Extracto
La ineficiencia de las células somáticas pluripotentes inducidas generando (iPS) generó dos modelos en pugna, a saber, el modelo estocástico y el modelo Elite . A pesar de que el primero es más favorable para explicar las ineficiencias inherentes, puede ser falible para extrapolar el mismo modelo de trabajo para la reprogramación de las células cancerosas. De hecho, se sabe que las células tumorales a ser intrínsecamente heterogéneos con respecto a las características distintivas proporcionando así una plataforma adecuada para probar si el proceso de reprogramación de las células cancerosas está sesgada. Aquí, se presenta nuestras observaciones de que todas las células cancerosas pluripotentes inducidas recogidos al azar (IPC) establecido anteriormente no poseen mutaciones conocidas en la población parental. Esta observación inesperada se explica más parsimonioso por el modelo Elite, con lo cual se seleccionaron progenie de tumor putativo de principios durante la inducción de pluripotencia
Visto:. J Lai, CM Kong, Mahalingam D, Xie X, Wang X (2013) Elite modelo para la Generación de células inducidas pluripotentes cáncer (iPC). PLoS ONE 8 (2): e56702. doi: 10.1371 /journal.pone.0056702
Editor: Rajasingh Johnson, Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2012; Aceptado 14 de enero de 2013; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Lai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Ministerio de educación del Fondo de Investigación Académica de nivel 1 subvenciones, R-183-000-259-112 y R-183-000-295-112. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cancer Cells pluripotentes inducidas (IPC) guía
la inducción de las células cancerosas a la pluripotencia (IPC) se ha logrado con éxito en varias células cancerosas y mostró resultados prometedores de atenuar su tumorigenicidad [1] - [5 ]. Sin embargo, dado que cada colonia de células de cáncer pluripotentes establecida se supone que es clonal de una célula de cáncer de los padres, y que la población de células cancerosas de los padres es probable heterogéneo, será de interés punzante para entender si el proceso de reprogramación nuclear está sesgada. Aunque Yamanaka (2009) propone que la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) no es un proceso sesgado (modelo estocástico) [6], es de hecho falible extrapolar este modelo a la generación de CCE, dada la heterogeneidad de las células cancerosas .
intratumoral heterogeneidad
tumores individuales comúnmente se han observado a ser morfológicamente y cariotípicamente heterogénea [7] - [12], de vez en cuando oscureciendo histopathologists para determinar con precisión el grado del tumor para el diagnóstico clínico. Además, un experimento de subclonación clásica realizada por Fidler, I.J. y Kripke, M. L. proporcionado pruebas convincentes de que la heterogeneidad dentro de un tumor existe con respecto a la capacidad metastásica [13]. Por otra parte, el avance agresivo de la secuenciación de próxima generación (NGS) ya ha dado paso a la posibilidad de secuenciación de núcleo único, que propuso un modelo puntuado de la evolución del tumor [14].
Para probar si el modelo estocástico se mantiene en reprogramación de células, una población heterogénea distinguibles debe ser utilizado para observar si cualquier subpoblación es excesivamente representados en las colonias reprogramadas. De hecho, esta condición se ha cumplido por las células cancerosas, que presenta un montaje experimental interesante. Hochedlinger
et al.
(2004) observó que los ratones reprogramadas células de melanoma comparten una configuración cariotipo homogénea, en contraste con su población celular parental que es heterogéneo [15]. De hecho, si el modelo estocástico se mantiene, el cariotipo de la población melanoma reprogramado debe ser heterogénea entre clones. Sin embargo, un parámetro crítico para corroborar plenamente el rechazo del modelo estocástico necesita ser determinado: la proporción de células de los padres que poseen la misma configuración cariotipo como las células reprogramadas. Si esta proporción es grande en el anterior, estadísticamente, hay muy poca base para rechazar el modelo estocástico en este caso. Sin embargo, si la proporción es suficientemente pequeño, de hecho es perceptible para rechazar el modelo estocástico
Aquí, se presenta observaciones similares sobre la reprogramación de cáncer no microcítico de pulmón de células de dos células (NSCLC) -. H358 y H460 . El primero se informó a ser
TP53
homocigotos eliminada [16], el último lleva homocigotos suprime
CDKN2A
[17] y mutante
CDKN2B gratis (datos no publicados). Muy sorprendentemente, se observó que iPC genera a partir de estas células de cáncer, es decir, iPCH358 y iPCH460, ya no albergar ninguna de las deleciones o mutaciones conocidas. Por otra parte,
TP53
ha observado en iPCH358 y
CDKN2A, CDKN2B Hoteles en iPCH460 se observa que es de tipo salvaje. Además, se determinó el parámetro crítico mencionado anteriormente y sugiere el rechazo del modelo estocástico; nuestros resultados experimentales sugieren que la reprogramación de células de cáncer sigue el modelo Elite que ha seleccionado una subpoblación diferente de células a partir de una población de células de cáncer parental heterogéneo.
