Extracto
No-convencional I MIC moléculas no interactúan con el TCR, pero con NKG2D, un C lectina de tipo receptor de activatory presente en la mayoría de NK, γδ y CD8
+ delta gamma células T. Aunque esta interacción es fundamental en el desencadenamiento /calibración de la actividad citotóxica de estas células, el alcance real de su
in vivo
participación, en el hombre, en la infección, cáncer o autoinmunidad, necesita una evaluación adicional. Este último ha cobrado impulso junto con la expansión periférica informado de CD4
+ CD28
-NKG2D
+ células T en la artritis reumatoide (AR). En primer lugar, iniciamos extender este informe a una cohorte más amplia no sólo de los pacientes con AR, sino también a los afectados por el lupus eritematoso sistémico (LES) y el síndrome de Sjögren (SS). En la AR y SS, esta observación inicial se ensayó adicionalmente en los tejidos diana: la articulación y las glándulas salivales, respectivamente. En conclusión, ya pesar de la expansión de vez en cuando e indiscriminado de la subpoblación de células T previamente incriminado, no hay correlación se pudo observar entre el CD4
+ CD28
-NKG2D
+ y autoinmunidad. Por otra parte,
In situ
, la presencia de NKG2D coincidía con la de las células CD8
+, pero no el de las células CD4 + T
. En paralelo, una exploración de tejido corporal total de ambos
MICA
y
MICB
transcripción muestra claramente que a pesar de las presunciones originales, y con la excepción del sistema nervioso central, ambos genes son ampliamente transcritas y por lo tanto posiblemente traducido y unida a la membrana. La extensión de este análisis a una serie de tumores humanos no reveló un patrón coherente de expresión vs. tejidos normales. En conjunto, estos datos cuestionan los supuestos anteriores, la correlación de una expresión específica de tejido /inducción de
MIC Hoteles en relevancia a los procesos autoinmunes o tumorales
Visto:. Schrambach S, M Ardizzone, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)
En Vivo
patrón de expresión de MICA y MICB y su relevancia para la autoinmunidad y el cáncer. PLoS ONE 2 (6): E518. doi: 10.1371 /journal.pone.0000518
Editor Académico: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública-Santé, Luxemburgo
Recibido: 17 Abril, 2007; Aceptado: May 7, 2007; Publicado: 13 Junio 2007
Derechos de Autor © 2007 Schrambach et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad Louis Pasteur, los Hospitales Universitarios de Estrasburgo, la Asociación Francesa del Gougerot Sjögren et des síndromes segundos, la Ligue contre le Cancer, la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (ARC).
Compitiendo intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
citotóxicos CD8
+ y ayudante de CD4
+ αβ células T reconocen convencional cargado con péptido Complejo Mayor de Histocompatibilidad (. MHC) de clase I y II moléculas respectivamente [1]. Mientras que el primero interacción conduce a la eliminación de la infectadas por virus o las células diana tumorized, este último, ayuda a amplificar /regulan principalmente la respuesta inmune humoral contra exo o autoantígenos [2], [3]. Aunque esta definición de libro de texto de la respuesta inmune adaptativa es la vida real, claras implicaciones funcionales /disfuncionales de estas interacciones, en relación con la segunda, innatas, actores de la inmunidad, está lejos de ser simple. Esta es quizás mejor ejemplificada en las reacciones autoinmunes, donde dependiendo de la enfermedad, la especie (humanos o de ratón en esencia) y el modelo experimental, los diferentes componentes del sistema inmune han sido puestos secuencialmente en el primer plano, que lleva a la suposición lógica que prácticamente todos los actores del sistema inmunológico están involucrados, ya sea en el desencadenamiento y /o perpetuación de la enfermedad [4] - [6].
a diferencia de las moléculas MHC-I convencionales mencionados anteriormente, las moléculas MIC [7], [8] no interactúan con el TCR
per se
pero lo hacen con NKG2D, un receptor activatory lectina tipo C expresado en NK, γδ y CD8
+ delta gamma células T [9], [10 ]. Esta interacción se ha demostrado que pasar por encima de la señal inhibidora proporcionada por Killer inhibitoria receptores (KIR) y /o moléculas /NKG2A /B CD94 que detectan la presencia de respectivamente HLA-ABC y -E en las células diana. Mientras que en las células T, las funciones de NKG2D como una molécula co-estimuladora [11], se pueden activar las células NK, así como los linfocitos T IL-15 activada por intraepitelial de una manera independiente TCR [12]. compromiso MIC-NKG2D se cree que es por consiguiente crítico en la eliminación de las células y /o tumores [13], [14] infectadas. Si esta interacción también es relevante en la autoinmunidad es una cuestión de énfasis más reciente [15].
