de 1 M de ABT-737, aproximadamente el 35% de las células HeLa que se trataron previamente con 2DG, eran Anexina V-positivo (Fig. 1b). Esta tasa de muerte celular fue comparable a la observada tras el tratamiento de células HeLa con 1 M de estaurosporina (STS), un inductor conocido de la apoptosis en células HeLa En otra serie de experimentos, cuando las células HeLa fueron pre-tratados durante 3 horas con 2DG 10 mM en un medio que contiene glucosa 25 mM, se observó la activación de caspasa robusta dentro de 3 horas a concentraciones de ABT-737 tan bajas como 0,1 mM (Fig. 1C). Sin 2DG pre-tratamiento, incluso 10 mM ABT-737 no podía activar las caspasas durante el mismo período. Este experimento se repitió usando ABT-263 y marcando las células muertas con la incorporación de colorante azul de tripano (Fig. S1b). Una vez más, se mostró un efecto sinérgico de ABT-263 y 2DG. ABT-737 y ABT-263 se compararon lado a lado usando tres horas 2DG-pretratamiento de las células HeLa. ABT-263 fue ligeramente mejor que ABT-737 en la inducción de la apoptosis (Fig. S2a).
Condiciones para 2DG-ABT apoptosis inducida
Kinetic y los estudios de dosis-respuesta con células HeLa mostraron lo siguiente : (i) la presencia de glucosa en el medio es necesario para la apoptosis inducida 2DG-ABT (Fig S2b.), y la relación molar óptima para la inducción de apoptosis con 2DG: glucosa es de aproximadamente 0,4 a 1,0; (Ii) 2DG se debe añadir de 3 a 4 horas antes de la adición de ABT (Fig S2c & amp;. D); y (iii) la activación de caspasa se observa dentro de 3 horas de la adición de ABT. Estas condiciones pueden reflejar la estabilidad de ABT-263/737 en solución (aproximadamente 4 horas [9]), así como la naturaleza de las señales intercelulares generados por 2DG; se debe tomar de 3 a 4 horas para 2DG para generar una señal lo suficientemente fuerte como para ser eficaz. En estas condiciones, la reducción en la concentración de ATP celular es muy leve (Fig. 5a), lo que sugiere que la insuficiencia de ATP no proporciona una explicación para la mejora de la sensibilidad a ABT-737 y ABT-263.
Todos los experimentos posteriores se realizaron con las siguientes condiciones: Añadir 2DG 5-10 mM al cultivo celular. Tres horas después, añadir 1-3 M ABT. Ensayo para la liberación de la actividad de caspasa y c de la mitocondria citocromo tres horas después de ABT-tratamiento. Seis horas después de ABT-tratamiento, ensayo para Anexina V tinción. 24 horas más tarde, contar las células viables mediante el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. La respuesta al protocolo varió de línea celular a línea celular. Entre las células de cáncer que respondieron bien eran línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea celular de cáncer de próstata resistente a la hormona PPC-1. En ambos casos, más del 95% de las células fueron eliminadas en 24 horas por el tratamiento combinado (Fig. 1d). Una aplicación de un solo agente de 2DG causó cierta muerte (31,3% en el caso de HeLa, ninguno observado en las células MCF-7, y el 21,5% para el PPC-1). Puesto que todas las células tienen diversas cantidades de glucógeno como fuente almacenada de glucosa, las tasas de muerte celular por 2DG dependía en gran medida de la historia previa de condiciones de cultivo. Las células cultivadas normalmente superar crecimiento detención inducida por 2DG y comienzan a crecer en 24-48 horas (datos no mostrados). Además, cuando 2DG se inyectó en ratones portadores de cáncer, que no causó la regresión del tumor, pero retrasa el crecimiento del tumor por 5-6 días. Después de esta breve demora, los tumores comenzaron a crecer. Otros grupos habían hecho observaciones similares [4]. La razón de la resistencia adquirida a 2DG no se conoce. Como agente único, el efecto de ABT-263 también fue marginal (13,7% en el caso de HeLa, 3,1% para las células MCF-7 y el 36,7% para el PPC-1). Los efectos de la combinación de 2DG-ABT superó los efectos aditivos de 2DG y ABT en las tres líneas celulares (HeLa espera células viables 59%, observó 25%, MCF7 espera células viables 115%, observaron 3,8%, y PPC1 espera que células viables 49,7 %, observado 3,9%). El ensayo clonogénico de supervivencia celular también mostró que más del 95% de las células PPC-1 fueron eliminados por un solo tratamiento, mientras que las aplicaciones con un solo agente de ABT o 2DG fueron en gran medida ineficaz (Fig. 1e). Dado que p53 es inactivo en algunas de las líneas tumorales alta capacidad de respuesta incluyendo PPC-1 [27], [28], [29], llegamos a la conclusión de que la apoptosis inducida por combinación es independiente de p53. Las posibles razones de variadas respuestas serán discutidos más adelante.