Materiales y Métodos
líneas y cultivo celular
Las líneas celulares utilizadas en este estudio son humanos IMR90 fetal de fibroblastos de pulmón (no. CCL-186 ATCC), HeLa (ATCC no. CCL-2), adenocarcinoma NCI-H358 (ATCC no. CRL-5807), de células grandes carcinoma NCI-H460 (ATCC no. HTB-177), así como H1 de células madre embrionarias humanas (WiCell no. WA01). NCI-H460 obtenido por el laboratorio del Dr. Koeffler También se adquirió de ATCC. Todas las líneas celulares se mantuvieron en incubador humidificado mantenido a 5% de CO
2 y 37 ° C cultivaron en ATCC recomendado suplementado con 10% FBS. La generación de iPC se describió anteriormente [18]. Brevemente, el IPCS se establecieron a través del protocolo de Yamanaka con una ligera modificación [19]. Lentivirus y retrovirus se produjeron mediante la transfección de células 293T y células Plat-E, respectivamente. Antes de la infección de H358 y H460 células, los virus se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa exento de tensioactivos 0,45 micras de tamaño de poro (Sartorius). IPCS y células madre se cultivaron en ratón irradiado de fibroblastos embrionarios (iMEFs) bañado en DMEM /F12 (Invitrogen) suplementado con 20% de reemplazo Knockout suero (Invitrogen), 1 mM L-glutamina (Invitrogen), 100 mM aminoácidos no esenciales, 100 mM beta mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) y 4 ng /l factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (Invitrogen). Antes de la realización de experimentos sobre los IPCS y células madre, las células se sembraron sobre Matrigel (BD Bioscience) y se mantuvieron en mTeS®1 (StemCell Technologies).
ARN /aislamiento del ADN y la transcripción inversa PCR (RT-PCR)
ARN total fue extraído por medio de RNeasy Mini Kit (Qiagen) y el uso de la transcriptasa inversa de la enzima (Promega), así como oligo dT (Promega) a transcripción inversa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN total fue extraído utilizando DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen).
Análisis de microarrays
de datos de microarrays de expresión génica y la metilación del ADN se obtuvieron de GSE35913. Los análisis se realizaron con R en lumi y entornos methylumi [20]. mapa de calor se ha generado utilizando el paquete gplots.
PCR y secuenciación
TP53
,
CDKN2A
y
CDKN2B
se amplificaron a partir de ADNc y ADN genómico de IMR90 (control positivo), H358, H460 y 10 recogidos al azar colonias iPCH358 y iPCH460. Los cebadores para las amplificaciones se pueden encontrar en la Tabla S1. Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel y se purificaron con QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) y se secuenciaron usando BigDye® Terminator kit de secuenciación de ciclo v3.1 (Applied Biosystems). El producto de PCR de
TP53
amplicón 2 para iPCH358 Col#3 se clonó en pGEM-T vector (Promega) antes de la secuenciación.
Western Blot
enteras lisados celulares de H1, HeLa, H358, H460 y 10 recogidos al azar colonias iPCH358 y iPCH460 cada se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. TP53 anticuerpo primario (Cell Signaling#9282) se utilizó para investigar la presencia de TP53 en H1, HeLa, H358 y todas las colonias iPCH358. CDKN2A anticuerpo primario (Cell Signaling#4824) se utilizó para investigar la presencia de CDKN2A en H1, HeLa, H460 y todas las colonias iPCH460.