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune arquetípico y como tal se reanuda nuestros conocimientos actuales y retos en relación con la autoinmunidad [16 ]. Un gran cuerpo de trabajo ha dado paso a numerosas hipótesis con respecto a la iniciación y perpetuación de la enfermedad. A través del tiempo, las células T o células B han sido reconocidos como los actores principales de la enfermedad. La auto-antígeno específicos de tejido o sistémica putativo (s) en el hombre sigue siendo difícil de alcanzar, en contraste con varios modelos animales dirigida naturales o transgénicos /gen donde varios antígenos propios se han reconocido para poder iniciar la enfermedad [17]. Uno de los últimos actores putativos en la patogénesis de la AR ha sido transmitido como una población discreta de CD4
+ células T que carecen de la molécula co-estimuladora CD28 y se ha informado que se ampliará en la AR [18], [19]. Investigaciones más recientes informaron de que estas células T expresan, en lugar de CD28, la NKG2D descrito anteriormente [15]. El siguiente trabajo se inició en este supuesto y como objetivo de replicar por primera vez estos datos iniciales en una más grande, mejor definido, cohorte de pacientes con AR. Que se amplió a otras dos enfermedades autoinmunes: lupus eritematoso sistémico (LES) y el síndrome de Sjögren (SS). En la AR y SS afligidos pacientes que también era posible para sondear
MIC
nivel de expresión en tejidos diana, tanto en el ARN mensajero y el nivel de proteínas. Por otra parte en la sangre periférica, además de la medición de la presencia de CD4
+ NKG2D
+ células per se, sino que también establece en analizar la β repertorio TCR de estas células en ciertos individuos (cf.
infra
). Por último, y por primera vez, un órgano integral /tejido scan permitió descubrir el hecho de que a diferencia de lo que se suponía inicialmente y desde entonces ha entrado en los libros de texto [20], y con la excepción del sistema nervioso central,
MICA Opiniones y
MICB
fueron transcritas en prácticamente todos los tejidos /órganos examinados. La mayor extensión de este análisis a las muestras tumorized ayudó a darle una mejor comprensión de
MIC
transcripción tanto en la salud y la enfermedad.
Materiales y Métodos
Pacientes y controles
25 voluntarios sanos, así como a 75 pacientes con AR (n = 35; 1988 American College of Rheumatology criterios) [21], con LES (n = 15; revisado de 1997 del American College of Rheumatology criterios) [22] y SS ( n = 25; 2002 americano y criterios europeos) [23] se incluyeron en este estudio (Tabla 1). Todas las muestras se obtuvieron de voluntarios que asisten a la clínica de reumatología de los Hospitales Universitarios de Estrasburgo y se recogieron durante los procedimientos de rutina clínica (diagnóstico /pronóstico /terapéutica) recetados por uno de los co-autores, el Dr. J. Sibilia. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada individuo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y en la legislación francesa, en las que se requiere la aprobación de un comité de ética en este caso. Todos los pacientes y controles no estaban relacionados.
Citometría de Flujo
A continuación, conjugado de diversas maneras (PE, FITC, PerCP, Cy5 o APC) se utilizaron anticuerpos en tres y -four- citometría de flujo de color: el anti CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, - γδ TCR. El repertorio de células T se analizó mediante el siguiente PE y FITC conjugado anti-TCRV
β (1, 2, 3, 4, 5,1, 5,2, 5,3, 7,1, 7,2, 8, 9, 11, 12, 13.1, 13.2 , 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21,3, 22, 23) (Beckman Coulter) anticuerpos. controles de isotipo se utilizaron para cada tinción. expresión NKG2D se analizó utilizando ON72 conjugado con PE (Beckman Coulter) y 1D11 (BD PharMingen), ya sea conjugado con PE o biotinilado; este último detectado por estreptavidina-PC5 (BD PharMingen). Se estudiaron las células de sangre periférica, ya sea no fraccionada o después de la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll. Las células mononucleares se aislaron también por Ficoll centrifugación en gradiente de densidad de los fluidos articulares obtenidos a partir de 1 RA, 3 osteoartritis y 2 pacientes con artritis no autoinmunes. La citometría de flujo se realizó en sistemas ya sea un BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) o FC 500 (Beckman Coulter).