Con el fin de comprender exactamente qué eventos moleculares tienen lugar cuando se añade a las células ABT 2DG tratados, decidimos primero en investigar qué tipo de apoptosis está siendo inducida por el combinación de 2DG y ABT.
el tratamiento de combinación con 2DG y ABT induce la apoptosis a través de la vía intrínseca
se ha informado de que la aplicación de 10 nM ABT-737 por sólo 2 horas hace que el mitocondrial membrana externa a la ruptura de las células de leucemia linfocítica crónica (LLC) [30]. Este no es un fenómeno normal en la apoptosis. El citocromo c se libera por lo general a través de poros outermembrane mitocondriales en forma ordenada [31]. La destrucción de las mitocondrias tiene lugar poco después de la liberación del citocromo c por las actividades de los mecanismos de muerte celular totalmente activadas. Cuando se examinaron las células HeLa tratadas con la combinación de 2DG-ABT usando EM, la rotura de las membranas mitocondriales externas no se detectó (Fig. 2a). En las células tratadas con ABT, sin embargo, una ligera reducción de las mitocondrias se observó (Figura 2b & amp;. C); de 0,717 +/- 0,05 micras para no tratado a 0,530 +/- 0,05 micras para ABT única, 0,553 +/- 0,06 micras para 2DG + ABT, y un ligero alargamiento de las mitocondrias en las células tratadas con 2DG a 0,844 +/- 0,05 micras. Especulamos que ya son conocidos Bcl-xL y Bcl-w estar involucrado en mitocondrial fusión /fisión [32], ABT puede haber inhibido sus actividades. En cuanto a la prolongación de las mitocondrias en virtud de 2DG, puede tener una mayor demanda creada para la respiración mitocondrial, y para cumplir con esa carga, las mitocondrias puede haberse vuelto más tiempo. A pesar de que 2DG y ABT tuvieron efectos opuestos sobre la longitud de las mitocondrias, que tanto influyó en las fisiologías de las mitocondrias. A pesar de que algunos especula que la maquinaria de fusión de las mitocondrias /fisión también puede desempeñar un papel en la apoptosis, la idea sigue siendo controvertida [33].
Las células HeLa tratadas con 2DG ya sea 10 mM durante 6 horas, 1 M ABT-263 de 3 horas, o 2DG para 3 horas antes de la adición de ABT-263 durante 3 horas adicionales, o no se tratan. a, Las células se fijaron para microscopía electrónica (véase el método). Tres células de cada grupo de tratamiento se examinaron estrechamente para la longitud de las mitocondrias. No se observó un solo caso de rotura de outermembranes mitocondriales. b, de cada célula, un mínimo de 12 mitocondrias fueron elegidos al azar para la medición. c, promedios de duración de las mitocondrias se acortaron con los tratamientos que contienen ABT-263 (media +/- std dev). Desde ABT-263/737 se une a miembros de la familia Bcl-2, que se sabe que están implicados en mitocondrial fusión /fisión, ABT puede haber alterado el equilibrio de la fusión mitocondrial /fisión hacia el lado de fisión (p = intervalo de confianza 0,0001, 95% de esta diferencia:. 14,5407-37,2513; prueba t no pareada) guía empresas
Para determinar si la apoptosis inducida por 2DG-ABT es a través de la vía intrínseca, se utilizó de tipo salvaje (wt) fibroblastos de embrión de ratón (MEF) y Bax /Bak doble knockout (DKO) MEFs. Estas células DKO se carece de la vía intrínseca. En los de tipo salvaje MEFs tratadas previamente con 2DG, se indujo la activación de la caspasa 3 horas después de adición ABT (Fig. 3a). Sin embargo, no hubo activación de la caspasa rápida en Bak /Bax DKO MEFs. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la apoptosis inducida por 2DG-ABT se produce por la vía intrínseca Bak /Bax-dependiente (véase también la Fig. S5a).