Ensayo de dilución en serie
30 ng /l de IMR90 ADN genómico se diluyó en serie 10 veces por /DNA genómico 30 ng l de H460. 1 l de la mezcla se utilizó como molde para la amplificación de
CDKN2B
.
tumores de explantes
Acerca de 2 × 10
se resuspendieron 6 H358 y H460 células en 30% de Matrigel y se inyecta por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes graves combinados (SCID) o ratones desnudos (Tabla S2). Los tumores se dejaron crecer durante tres a cuatro semanas. Los ratones se sacrificaron antes de la escisión de tumores. Los experimentos con animales se realizaron bajo aprobado IACUC (La Universidad Nacional de Singapur Institucional Cuidado de Animales y el empleo) protocolos de 117/09.
propagación de metafase
metafase se propaga de los padres y post-IPC era realizado como se describe por Jeppesen [21]. Brevemente, las células fueron cultivadas a 70% de confluencia y se trataron con 0,1 g /ml de solución demecolcina (Sigma) durante 7 horas. Las células fueron disociadas con tripsina y se trataron con 75 mM de KCl a 37 ° C durante 10 minutos. 5 × 10
3 células (en 100 a 500 l KCl) se centrifugaron a 1.000 rpm a las diapositivas cytocentrifuge durante 5 minutos. a continuación, se lavaron los portaobjetos con KCM (KCl 120 mM, NaCl 20 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,5 mM, 0,1% de Triton X-100) durante 5 minutos, se bloquearon con BSA al 10% (diluido en KCM) para 45 minutos. Esto es seguido por la incubación con anticuerpos primarios para dos horas y luego de fluorescencia conjugado con anticuerpos secundarios durante una hora. Después de lavar los portaobjetos con KCM, los diferenciales se fijaron con formaldehído al 4% durante 15 minutos. Por último, los portaobjetos se lavaron con agua destilada, se secaron al aire y se montaron con medio de montaje que contiene DAPI (Vector Laboratories). Todas las imágenes fueron capturadas utilizando microscopio Olympus Fluoview FV1000. Los anticuerpos primarios utilizados fueron
CENPA gratis (Abcam) y
TRF2 gratis (BD Transducción Laboratories).
números
Adhesión
Todos los datos de secuenciación de
TP53
,
CDKN2A
y
CDKN2B
fueron subidos a GenBank con los números de JQ694043-51and JX391994.
resultados
Presencia de
TP53
observado en iPCH358
El éxito del establecimiento de iPCH358 y iPCH460 en nuestro laboratorio se informó anteriormente [18]. los datos de microarrays de expresión génica revelaron que la detección de
TP53
expresión en H358 fue similar a los niveles de ruido de fondo para las tres repeticiones biológica, pero regulados positivamente en iPCH358, que era totalmente inesperado (Figura 1A). Para descartar artefacto de microarrays,
Hoteles en TP53 10 elegidos al azar colonias iPCH358 fue interrogado por PCR y Western Blot. Para nuestra sorpresa, estos ensayos están unánimemente de acuerdo con los datos de microarrays (Figura 1B). Por otra parte, la secuencia de la región codificante de
TP53 Opiniones y nos pareció que era de tipo salvaje en tres colonias escogidas al azar de iPCH358 (número de acceso GenBank: JQ694049-JQ694051).
(A) log lecturas transformadas intensidad de Illumina HumanHT-12 que indican una disminución significativa (FDR ajustado-P & lt; 0,05) la regulación positiva de
TP53
transcripción en comparación con iPCH358 H358. Esto es inesperado ya que H358 es conocido por ser
TP53
- /-. (B) PCR (panel superior) y Western Blot (panel inferior) ensayos que confirman la expresión de
TP53
en varias colonias escogidas al azar de iPCH358. La región de codificación de
TP53 Hoteles en Col#1, Col y Col#3#11 son de tipo salvaje (número de acceso GenBank: JQ694049-JQ694051). (C) PCR (panel izquierdo) y Western Blot (panel derecho) en ensayos de colonias iPCH358 de & gt; 20 pasajes revelan que el número de pases no es informativo sobre el resultado de estos ensayos. Los resultados de los experimentos llevados a cabo en ocasiones separadas o recortar desde la misma imagen están marcadas por una línea discontinua; imágenes originales se pueden encontrar en Presentación S1 que incluye documentación detallada del número de pases.