La inmunohistoquímica
Tejido sinovial se obtuvieron de los pacientes AR 1 1 codo y la osteoartritis en el momento de la artroplastia de rodilla. tejidos de las glándulas salivales se obtuvieron de 4 SS y 1 voluntario sano durante la rinoplastia. Por inmunohistoquímica, 4 micras secciones de criostato se hicieron a partir de tejidos sinoviales o glándulas salivales y se congelaron en nitrógeno líquido. secciones sucesivas se fijaron en acetona, se secaron al aire, se rehidrataron en PBS, y se bloquearon con peróxido de hidrógeno 0,3%. Las secciones fueron incubadas con anticuerpos anti: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), -CD4, -CD8 para 1 h a temperatura ambiente. La unión se detectó utilizando biotinilado secundario anti-IgG y estreptavidina peroxidasa. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina de Harris y se montaron con Glycergel.
Northern Blot
Las transferencias de ARNm humano se adquirieron de Invitrogen (Invitrogen Territorios del Norte). Las membranas se hibridaron secuencialmente con
MICA, β-actina
y
β
2-microglobulina (β
2 m)
ADNc, se somete posteriormente a lavados de astringencia altas (64 ° C , 0,1 x SSC, 0,1% SDS), antes de la exposición a Kodak Xomat (Eastman Kodak, Rochester, NY) para respectivamente 8 h a -70 ° C, 1 h a temperatura ambiente y 4 h a -70 ° C, respectivamente.
cuantitativa en tiempo real PCR biopsias de glándulas salivales
accesorios se obtuvieron de un conjunto independiente de 20 (19 mujeres y un hombre, con un promedio de 51 años, la mediana de 52) de los pacientes con SS primario. Se obtuvieron glándulas salivales de 5 pacientes sometidos a cirugía orofacial (por causas independientes) durante los procedimientos y sirvieron como controles mientras tanto la patología, así como la historia del paciente eliminan más signos de autoinmunidad en estos individuos de control. El ARN celular total se aisló por TRIzol LS® (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN extraído se determinó mediante electroforesis en gel. 1 g de RNA total se sometió a transcripción inversa utilizando oligo-dT y el sistema ImProm-II ™ transcripción inversa (Promega), siguiendo las recomendaciones del fabricante. PCR en tiempo real cuantitativa se realizó en un ABI PRISM 7000 usando los siguientes oligonucleótidos y sondas TaqMan®. Los niveles de expresión de
MICA
y
MICB
fueron calibrados usando el de la casa de mantenimiento de 18S ARN detectado utilizando la siguiente cebadores directos e inversos respectivamente 3'-5-CGGCTACCACATCCAAGGAA revierten ', 3'-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 'y SYBR Green.
MICA
transcripciones fueron detectados utilizando el siguiente avance, oligonucleótidos y la sonda TaqMan revertir respectivamente 3'-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 ', 3'-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5' y 3 'ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5' y los de
MICB
con F 3'-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 ', 3'-R CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5', 3'-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 'en el mismo orden que anteriormente. la regulación positiva positiva de
MIC
la transcripción se comprobó en las células HeLa crecido sin tratar o calor conmocionado como se describe anteriormente [24].