a, en peso, y Bax /Bak DKO MEFs fueron tratados con 10 mM 2DG durante 3 horas antes de la adición de 3 mM ABT-263 durante 3 horas. 3 horas después, las células se recogieron para ensayos de actividad de caspasa. (Véase también la Fig. S5a). b, las células HT1080 fueron tratadas con o sin 2DG durante 3 horas. A continuación, las células se trataron con 1 M STS o contra Fas-anticuerpo (CD95) a las concentraciones indicadas (g /ml). Las células se recogieron después de 3 horas, y se ensayaron para la actividad de caspasa. Curiosamente, 2DG parece haber interferido con la apoptosis inducida por Fas. En experimentos repetidos, se observó tasas consistentemente más bajos de activación de la caspasa en las células pretratadas 2DG, pero los grados de actividad inhibidora variaba de experimento a experimento. No estamos seguros de su causa. C, durante las primeras 3 horas, las células HeLa fueron tratados ya sea con 2DG 10 mM o se deja sin tratar y después se trató con 10 M z-VAD, 1 M ABT-737, ambos o ninguno durante 3 horas más. Las células se fijaron y se tiñeron para el ADN (rojo) y citocromo c (verde) y se examinaron para la pérdida de la tinción de citocromo c, como se describe en Métodos. La barra indica 100 micras. Las imágenes representativas se muestran en la Fig. S3. Este gráfico muestra el porcentaje de células con pérdida de la tinción de citocromo c. El tratamiento combinado tenían tasas más altas de células con el citocromo c liberado (p = 0,008 por la prueba t no pareada). d, las células tratadas como en c se fraccionaron y las fracciones citosólicas se analizaron por Western blots.
Para probar si 2DG también sensibiliza a las células tumorales a la vía extrínseca de la apoptosis, se utilizó células HT1080, en el que hay hay diafonía entre las vías intrínseca y extrínseca [34]. Pre-tratamiento de las células HT1080 con 2DG durante 3 horas no mejoró la apoptosis inducida por Fas, pero redujo la activación de caspasa (Fig. 3b). Por lo tanto, 2DG no mejoró la vía extrínseca.
2DG-ABT induce la liberación de citocromo c a través de un mecanismo dependiente de caspasa
Un paso crítico en la vía intrínseca es la liberación del citocromo c de la mitocondria . Cuando 1 M de ABT-737 se aplicó a las células HeLa que había sido pre-tratadas con 2DG durante 3 horas, se observó la liberación de citocromo c en más de 30% de las células dentro de los siguientes 3 horas, pero no en las células no tratadas o células tratados con 2DG o ABT solo (Fig. 3c y Fig. S3).
En las formas mitocondrias dependiente canónicas de apoptosis tales como staurosporine-, etoposide- o muerte celular inducida por UV, la liberación de citocromo c de las mitocondrias se produce aguas arriba de la activación de caspasa y puede proceder en presencia de inhibidores de caspasa [35], [36]. Por el contrario, durante la muerte apoptosis receptor inducida por caspasas activadas por estos receptores pueden también escindir la proteína Bid, produciendo truncada Oferta (tBid), con tBid entonces inducir Bak /oligomerización Bax y la formación de poros en las membranas externas mitocondrial a través del cual citocromo c escapa. Por lo tanto, un inhibidor de pan-caspasa, tales como la liberación c z-VAD bloques del receptor de la muerte inducida por el citocromo de la mitocondria. Se encontró que la liberación del citocromo c inducida 2DG-ABT también fue bloqueado por z-VAD cuando se añade de forma sincronizada con ABT (figura 3c & amp;.. D, la figura S2), sin embargo, hemos demostrado que la apoptosis 2DG-ABT inducida es Bax /Bak- dependiente. Este enigma podría explicarse por un bucle de amplificación dependiente de la subasta en la que una pequeña cantidad de citocromo c liberado por ABT podría activar una cascada de caspasas (tales como caspasas 9,3,6 y 8) en el citosol, la escisión de la subasta para generar tBid , con tBid a su vez la activación de Bak /Bax y provocando una mayor liberación de citocromo c de la mitocondria [37], [38].
