Extracto
Soricidin es un péptido de ácido 54-amino encuentra en el veneno paralizante de la musaraña de cola corta septentrional (
Blarina brevicauda
) y se ha encontrado para inhibir el potencial receptor transitorio Vallinoid de tipo 6 (TRPV6) los canales de calcio. Nos informan de que dos péptidos más cortos, SOR-C13 y C27-SOR, derivados de la C-terminal de soricidin, son antagonistas de alta afinidad de canales TRPV6 humanos que están regulados en marcha en varios tipos de cáncer. Aquí, se presenta métodos de imagen molecular que demuestran la
in vivo
potencial diagnóstico de la SOR-C13 y C27-SOR en los sitios diana tumorales en ratones portadores de tumores de ovario o de próstata. Nuestros resultados sugieren que estos nuevos péptidos pueden proporcionar una vía para suministrar reactivos de diagnóstico y terapéuticos directamente a los tumores TRPV6-rico y, como tal, tiene aplicaciones potenciales para una gama de carcinomas incluyendo ovario, mama, tiroides, próstata y colon, así como determinado de leucemia y linfomas
Visto:. Bowen CV, Debay D, Ewart SA, Gallant P, S Gormley, Ilenchuk TT, et al. (2013)
En Vivo
detección de tumores humanos TRPV6-Rich con anti-cáncer péptidos derivados de Soricidin. PLoS ONE 8 (3): e58866. doi: 10.1371 /journal.pone.0058866
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 2 de noviembre de 2012; Aceptó 7 de febrero de 2013; Publicado: 15 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Bowen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa de Asistencia para la Investigación Industrial del Consejo Superior de Investigaciones Científicas programa (IRAP) (http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/irap/index.html) y Canadá Agencia de Oportunidades del Atlántico (ACOA) (http: //www.acoa-apeca.gc.ca/eng/Pages/Home.aspx) del Gobierno de Canadá. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SG, TTI, TL, CR y JMS son empleados de Soricimed Biopharma Inc. En el momento de la realización e interpretación de los resultados, HSE era un empleado de la NRC. Novaceutics Consulting tiene ninguna afiliación con Soricimed. JMS tiene las siguientes patentes de declarar: US 7.119.168 para los péptidos y métodos de tratamiento del cáncer, publicado 10 de octubre 2006; De Estados Unidos 7.273.850 para métodos de inhibición de la absorción de calcio por una célula de cáncer para reducir la proliferación celular mediante la administración de todo o parte del péptido y los métodos de tratamiento de cáncer, donde las células de cáncer muestran una mayor expresión de TRPV6, publicado 25 de septiembre 2007; y US 8.211.857 para las reclamaciones dirigidas a un péptido que consiste en SOR-C13 o C27-SOR, para el tratamiento del cáncer, concedida el 3 de julio de 2012. JMS también declara patentes pendientes emitidas en: US 13 /526.045 para la continuación de los Estados Unidos 12 /866.397 (US emitido patente 8.211.857) para los métodos en la inhibición de la absorción de calcio por las células cancerosas para reducir la proliferación y métodos de tratamiento de cáncer de células; Canadá (CA 2718949), Europa (UE 09.721.272,4), Japón (JP 2011 a 500.019), y Hong Kong (11.106.921,8) para la aplicación del PCT para la fase nacional dirigida hacia péptido que consiste en SOR-C13 y C27-SOR; Canadá 2.544.467 para las composiciones farmacéuticas de péptidos dirigida y tratamientos médicos; Estados Unidos 12 /824.935 para los péptidos de unión a TRPV6-que comprenden todo o parte de SOR-C27 conjugado con una biomolécula. JMS declara solicitudes PCT en la fase nacional de Canadá (CA 2766272), Europa (UE 10.791.109,1), Hong Kong (número de serie 12110289.5), Japón (JP 2012-516450), México (MX /a /2012/000086) y Brasil (PI1012676 -9). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
En América del Norte, 1 de cada 70 mujeres desarrollará cáncer de ovario durante su vida. A pesar de los avances recientes con la identificación, el cáncer de ovario sigue siendo difícil de detectar y por lo general se identifica sólo después de que ha hecho metástasis a otras partes del cuerpo [1]. El pronóstico para la detección de las primeras etapas es de entre 70% a las tasas de supervivencia del 100%; Sin embargo, el 70% de los casos se diagnostican en estadios avanzados, donde la tasa de supervivencia a 5 años es sólo entre el 15% y el 25% [2]. Actualmente, no existe ninguna prueba de detección no invasivo fiable para el cáncer de ovario.