Resultados y Discusión
A pesar del hecho de que la inicial " glitch "que desencadenan enfermedades autoinmunes en la artritis general y reumatoide en particular, sigue siendo su mayor parte enigmática, décadas de investigación han reunido varios escenarios posibles que, al empezar, diversas vías y cascadas tienden a perpetuar más o menos un auto-reactiva (T y /o conducido) fuerza de las células B, que finalmente llevan a la patología sintomática [6], [25] - [28]. Una de las últimas subpoblaciones de células T incriminado como tal, es la fracción de CD4
+ células T auxiliares que expresan el receptor NKG2D de activación, pero carentes de la molécula co-estimuladora CD28 [15]. NKG2D, un trans-membrana homodímero de superficie de tipo II consiste en un dominio extracelular de lectina de tipo C, seguido de una transmembrana y una cola citoplásmica corta desprovisto de cualquier función de señalización particular. La molécula de señales de hecho (al menos en el hombre) a través de la interacción con el DAP10 trans-membrana de proteína adaptadora (DAP10 y DAP12 en mus, dependiendo de la isoforma NKG2D) [29]. NKG2D reconoce una variedad de moléculas alejadas no convencional MHC de clase I; en el hombre MIC [7] y RAET1 [30] (ULBP) [31] y en el ratón Rae1 y H60 [9], [29]. El objetivo inicial de este trabajo fue avanzar en el conocimiento del papel potencial de la interacción MIC-NKG2D en la autoinmunidad en el hombre. Para que tal sea el caso, (al menos) dos condiciones se deben cumplir: (1) en primer lugar y lo ideal, órganos diana de autoinmunidad (por lo tanto, potencialmente todos los órganos y /o tejidos), no debe expresar MIC en el estado basal, en Es decir, el MIC se deben sólo se detectaron en los tejidos enfermos o estados patológicos. + células T (2) en segundo lugar que sistémica y /o infiltrado en el tejido-autorreactivas CD4
expresan NKG2D y de hecho se expandieron en dicha enfermedad; un preludio a su potencial relevancia funcional.
Una vez más y, aunque la definición de libros de texto de expresión MIC es la de cuasi-restricciones a los enterocitos [20], [24], la realidad dista mucho de ser tan tajante y esto reduccionista vista simplemente no refleja la realidad (véase más adelante). De hecho, los primeros anticuerpos monoclonales generados contra MICA probaron para teñir preferentemente, si no casi exclusivamente, enterocitos humanos, con la notable excepción de epitelio tímico [24]. Esto estaba en línea con blottings Northern iniciales destacando la transcripción del gen, no en líneas celulares (transformadas) de linaje lymphohematopoeitic, pero en los de origen epitelial /fibroblástica [7]. Por otra parte, los experimentos de transferencia de genes han demostrado claramente, una y otra vez, que no importa el linaje de la línea de célula receptora, si el transgén (bajo un promotor heterelogous que es) se transcribe correctamente, la proteína MIC es invariablemente sintetizado y alcances superficie de la célula [24], [32] - [37], por lo tanto, con exclusión de cualquier "elemento de restricción (s)" celular tales como los precedentemente demostrado ser necesarios para la expresión adecuada de la superficie de otro no clásico MHC de clase I por ejemplo genes secuencia de señal de HLA clásica deriva péptidos en el caso de HLA-E /Qa-1 en el hombre /ratón [38] o péptidos formilados-N derivadas de bacterias en el caso de H2-M3 en ratón [39]. De ahí la pregunta fundamental es en la que el tejido /órgano
MICA
y
MICB ¿Cuáles son transcritas en efecto, en cuyo caso se podría presumir con confianza su consecuente expresión en la superficie. Tan trivial como podría parecer a esta pregunta, casi 15 años desde su identificación [7], ningún análisis sistemático de la transcripción
MIC
genes se ha publicado hasta la fecha. Aquí presentamos un primer tipo de análisis. De hecho extensa transferencia de Northern de un gran número de tejidos y órganos humanos indica claramente que, en contraste con las afirmaciones anteriores, tanto
MICA
y
MICB ¿Cuáles son ampliamente transcritas. Como se observa en la Figura 1 (panel superior), estas transcripciones se encuentran en prácticamente todos los órganos examinados con la notable excepción del sistema nervioso central (la parte superior, el panel de extrema derecha, Figura 1). De hecho, esto se correlaciona perfectamente con el patrón de transcripción de MHC clásica loci-I, como se evidencia mediante el sondeo las mismas membranas con un
β
2m
sonda de ADNc (paneles intermedios, figura 1). Prestar más atención a
MIC
patrón de expresión, se observa que incluso un órgano "lleno" con células lymphohematopoeitic - el bazo - no está desprovista de