los efectos del agotamiento de la subasta en la apoptosis inducida por 2DG-ABT
Hemos estudiado si el bucle de amplificación basado en la hipótesis de la subasta juega un papel en la apoptosis inducida por 2DG-ABT. En primer lugar, determinamos si la subasta se escinde durante la apoptosis inducida por 2DG-ABT. Tanto en células HeLa y PPC-1, 2DG pre-tratamiento seguido de la adición de 1 M ABT-263/737 inducida por la liberación del citocromo c de la mitocondria en 3 horas. En ambos tipos de células, la liberación de citocromo c fue bloqueado por z-VAD-fmk. Con la línea de PPC-1, casi 100% de las células liberadas del citocromo c, causando cerca de 100% de apoptosis. Con las células HeLa, la proporción de células que muestran la liberación de citocromo c en las primeras tres horas fue de aproximadamente 30% (Fig. 3c). Truncado tBid fue visto 3 horas después de la adición de ABT en células HeLa (Fig. 4a, los datos no se muestran) PPC-1 y. tBid estaba ausente en las células tratadas con 2DG solo. Cuando se añadió z-VAD-FMK con ABT, se bloqueó la disociación de la subasta.
a, la subasta se activa durante la apoptosis inducida por 2DG-ABT. Western blots de lisados celulares PPC-1 tratados con 2DG 10 mM durante 0-6 horas (panel izquierdo), ya sea con 1 M ABT-263 solo o ABT-263 + 10 M z-VAD para las últimas 3 horas (panel derecho) , se sondaron con el anticuerpo anti-tBid (paneles superiores), el anticuerpo anti-OPA1 (paneles intermedios), y anti-alfa-tubulins (paneles inferiores). Nota: se utilizó la pérdida de Opa-1-L como un marcador de crestas mitocondriales remodelado durante la liberación del citocromo c de la mitocondria [34]. b, los efectos del agotamiento de la subasta en la apoptosis inducida por 2DG-AB. Insertar: transferencias Western de PPC-1 lisados de células transfectadas, maquetas (carril izquierdo) o transfectadas con siRNA de la subasta (carril derecho). Oferta (+) y Bid (-) células PPC-1 se trataron con cualquiera de 2DG, ABT-263 (1 mM), ambos, 10 mM ABT-263, o se deja sin tratamiento durante 24 horas. Las células viables se contaron y el aumento /disminución en los números de entrada se graficaron. c, en células PPC-1 ya sea pre-tratado con 2DG durante 3 horas o sin pre-tratamiento, a continuación, se añadió 1 mu M de ABT-263 o 1 M STS durante tres horas, y las fracciones citosólicas se analizaron por Western blots. En experimentos paralelos, Bid-agotadas las células PPC-1 fueron tratados con la combinación de 2DG y ABT-263 o con STS y analizados (designados como kd Oferta, últimos 2 carriles). Las células se recogieron 3 horas después del tratamiento ABT /STS, y las fracciones citosólicas se analizaron con transferencias Western.
Para determinar qué efecto, si lo hay, la subasta ha de apoptosis inducida por 2DG-ABT, hemos agotado el una oferta de proteínas de siRNA. apoptosis inducida por 2DG-ABT fue bloqueado en gran medida en las células PPC-1-agotado de la subasta. agotamiento de la subasta incrementó los porcentajes de células viables por ~ 8 veces (p & lt; 0,0077; prueba t no pareada) (Fig 4b.). Las cantidades de citocromo c liberado correlacionados con las tasas de apoptosis (Fig. 4c). Por lo tanto, se requiere que el bucle de amplificación Bid-dependiente para eficiente apoptosis inducida 2DG-ABT. agotamiento de la subasta tuvo un impacto similar en la apoptosis inducida por 10 mM ABT-263, pero el impacto fue menos sobre la apoptosis inducida por STS (datos no mostrados y Fig 4b & amp;. c). Por último, la subasta KO MEF también mostró una sensibilidad reducida a los tratamientos 2DG-ABT (Fig. S5a). Llegamos a la conclusión de que la subasta juega un papel significativo en la apoptosis inducida por 2DG-ABT.