CDKN2A
y
CDKN2B
no mutado en iPCH460
este resultado nos ha motivado para determinar si se observó un fenómeno similar en H460. conjuntos de sonda (ADN metilación de microarrays) para el promotor de
CDKN2A gratis (
P16
) y
CDKN2B gratis (
P15
) no fueron capaces de producir fiable señales para todas las réplicas biológicas (n = 3) de H460, que es probablemente debido a mutaciones en los loci interrogado. Sin embargo, lo mismo no puede decirse de iPCH460 (Figura 2A). Para validar esta observación, los pares de cebadores diseñados por Shan,
et al.
(2004), que no va a producir ninguna productos de PCR a partir de DNA genómico plantilla H460, se utilizaron [22]. Sorprendentemente, el mismo par de cebadores fue capaz de producir productos de PCR de 10 colonias escogidas al azar de molde de ADN genómico iPCH460 (Figura 2B). Del mismo modo, los pares de cebadores diseñados para amplificar la región de codificación de ambos
CDKN2A
y
CDKN2B
mRNA no dió ningún productos de PCR de H460, pero los 10 iPCH460 colonias produjo productos de PCR en las mismas condiciones (Figura 2B). Por otra parte, los resultados de secuenciación de las regiones codificantes de ambos
CDKN2A
y
CDKN2B
ARNm de tres elegidos al azar se observaron colonias iPCH460 ser de tipo salvaje (número de acceso GenBank: JQ694043-JQ694048). Además,
CDKN2A Windows que se sabe que está borrado en H460 se expresa y detectables por Western Blot en iPCH460 (Figura 2B). Aunque no hay productos de PCR de amplificación de
CDKN2B Hoteles en H460 se observaron, la proteína se expresa CDKN2B activamente en H460 y permaneció así en iPCH460 (Figura S1). Nuestro laboratorio descubrió que en lugar de toda la deleción del gen, pequeñas mutaciones en los loci putativos circundante de métodos de PCR
Hoteles en CDKN2B H460 prestados establecieron fallen. Esto fue verificado con fuentes independientes H460 células de laboratorio del Dr. Koeffler (Figura S2).
(A) Mapa de calor gama de sondas que indica la metilación (filas) a falta de hibridar con
CDKN2A
y
CDKN2B
promotores en H460 (barras vacías), pero no así en iPCH460. (B) PCR (panel superior) de ensayo que muestra
CDKN2A
y
CDKN2B ¿Cuáles son detectables en iPCH460 mientras que Western Blot (panel inferior) de ensayo que muestra
CDKN2A
, que es homocigótico borrado en H460, es detectable en iPCH460. (C) PCR (panel superior) y Western Blot (panel inferior) en ensayos de colonias iPCH460 de & gt; 20 pasajes revelan que el número de pases no es informativo sobre el resultado de estos ensayos. Los resultados de los experimentos llevados a cabo en ocasiones separadas o recortar desde la misma imagen están marcadas por una línea discontinua; imágenes originales se pueden encontrar en Presentación S1 que incluye documentación detallada del número de pases.
La expresión de los genes suprimidos, persisten a través finales de los pasajes de la IPC colonias
Chin y sus colegas informaron que los primeros pasajes ( ≤ 10) pasajes de colonias iPS se comportaron de manera diferente de sus pasajes finales (& gt; 20 pases) homólogos [23]. En nuestros ensayos anteriores (Figura 1B y la Figura 2B), nuestras muestras fueron predominantemente ≤20 pasajes. Por lo tanto, se procedió a caracterizar si el número de pases modificará el comportamiento expresión de
Hoteles en TP53 iPCH358, así como
CDKN2A
y
CDKN2B Hoteles en iPCH460. Curiosamente, no se observó ningún cambio en el comportamiento expresión en finales de paso iPC (Figura 1C, 2C y Figura Presentación S1).