MICA
transcripciones y contiene
MICB
transcripciones en cantidades iguales como a otros órganos (pulmón, riñón ...). Una vez más, la clara ausencia de
MIC
del sistema nervioso central es notable, y de hecho inesperado, ya que es paralelo claramente que de genes clásicos MHC-I (
β
2m
panel de ) y esto a pesar del hecho de que al menos las regiones promotoras inmediatas de estos loci (
MIC Opiniones y convencional
MHC-I
) no muestran ninguna homología de secuencia evidente [24]. Por último, y con el fin de cubrir los terrenos tanto como sea posible con respecto a
MIC
transcripción, hemos ampliado esta transcripcional cartografía de tejidos sanos para tumorized. Se analizaron un número de tumores de diversos tipos de tejidos y se compara con los tejidos adyacentes sanos (Figura 2). Una vez más,
MIC
transcripción fue ampliamente presentes, y hay un patrón general de inducción /represión se pudo observar en los tumores frente a los tejidos sanos (Figura 2), a diferencia precedentemente sugerido [13]. Por lo tanto, en general,
MIC
se transcribe en prácticamente todos los tejidos examinados con la notable excepción del sistema nervioso central. El patrón general en los tumores es indicativa de un patrón de transcripción "suelto". Por tanto, la razón por la que algunos anticuerpos anti-MIC, aparentemente, han mostrado para representar un patrón de expresión restringido a tejidos debe estar en otra parte, por ejemplo, polimorfismo genético [40], varios patrones de glicosilación ligada a N (MICA tiene 8 sitios potenciales de glicosilación ligada a N) [7], [24].
El panel representa el ARN procedente de los principales órganos humanos. Cada panel contiene RNA de pulmón como un estándar interno. El panel superior se hibridó con
MICA
ADNc. La diferencia de longitud transcripción de
MICA
y
MICB
se debe a una previamente documentada 3'UT mayor en
MICB
ARNm [50]. El panel del medio muestra la expresión de
β
2 m
, indicativo de la β
2 m de cota expresión de MHC-I convencional. Por último, el
β-actina
transcripción actúa como control de carga. Para una explicación más detallada véase el texto principal.
La misma disposición que en la Figura 1 se aplica, pero esta vez las manchas contiene carriles tumorales y de control (tejido adyacente libre de enfermedad).
Una vez establecido que
MIC
se transcribe y por lo tanto potencialmente traducir en cualquier /todos los tejidos, fijamos ahora a examinar la pertinencia de
MIC
e indirectamente la de expresión MIC-NKG2D en auto inmunidad. Para tanto, se seleccionaron tres enfermedades autoinmunes prototípicos, a causa de su importancia inherente a la comprensión humana auto-inmunidad [25], [41], [42], el interés médico /clínico, así como el hecho de que, con respecto a la AR, datos previos habían identificado MIC-CD4
+ NKG2D
+ interacción en la etiología de la enfermedad /patogénesis [15]
Para este análisis la siguiente cohorte de individuos estaban reunidos:. 25 controles sanos y 75 pacientes que sufren de los trastornos auto-inmunes mencionadas anteriormente, es decir 35 RA, 15 LES y 25 SS (Tabla 1). Entre ellas un subgrupo que incluye 10 individuos de control, 10 RA, 2 SS y 2 pacientes con LES fueron ampliamente immunophenotyped con un amplio panel de anticuerpos, en diversas combinaciones, con el fin de medir los patrones internos antes de esfuerzo máximo de la escala (ver Materiales y Métodos para la la lista completa de los anticuerpos). De esta manera se investigaron diversas poblaciones de células T, B y NK. No se observó diferencia significativa entre el paciente y las poblaciones de control (datos no mostrados). Más específicamente, la distribución de NKG2D en la superficie de αβ CD8
+ y los linfocitos γδ T así como las células NK, ensayadas usando preparaciones totales de células de sangre periférica, no reveló, como era de esperar, ninguna diferencia notable entre los pacientes y controles. Entonces nos dirigimos nuestra atención a la población de interés, es decir CD4
+ NKG2D
+ células T (Figura 3). La relación de la expresión de NKG2D en CD4
se encontró + T células para ser igualmente similar en todos los voluntarios sanos (0,8 a 8,5%, con una media del 2,7%, la desviación estándar 2), toda la AR (0,4 a 9,7%, con una media del 2,1%, desviación estándar 1,9), todos SLE (0,3 a 7,8%, con una media del 2,4%, la desviación estándar 2) y todos los pacientes SS (0-36,2%, la media de 4%, la desviación estándar 7,6) (Figura 4). Dos pacientes con SS se encontró que de hecho tener una mayor expresión de NKG2D en su CD4
+ células T (18,6% y 36,2%, respectivamente) (véase más adelante para su posterior análisis) (Figuras 4 y 3.