Búsqueda de efectores 2DG
Desde 2DG-ABT la apoptosis inducida por la combinación se Bax /Bak-dependiente, que examinó la efectos de 2DG en Bax y Bak durante el de tres horas de pre-incubación. Algunas células cultivadas en condiciones hipóxicas o en medios de glucosa-agotado durante períodos prolongados, se sensibiliza a la apoptosis [39], [40], [41]. Aunque no existe un marcador universal para la sensibilidad celular a la apoptosis, Bax se conoce a trasladar a la mitocondria antes de la apoptosis y la necrosis en algunos casos [41]. Bax translocación también parece ser un paso distinto, y no necesariamente concurrentes con su activación [42]. Sin embargo, en células HeLa tratadas con 2DG solo, Bax translocación no fue inducida durante al menos 16 horas (Fig. S4A). Por lo tanto, a diferencia de las células cultivadas en un medio de glucosa-agotado, Bax translocación no tiene lugar durante el periodo de pre-incubación 2DG. Además Bax knockout MEFs respondieron al tratamiento 2DG-ABT-combinación (Fig. S5a), lo que sugiere que Bax no puede jugar un papel crítico en el cebado de las células cancerosas por 2DG. Por supuesto, en la ausencia de Bak, Bax está ya sea en las mitocondrias, que juega el papel de Bak, Bax y puede ser activado por un mecanismo diferente cuando está en la mitocondria [43].
Debido 2DG puede afectar glicosilación, 2DG-tratamiento podría inducir estrés ER. De hecho, se observó la expresión del marcador de estrés ER, Grp74, en células HeLa tratadas con 2DG durante 2 a 4 horas (Fig. 5b y Fig. S4b). La hipótesis de que si 2DG está actuando a través del estrés ER, podríamos ser capaces de sensibilizar a las células HeLa de la apoptosis inducida por ABT pre-tratando con otros inductores de estrés ER como thapsigargina. Sin embargo, este no fue el caso (Fig. S4c). Por lo tanto, 2DG parece sensibilizar células tumorales a Bcl-2 antagonistas través de mecanismos que no dependen de la glucosa-agotamiento o estrés ER.
A, el efecto de 2DG en los niveles celulares de ATP. Las cantidades de ATP se midieron durante el cultivo celular HeLa con 2DG 10 mM en presencia de glucosa 25 mM en DMEM suplementado con 10% de suero. b, los perfiles de proteínas durante 2DG incubación de las células HeLa. Se tomaron muestras de células HeLa tratadas como en una, y diversos contenidos de proteína de las proteínas pro y anti-apoptóticos fueron analizados por Western blots. En este experimento, vemos aumentos de Bcl-XL para la primera hora. Cuando se repitió el experimento dos veces, los niveles de Bcl-XL sigue siendo el mismo. c, los niveles de MCL-1 se mantuvo sin cambios durante la apoptosis inducida por 2DG-ABT. PPC-1 células fueron tratadas con 2DG 10 mM durante 6 horas, 1 M ABT-263 durante 3 horas, o 2DG 10 mM durante 6 horas de las cuales las últimas 3 horas, se incubaron con 1 M ABT-263. d, Bak y MCL-1 no co-precipitado en 2DG células tratadas. PPC-1 células se trataron como en c. Bak y MCL-1 se inmunoprecipitaron por anticuerpos específicos conjugados con proteína G-Sepharose y las proteínas co-precipitado se analizaron por Western blots. Los paneles superior izquierda, Bak coprecipitados, paneles superior derecho, MCL-1 co-precipitados, y paneles izquierdo inferior, Proteína G-Sepharose precipita. Por razones técnicas, no pudimos inmunoprecipitar Bcl-XL y analizar su contenido.
2DG interrumpe Bak-MCL-1 asociación, las células de la apoptosis inducida por ABT
cebado
Ha sido informaron que el cultivo de células en medio de glucosa-agotado o en presencia de 2DG por un tiempo prolongado (24 horas o más), podrían disminuir las concentraciones celulares de ATP y diversas células principales de la apoptosis [39], [40], [44].