Un posible factor de confusión a nuestra observación hasta el momento es la presencia de contaminantes en fibroblastos normales éstos cáncer líneas celulares. Por lo tanto, para descartar la posibilidad de que estos iPC resultantes se derivan de la contaminación de los fibroblastos normales, metafase se llevó a cabo en las células de post-IPC (colonias iPC diferenciados de forma espontánea a través de la formación de cuerpos embrioides). Hemos observado que las células de post-IPC permanecen aneuploides y por lo tanto la conclusión de que las colonias establecidas iPC no se derivan de la contaminación de los fibroblastos normales (Figura S3). También se descartó la contaminación celular de células 293T y Plat-E debido a que tanto los lentivirus y retrovirus se filtraron a través de un filtro de 0,45 micras de tamaño de poro antes de infectar H358 y H460. Además, se encontró que los vectores de control GFP no desempeñaron ningún papel en la expresión de los genes mutados en tanto H358 y H460 (Figura 1B y la Figura 2B).
En conjunto, tenemos aquí dos hipótesis complementarias a explicar por qué
TP53
células H358 nulos expresaron TP53 sobre la reprogramación (del mismo modo,
CDKN2A
células H460 nulos expresadas CDKN2A sobre la reprogramación): 1) la reprogramación induce un mecanismo de recuperación de genes; 2) la reprogramación, en una población heterogénea, enriquece una subpoblación de células con diferente estado mutacional que la población mayoritaria. De hecho, la última hipótesis ofrece la explicación más parsimoniosa (véase el debate).
modelo Elite de reprogramación predice nuestras observaciones
Dado que H358 y H460 son heterogéneos con respecto al estado de la mutación de genes, nos preguntamos , "¿Cuál es la probabilidad de que recogieron todo al azar colonias IPCS se derivan de la subpoblación menor sin mutación conocida que caracteriza a la mayoría de la población, si la reprogramación sigue el modelo estocástico" en primer lugar, establecimos un parámetro: la proporción estimada de la subpoblación de menor importancia (por simplicidad, esta subpoblación se refiere como la subpoblación "exento de mutación '). Para estimarlo, IMR90 genoma se diluyó en serie con el genoma H460 y evaluó la eficacia para amplificar
CDKN2B fotos: por PCR. Elegimos para amplificar
CDKN2B
debido a su eficiencia de amplificación en comparación con
CDKN2A
o
TP53 gratis (figura S4). En nuestro ensayo, se calculó que la proporción máxima de las células H460 sin mutante
CDKN2B
es 1:5000 (Figura 3A). Con esta estimación, se calculó la probabilidad de observar todas las colonias escogidas al azar que se derivaron de la subpoblación "exento de mutación». Por tanto iPCH358 y iPCH460, la probabilidad de observar todas las 10 colonias escogidas al azar para ser "libre mutación 'es 1 × 10
-37 (Figura 3B). Además, la proporción más pequeña posible para dar como resultado una probabilidad de 0.05 o más en este modelo de probabilidad es 0,75 (
10C
10 × 0,75
10 × 0,25
0 & gt; 0,05), es decir, si el a partir de la población no tenía menos de tres células libres de la mutación 'de cada cuatro células. Esta proporción no es ni de cerca de 0,25, que es la proporción más pobre estimada a partir de la amplificación menos eficiente de los ensayos de dilución en serie (Figura S4A). Por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula y concluimos que la reprogramación de las células cancerosas sigue el modelo Elite.
(A) ensayo de dilución en serie que muestra que a las 10
3,7 veces la dilución,
Hoteles en CDKN2B IMR90 es detectable a niveles basales. Por lo tanto, a lo sumo 1 en 5000 H460 células son "libres mutación '. (B) El modelo de probabilidad para poner a prueba la hipótesis nula: "Generación de iPC sigue el modelo estocástico". Entrada posterior de los parámetros determinados en (A) sugiere el rechazo del modelo estocástico en la reprogramación de H358 y H460.