NB
: Figura La figura 3 representa de hecho uno de estos pacientes). Debido a que un estudio precedente, que había encontrado significativamente más altos de CD4
+ NKG2D
+ células T en la AR frente a los controles, había utilizado otro contra NKG2D mAb, es decir 1D11 (BD PharMingen) (frente a los anteriores ON72 clon , Beckman Coulter), también a prueba este anticuerpo. Comparación de la tinción de NKG2D, ya sea con anticuerpos de CD4
+ células T en 3 voluntarios sanos, 4 AR, LES 1 y 2 SS no revelaron ninguna diferencia significativa (diferencia media: 0,21; desviación estándar: 0,24). Por otra parte también comparamos este immunophenotyping comparando la sangre periférica total frente a las células mononucleares, utilizando mAb ON72. Esto se evaluó en voluntarios sanos 1, 2 y 2 RA SS sin aludir a cualquier diferencia (diferencia media: 0,33; desviación estándar: 0,52). Por último y con el fin de validar completamente la configuración, la estabilidad intra-individual de la expresión de NKG2D en CD4
+ linfocitos T se verificó con el tiempo en 2 voluntarios sanos en días respectivamente 1/14 y 1/120, de 1 RA paciente en d1 /d120 y en los 2 pacientes con SS en d1 /d150. se observaron en diferentes subpoblaciones de linfocitos CD4 y especialmente aquellos
+ células T que expresan NKG2D:;: no hay diferencias notables (0,5 Media Desviación estándar 0,31). Teniendo en cuenta que el mismo informe mencionado anteriormente había insinuado a la inducción de la expresión de NKG2D en CD4
+ T células tras la adjunción de TNFa (
in vitro
), en virtud de los pacientes con AR anti-TNFa terapia no se incluyeron en este estudio, a pesar del hecho de que un análisis preliminar de tres pacientes con AR tratados con infliximab no mostró ninguna diferencia significativa en el nivel de expresión de NKG2D en CD4 linfocitos
+ T (datos no mostrados). Por lo tanto, en general, no pudimos encontrar ninguna diferencia significativa entre los CD4
+ NKGD
+ población en los controles sanos en comparación con los pacientes con AR, SS o con LES. Por último, la Figura 5 da una imagen completa de la
+ reserva de células T CD4 con respecto a NKG2D y /o la presencia o ausencia de CD28.
En este ejemplo, tomado de uno de los dos pacientes con SS (Sra XET) que alberga una particularmente elevada proporción de CD4
+ NKG2D
+ células T (36,2%) ilustra la metodología utilizada con el fin de enumerar estas células en todos los individuos (pacientes y controles) se incluye en este trabajo durante una rutina 50 000 eventos de análisis.
Esta figura representa la proporción de CD4
+ NKG2D
+ células T dentro del conjunto total de CD4 periférica en el control, AR, LES y los individuos SS. La variabilidad en los pacientes con SS se debe a 2 personas a las que representan una proporción inusualmente alta (véase el texto principal para la explicación). Ninguna de las diferencias es significativo según lo evaluado por el texto de Wilcoxon: p = 0,1658 para los controles frente a RA; p = 0,9547 para los controles contra el LES y p = 0,5012 para los controles frente a SS.
Esta figura más global, se analiza la relación de CD4
+ células T que albergan o no CD28 y /o NKG2D, o no. Ninguna de las diferencias es estadísticamente significativa.