Las concentraciones de calcio son regulados cuidadosamente dentro de los compartimentos celulares a través de la acción integrada de varios canales de la membrana y bombas. Durante los últimos años, algunos miembros de una familia de canales de entrada de iones de calcio, denominados canales TRPV, han surgido como posibles biomarcadores de cáncer que pueden resultar útiles para el desarrollo de una mejor detección de tumores y /o terapia dirigida de fármacos. En 1999 se informó de nuevos canales de calcio en los túbulos renales de conejo [3] y de rata tracto digestivo [4] denomina CEAC1 y CaT1, respectivamente, que se parecía a la del receptor de la capsaicina (receptor vaniloide, VR1) [5]. CEAC1, CaT1 y VR1 resultó estar relacionada con el canal de calcio potencial receptor transitorio (TRP) en
Drosophila
que media fotorrecepción [6] - [8]. Hasta la fecha, al menos 30 homólogos de los canales TRP se han identificado en los mamíferos, que se dividen en seis subfamilias principales: TRPA (anquirina), TRPC (canónica), TRPM (melastatina), TRPML (mucolipina), TRPP (policistina) y TRPV (vaniloide ) [9] - [11]. El TRPV sub-familia se compone de seis miembros nombrados TRPV1 a TRPV6. Los primeros cuatro canales están estrechamente relacionados y tienen papeles en varias entradas de detección, incluyendo estiramiento, el calor, la acidez, los estímulos nocivos (nocicepción) y el dolor [9], [11]. Estos canales presentan selectividades relativamente bajas de iones de calcio (p
Ca /P
Na ~ 1 ~ 15 a). Por el contrario, TRPV5 y TRPV6 son altamente selectivo de iones de calcio (P
Ca /P
Na~100). Ambos de estos canales se expresan en las membranas apicales de diversos tejidos, incluyendo riñón, intestino, páncreas y próstata [12] - [14]. Por ejemplo, TRPV5 se expresa en los túbulos distales del riñón donde funciona en la reabsorción de iones de calcio de la orina pre-[12]; TRPV6 es predominante en el tracto gastrointestinal en los que está implicado en la entrada apical de calcio [14]
TRPV6 está implicada en el desarrollo y progresión del tumor [15] - [18].. La proteína TRPV6 es sobre-expresa en carcinomas de cáncer de ovario y otro como el de mama, colon, próstata y tiroides [14]. TRPV6 mRNA es elevada en diversas líneas celulares de tumor, incluyendo los de colon, leucemia humana y de próstata [19] - [23]. En el cáncer de próstata, los niveles de mRNA TRPV6 se correlacionan positivamente con la progresión del tumor y la agresividad como se indica por la puntuación de Gleason, el estadio patológico y metástasis extra-prostática [20], [24]. De hecho, los tumores de próstata TRPV6-positivas tienen mal pronóstico debido a una propensión a invadir los tejidos circundantes [25].
El vínculo entre el crecimiento del tumor y la sobre expresión de TRPV6 puede implicar la potenciación de la proliferación celular dependiente de calcio y la inhibición de la apoptosis. Schwarz et al. [26] mostró que dosis bajas de econazol, un bloqueador de flujo de entrada de calcio capacitiva, la reducción de las dos señales de flujo de entrada de calcio y la proliferación celular en células HEK-293 transfectadas con TRPV6. En la línea celular de cáncer de próstata LNCaP, sobre regulación de TRPV6 aumenta la supervivencia y la proliferación celular mientras retardando la apoptosis a través de un mecanismo que parece implicar la activación del factor nuclear de células T activadas (NFAT) factor de transcripción [27]; reducción de TRPV6 con la proliferación siRNA reducida y aumento de la apoptosis. En las células de cáncer de mama, el tamoxifeno reduce la expresión de TRPV6 y la señalización de calcio, un efecto que puede explicar en parte los efectos anticancerígenos de este estrógeno antagonista [28]. Por otra parte, desmontables de TRPV6 con siRNA mejoró la eficacia de tamoxifeno. Así como se sugiere en una publicación reciente, la inhibición del canal de TRPV6 ofrece una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de tumores que sobre-expresan el canal TRPV6 [29].