Definición de la subpoblación "exento de mutación '
Mientras que la modelo de elite en este experimento reprogramación afirma que el proceso está sesgada hacia la subpoblación "exento de mutación ', el enriquecimiento de esta subpoblación difícil de alcanzar en su estado nativo es técnicamente difícil. Sin embargo, Hochedlinger
et al.
(2004) anteriormente mostró que la configuración cariotipo de la célula de cáncer reprogramado es similar a la del tumor explante [15], lo que sugiere que la inoculación de línea celular de cáncer en ratones SCID ha seleccionado una subpoblación tumorigénicos con la característica citogenética similar a la de la célula de cáncer reprogramado. Además, se señaló que Chang
et al.
(2003) observó que las líneas de células tumorales eran típicamente heterogéneo en contraste con los tumores derivados de explantes [24]. Por lo tanto, cuatro tumores de explantes de H358 y H460 se generaron cada uno (Tabla S2). Sin embargo, sólo un tumor explante de H358 (H358-2) dio detectable
TP53
en su ADN genómico (Figura 4A). Por otra parte, ninguno de los tumores de explantes de H460 produjo detectable
CDKN2A
o
CDKN2B gratis (Figura 4B). Por lo tanto, la inoculación de la línea celular de cáncer en ratones SCID emula débilmente la selectividad de la reprogramación nuclear.
(A) Uno de cada cuatro H358 explante tumoral generada espectáculo presencia de
TP53
en el genoma, lo que indica el enriquecimiento de la subpoblación difícil de alcanzar 'mutación libre'. se observaron (B) Ninguno de los tumores de explantes H460 para ser enriquecido para la subpoblación "exento de mutación». se utilizó ADN genómico de cola de los ratones SCID en el control de ratones contaminación de ADN en los tumores de explantes. Información de los tumores de explantes se puede encontrar en la Tabla S2.
Discusión
La reprogramación discrimina población heterogénea de células cancerosas
Los datos presentados aquí indican que los difiere de estado de mutación genética entre la población de células cancerosas de los padres y la contraparte reprogramado. Aunque no disponemos de datos experimentales para demostrar la homogeneidad o heterogeneidad de H358 y H460 poblaciones de células cancerosas directamente, con el fin de explicar esta observación intrigante, hemos propuesto dos hipótesis complementarias: 1) La población de partida es homogénea y por lo tanto la reprogramación nuclear inadvertidamente corrige cierta mutaciones; 2) La población inicial es heterogénea y la reprogramación nuclear enriquece una pequeña subpoblación. La primera hipótesis depende de un supuesto por el que una célula es capaz de recuperar un gen mutado. Sin embargo, es evidente que ese mecanismo no existe porque establecimiento de células iPS a partir de
p53, Terc
y
Ink4 /Arf
ronda de ratón fibroblastos de embriones [25], [26], no vio la recuperación de estos genes. Por otra parte, la segunda hipótesis asume un escenario en el que la reprogramación discrimina dentro de la población de células de cáncer heterogénea de diferentes grados de insulto genética. Este supuesto se parece mucho a la observación Hochedlinger y colegas hecho por el que el cariotipo heterogénea del melanoma ratones se convierte en post-reprogramación homogénea [15]. Por lo tanto, la segunda hipótesis es el favorito para explicar la discrepancia entre el estado de la mutación en las células antes y después de la reprogramación.
Si las poblaciones de partida de H358 y H460 son heterogéneas, y existe una subpoblación "exento de mutación ' , ¿por qué la PCR o el sur-Blot [16] no detectar estos genes? Proponemos que la proporción de subpoblación "exento de mutación 'es demasiado pequeño para proporcionar suficiente plantilla para amplificaciones por PCR para producir productos suficientes para la detección de bromuro de etidio. De hecho, hemos demostrado esto en la dilución de IMR90 ADN genómico de al menos 5000 veces enmascarar la detección de
CDKN2B
amplicón. Sobre la base de este ensayo, se estima que hay a lo sumo una célula de "libre de la mutación" por cada 5000 H358 o H460 células. Por lo tanto, para alcanzar iPC deriva de esta subpoblación difícil de alcanzar "exento de mutación 'es muy poco probable, si el proceso de reprogramación es estocástico. Por lo tanto, proponemos que la reprogramación de las células cancerosas sigue el modelo Elite.