El final de destino en la AR es la articulación, nos propusimos analizar la próxima CD4
+ NKG2D
+ niveles de expresión dentro de las células mononucleares de el líquido articular cosechado después de la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll de un codo de la AR y 5 controles (tres osteoartritis de rodilla y dos con artritis de rodilla autoinmune no) de los pacientes. De nuevo hay una diferencia significativa en la expresión de NKG2D en CD4
+ células T se destacó entre los controles y RA en fluidos de las articulaciones, y entre la sangre periférica y líquido de la articulación en un paciente RA (datos no presentados). Para explorar más a fondo el significado de la expresión de NKG2D en CD4
+ y CD8
+ células T
In situ
, tejidos sinoviales se analizaron por inmunohistoquímica con el fin de cuantificar la presencia de CD4, NKG2D, CD8 y MICA /B células que expresan. Esto se llevó a cabo en una RA (artroplastia de cadera) y un control de la osteoartritis (cirugía de rodilla) individual. En el control individual NKG2D se encontró que se expresa en el 3,8% de la sangre periférica CD4
+ linfocitos T frente a 2,5% de los que se encuentran en el líquido articular. A medida que este individuo no realizó ninguna inflamación intra-articular activa, no fue sorprendente no observar una infiltración notable de CD4
+, CD8
+ +/- NKG2D
+ linfocitos (no se encontró ninguna expresión MIC ya sea en este paciente). En el paciente con AR, NKG2D se expresó en el 0,9% del circulante CD4
+ células T (sin líquido de la articulación podrían ser recuperados desde la cadera RA someterse a la cirugía). El tejido infiltrarse en la AR (Figura 6A) era principalmente CD4
+ (Figura 6B) mientras que la expresión CD8 era menos importante (Figura 6C). expresión de NKG2D era claramente exclusiva de CD4 y más en línea con la de CD8 (Figura 6D) (NB .: éstas son distintas secciones de tejido, por lo tanto, no hay superposición es significativa). Finalmente, MICA /B se expresa en células fibroblásticas /epiteliales y no en los infiltrados inflamatorios (Figura 7A y B).
(A) color de la mancha por tinción con hematoxilina-eosina. El análisis inmunohistoquímico utilizando (B) CD4 (C) CD8 y (D) anticuerpos NKG2D. El infiltrado es claramente de origen linfocitario con una mayoría de células T CD4.
El análisis inmunohistoquímico de (A) (B) sinovitis RA y un (C) (D) SS glándula salival accesorio manchado con una anticuerpo monoclonal anti-MICA. MIC expresión es claramente de naturaleza epitelial /fibroblástica en ambos tejidos /órganos.
A pesar de nuestros resultados en la AR están en desacuerdo con algunos de los datos publicados anteriormente, una aclaración de este último podría ayudar a poner nuestros resultados y de hecho toda la cuestión en perspectiva. Antes de hacer tal, que claramente no se replicarán la obra por Groh y col. con respecto a la expansión de las células CD4
+ NKG2D
+ en la AR a pesar de que hicimos nuestro mejor esfuerzo para seguir con su protocolo, por ejemplo, utilizando los mismos anticuerpos anti-NKG2D etc. [15]. Puede haber una explicación racional para tal, un ser falta de información detallada con respecto a su población de pacientes, por ejemplo bajo la fracción anti-TNFa terapia, etc. Un análisis más profundo de la literatura muestra que de hecho la expansión de este tiempo, CD4
+ CD28
- células T, no es tan patognomónica de la AR, ya que podría haber parecido en el inicio [18]. De hecho, un análisis más reciente de una cohorte independiente de los pacientes muestra claramente que la mitad de los pacientes con AR (n = 94) (según los autores aquellas que están libres de la AR nodular y síndrome seco) no tuvieron un aumento significativo en su CD4 periférica
+ CD28
- reserva de células T con respecto a los controles (véase la figura 1 [43] por último Saez-BORDERÍAS et al traer un nuevo giro a la cuestión, por informar de la inducción de CD4
+ NKG2D..