Soricidin (número de acceso P0C2P6) es un péptido paralizante novela aislado de las glándulas salivares submaxilares de la musaraña de cola corta septentrional (
Blarina brevicauda
, uno de los mamíferos más comunes en la costa atlántica de Canadá) y, reportadas para inhibir la absorción de calcio
a través de canales
TRPV6 [ ,,,0],30]. Posteriormente, dos secuencias de péptido de la C-terminal de soricidin (SOR-C13 y C27-SOR; Tabla 1) se muestran para unir TRPV6 en células de cáncer de ovario con alta afinidad [31]. Aquí, describimos la propiedades de SOR-C13 y C27-SOR y la capacidad de estos péptidos para apuntar tumores de ovario humanos en un modelo de xenoinjerto de ratón de unión TRPV6. Mediante la conjugación de los péptidos con un colorante fluorescente o un agente de contraste de imágenes por resonancia magnética (IRM), hemos sido capaces de controlar la bioacumulación y la biodistribución de los péptidos
in vivo
, tumores de formación de imágenes expresar finalmente TRPV6. Estos hallazgos nuevas vías de diagnóstico y /o terapéuticos abierto para la detección y el tratamiento de tumores de ovario y otros tumores potencialmente TRPV6 ricos incluyendo los de mama, colon, próstata y tiroides temprano, así como cierta leucemia de y linfomas.
Materiales y Métodos
Los péptidos
Las secuencias de soricidin, SOR-C13 y C27-SOR péptidos se muestran en la Tabla 1. Los péptidos fueron preparados por CanPeptide (Montreal, Canadá ) por síntesis en fase sólida. SOR-C13 y SOR-C27 mostraron la masa molecular esperado por espectrometría de masas de tiempo de vuelo (H
+ H
+ de 1566.42 y 2958.02) con la pureza del péptido (por HPLC) del 96,9% y 96,8%, respectivamente . El contenido de péptido del polvo blanco liofilizado (sal trifluoroacetato) fue 83,5% y 65,2%. concentraciones de péptido posteriores se calcula en base al péptido de base libre.
Solución estructura de RMN de SOR-C27
Preparación de la muestra.
La resonancia magnética nuclear (RMN) fue datos espectroscópicos adquirida para determinar las características estructurales conformacionales del péptido SOR-C27 en diversas condiciones. Una solución de reserva (muestra#1) de 10 mM SOR-C27 se preparó de 90/10 H
2O /D
2O con 50 mM de tampón de fosfato de potasio a pH 6,6. A partir de la muestra#1, se prepararon tres muestras adicionales:#2) solución madre con NaCl 200 mM,#3) solución madre con dodecylphosphocholine 100 mM (DPC) y#4) solución madre se diluyó hasta 2 mM con dodecilsulfato de sodio 100 mM (SDS ). Muestra#1 fue adquirido a temperaturas que van desde 274 a la 308 K. El péptido era completamente soluble en todas las soluciones y en todas las condiciones.
espectroscopía de RMN.
Para las muestras 1-3
los conjuntos de datos de 1H RMN se recogieron en un espectrómetro DRX-500 (Bruker BioSpin AG, Fällanden, Suiza) que opera a 500,13 MHz utilizando una sonda de 1 mm OD H [CN]. Para la muestra 4,
1 H (e indirectamente
13C y
15N) conjuntos de datos de RMN se recogieron en un espectrómetro AVANCEIII 700 que funciona a 700,13 MHz con un 1,71 mm de diámetro exterior HC [N] sonda.
desplazamientos químicos de 1H fueron referenciados a 2,2-dimetil-2-silapentane-5-sulfonato a través de la resonancia del agua calibrado a cada temperatura.
13C y
desplazamientos químicos de 15N se hace referencia indirecta a través del
referenciación 1H.
Para la determinación estructural con las muestras 1 y 4, sensible a la fase 2D
1H-
1H conjuntos de datos NOESY (120, 250 y 400 ms tiempo de mezcla) y
1H-
TOCSY 1H (MLEV17; 120 ms tiempo de mezcla, la muestra 4 DIPSI-2; 90 ms de tiempo de mezcla) los conjuntos de datos se registraron con un pre -saturation o un pulso suave para la supresión de agua. Los conjuntos de datos se recogieron con resolución de 1024 × 380 puntos complejos, apodizada con un 70 ° desplazado función de ventana-campana-sine cuadrado en ambas dimensiones, cero llenado y lineal predijo en la dimensión indirecta para dar un espectro 2D definitivo de 2048 × 2048 puntos reales.
Los cálculos estructurales.
Los espectros de RMN se analizaron y posiciones de los picos y los volúmenes determinó utilizando el software Sparky 3.110 operar en un sistema de PC con Linux. Para la determinación estructural, todos los sistemas de espines se identificaron a través de cambios químicos y modelos de picos característica cruz TOCSY. cadena lateral y hueso resonancias de Asn7, THR9, Phe17 y Val23 fueron asignados fácilmente a partir de sus patrones de TOCSY únicas y cada residuo sólo se produce una vez en la secuencia. A partir de estos residuos, las asignaciones específicas de secuencia de la cadena principal y la cadena lateral resonancias se determinaron usando métodos estándar,
es decir
a partir de los residuos fácilmente asignados, residuos adyacentes se determinaron de forma secuencial siguiendo el H
α
i
-H
N
i + 1