progenie de tumores tempranos pueden definir las competencias hacia reprogramación
Dado que el proceso de reprogramación discrimina una población heterogénea de células cancerosas, hemos intentado delinear la características subyacentes en las células cancerosas que determina la competencia hacia la reprogramación. Estudios previos han señalado que activan factores de reprogramación varios mecanismos de senescencia y supresor de tumor (es decir,
TP53
y
CDKN2A
) que actúan como barreras hacia la reprogramación [25] - [27]. Sorprendentemente, a pesar de las supresiones de genes somáticos de estas barreras en mayoría de las células H358 y H460, ninguna de las colonias escogidas al azar fueron nulo para estos genes. Además, se observó que el potencial tumorigénico (determinado por la inoculación de ratones SCID) emula débilmente el enriquecimiento por el proceso de reprogramación. Por otra parte, nuestros datos sugieren que los derivados de estos principios son iPC progenie putativos de la población tumoral.
trinquete de Muller afirma que las mutaciones en organismos que se reproducen asexualmente son irreversibles y se acumula a través de generaciones [28]. Del mismo modo, las células cancerosas se reproducen 'a través de la mitosis y genéticos daños son irreversibles y se acumulan sobre múltiples ciclos celulares. En otras palabras, esto implica que los derivados de iPCH358 y iPCH460 son células de las primeras etapas de la tumorigénesis. Por otra parte, dado que los genes mutados en cuestión (
TP53
,
CDKN2A
y
CDKN2B
) son importantes para la integridad del genoma, es probable que estos "mutación células -free 'tienen una extensión inferior de insultos a nivel genético. Paradójicamente, sin embargo, estas células son aneuploides y muestran más amplia difusión de recuentos cromosómicos que sus células parentales (figura S2), corroborando plausible la teoría de que la aneuploidía promueve la inestabilidad genómica [29]. Coincidiendo con esta teoría, Navin y sus colegas observaron asimismo que la copia de amplificación número de
KRAS
, un oncogén importante, es exclusivo de la población de tumores aneuploides [14]. Por lo tanto, se propone una hipótesis que guía la reprogramación que selecciona las células cancerosas de las progenies anteriores de la tumorigénesis, en los insultos a nivel genético son bajos pero demasiada aneuploides (Figura 5). De hecho, la integridad genética mantenida por
TP53
y
CDKN2A
, entre otros, puede ser necesario con el fin de preservar la pluripotencia circuitos estrictamente regulados para asegurar el éxito reprogramación [30] - [32]. Además de explicar por qué iPC generados a partir de H358 y H460 no eran
TP53
nulo y
CDKN2A
nula, respectivamente, esto puede responder a una pregunta intrigante planteado por Zhang y sus colegas en cuanto a cómo una célula del sarcoma reprogramado con múltiples daños a nivel genético aún podría lograr pluripotencia [5]. Los futuros experimentos tales como el flujo-FISH (citometría de flujo de fluorescencia
In situ
hibridación) para ordenar la subpoblación "exento de mutación 'seguida de la secuenciación núcleo único proporcionará pruebas para corroborar o falsificar esta hipótesis. . Además, otros estudios sobre el genoma del tumor explante H358-2 serán de interés para hacer frente a esta hipótesis
A partir de nuestros datos, se observó que los derivados de nuestro iPC: 1) carecían de mutación genética clave (s) ; 2) aneuploides; 3) subpoblación menor. Teniendo en cuenta estas características observadas, es seguro asumir que estos derivados fueron los primeros progenie de la población tumoral (representado en verde). Por lo tanto, la aneuploidía es, posiblemente, antes de la primera adquirió mutaciones críticas para conducir mutaciones ventajosas (demarcadas en gris), en consonancia con la observación de Navin et al (2011). Junto con el entendimiento de que los circuitos de regulación pluripotencia está estrechamente regulada y complejo, menos insultos a nivel genético en las células (círculos que carecen de "X" roja) garantizarán la integridad de los circuitos y de ahí establecimiento exitoso de IPC (representado en color morado) que puede diferenciarse a múltiples linajes (representado en azul).