+ células T en respuesta a citomegalovirus humano (HCMV), que conduce a prever el hecho de que el anterior informó pueden necesitar ser re-evaluado a la luz de la situación serológica HCMV de los pacientes y los controles expansiones. Esto también abre la avenida para esta subpoblación de reconocer, más allá de HCMV, otros agentes microbianos, un punto no se ha probado en estudios anteriores (y presentes) [44].
para sondear la importancia potencial de las células CD4
+ NKG2D
+ células T en la inmunopatología de la SS, la inmunohistoquímica se realizó sobre los tejidos de las glándulas salivales el fin de detectar CD4, NKG2D, CD8 y MICA /B. Tres tejidos de las glándulas salivales de las SS fueron obtenidas por biopsia durante la hospitalización, mientras que se obtuvo un control de tejido de las glándulas salivales de un individuo por lo demás sanos voluntarios durante la rinoplastia por razones independientes. En el individuo de control, la inmunohistoquímica no reveló la presencia de cualesquiera números notables de CD4, CD8 y /o NKG2D células de acuerdo con la ausencia de cualquier infiltrado inflamatorio expresar; esto era igualmente el caso para la expresión MICA /B (datos no presentados). En SS, NKG2D se expresó en respectivamente 0,4, 0,9, 2% de la sangre periférica CD4
+ linfocitos T. La inmunohistoquímica (Figura 8A), focalizada en los infiltrados inflamatorios, mostró que en los 3 pacientes, las células T CD4 eran más frecuente, de nuevo mutuamente exclusiva con CD8 tinción (Figura 8B y C). La cantidad y el reparto de la expresión de NKG2D parecía ser comparable a la de CD8 pero no la de CD4 (Figura 8D, C y B). Por otra parte, se detectó expresión MICA /B en las células epiteliales de los canales glandulares pero no en infiltrados linfoides (Figura 7C y D).
(A) color de la mancha por tinción con hematoxilina-eosina. El análisis inmunohistoquímico utilizando (B) CD4 (C) CD8 y (D) anticuerpos NKG2D. El infiltrado es claramente de origen linfocitario con una mayoría de células T CD4.
En cuanto a la SS, dada la expresión de los genes documentado MIC y proteínas en las células epiteliales [24], supuesta implicación de los diferentes virus en SS fisiopatología [45] y la relativa facilidad para acceder al tejido diana, es decir, las glándulas salivales; que tuvo como objetivo cuantificar el nivel de
MIC
transcripción en sana y SS afligidos glándulas salivales. Esto se logró mediante el análisis en tiempo real PCR cuantitativa de
MICA
y
MICB
transcripciones. Antes de hacer tal en el ARN de la glándula, la metodología se validó en células HeLa; se ha documentado que ser portadores de
MICA /MICB
transcripciones en niveles significativos, cuando éstos están regulados por el estrés celular, por ejemplo, choque térmico [7], [24]. El choque térmico se realizó tal como se describe anteriormente [24]. Con respecto a
MICA
hubo una inducción 8x después de 15 minutos y 3,5 × para
MICB
. Después de 60 minutos de la inducción se mantuvo en 4,5 × para
MICA
y 2 × para
MICB
. Típicas parcelas QRT-PCR se muestran en la Figura 9A y B. Dentro de los tejidos de las glándulas salivales, aunque la expresión muestra una clara variabilidad interindividual, se pudo observar ninguna diferencia significativa entre los pacientes y los controles (Figura 10A y B).
MICA gratis (A) y
MICB perfil de (B) tal como se analizó la expresión por RT-qPCR. ▪ Las muestras 15 minutos después de choque térmico, las muestras ♦ 60 minutos después del choque térmico, ▴ controles no tratados.
nivel de expresión relativa de
MICA gratis (A) y
MICB
(B) en los pacientes con síndrome de Sjögren en comparación con los controles sanos. Las diferencias entre los pacientes y los controles no son significativas según la evaluación de Mann-Whitney
T
prueba (α = 0,27 para
MICA Opiniones y α = 0,53 para
MICB
).
Como se mencionó anteriormente, entre los 75 pacientes analizados, dos pacientes con SS (Sra XET y XRL; en este orden en este párrafo), efectivamente presentar una tasa particularmente alta de CD4
+ NKG2D linfocitos
+ T en sangre periférica (respectivamente 36,2% y 18,6%).