observaciones finales
en este estudio, hemos utilizado las líneas celulares de cáncer que son intrínsecamente heterogénea, lo que nos permite observar qué variable ( s) los sesgos hacia la generación exitosa de iPC. De hecho, nuestras observaciones que se han seleccionado las subpoblaciones "libres de la mutación 'contra la mayoría sugieren que la reprogramación de las células cancerosas sigue el modelo Elite. Esta conclusión no falsifique la propuesta anterior de que la generación de iPS sigue el modelo estocástico, en virtud de que las células somáticas normales y células de cáncer son diferentes. Además, nuestros datos conduce a una hipótesis que guía que se seleccionaron los primeros progenie putativos de la población del tumor durante el proceso de reprogramación. elucidación futuro de las características asociadas a la subpoblación "exento de mutación 'sugerido por nuestros datos sería de gran utilidad en la comprensión aún más la reprogramación de proceso de las células de cáncer de desentrañar el subyacente heterogénea maquillaje de los tumores, que será clave en la lucha contra el cáncer estrategias terapéuticas.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Expresión de la proteína CDKN2B en H460 y iPCH460.
CDKN2B
está mutado en H460 que procese todos los ensayos de PCR a fallar, pero no perturban su expresión de la proteína
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figura S2.
Presencia de
Hoteles en CDKN2B H460 células de nuestro laboratorio y el laboratorio del Dr. Koeffler (KLAB). (A) proteína CDKN2B se puede detectar en células H460 de nuestro laboratorio y Klab. (B) un primer pares alternativos que hemos diseñado (Tabla S1) fueron capaces de amplificar
CDKN2B
tanto en el ADN genómico y cDNA de H460. Hemos secuenciado la región codificante de este gen y nos pareció que era de tipo salvaje (número de acceso GenBank: JX391994)
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Figura S3.
propagación de metafase muestra que después de la iPC (piPCs) son aneuploides. (A) metafase para untar representativos de H358, H460, piPCH358 y piPCH460. (B) Tabla resumen de los cargos de los cromosomas a partir de al menos ocho diferenciales independientes por muestra. DAPI manchadas cromosomas - azul; verde - TRF2; . Rojo - CENPA
doi: 10.1371 /journal.pone.0056702.s003 gratis (TIF)
figura S4. página 2 veces dilución en serie de IMR90 genoma para la amplificación de
TP53
y
CDKN2A
. (A) IMR90 ADN genómico fue 2 veces diluyó en serie con el ADN genómico H358 como molde para amplificar
TP53
. Hemos observado que a una dilución de 4 veces, banda de PCR correspondientes a
TP53
es ligeramente visible. Esto nos da una estimación de que por cada cuatro células H358, uno es "libre mutación '. (B) De manera similar, IMR90 ADN genómico fue 2 veces diluido en serie pero en su lugar con H460 ADN genómico. eficiencia de amplificación de
CDKN2A
fue asimismo en peligro por productos no específicos; a una dilución de 32 veces, la banda de PCR fue ligeramente apreciable dando así un estimado que por cada 32 células H460, uno es "libre mutación '. Independientemente, el análisis de cualquiera de estos parámetros en el modelo de probabilidad en la Figura 3 dará lugar a una probabilidad mucho menor que 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0056702.s004
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Presentación S1 .
imágenes originales utilizadas en la Figura 1 y la Figura 2.
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Tabla S1.
Secuencias de los Cebadores
doi: 10.1371. /journal.pone.0056702.s006 gratis (XLSX)
Tabla S2. Los datos de explantes tumorales
doi: 10.1371. /Journal.pone.0056702.s007 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Chiou Mee Kong es un beneficiario de becas de investigación de Yong Loo Lin Facultad de Medicina, Nuhs, Universidad Nacional de Singapur, Singapur. Agradecemos al Dr. Patrick Tan por los comentarios interesantes, así como el Dr. Phillip Koeffler para su especie de regalo de las células H460.