Extracto
La desregulación de la expresión de los genes miARN puede contribuir a la tumorigénesis y otra fisiopatología asociada con el cáncer. Usando TLDA, la expresión de 762 miRNAs se comprobó en 18 pares de tejidos de control con el cáncer bucal adyacente gíngivo. La expresión de miRNAs desregulados significativamente fue validado en el cáncer y se examina en dos tipos de tejidos precáncer (leucoplasia y liquen plano) mediante ensayos TaqMan-primers específicos. implicaciones biológicas de estos miRNAs se evaluaron bioinformatically. La expresión de
hsa-miR-1293, hsa-miR-31, hsa-miR-31 *
y
hsa-miR-7
fueron significativamente hasta reguladas y los de
HSA -miR-206, hsa-miR-204
y
HSA-miR-133a
fueron significativamente las reguladas en todas las muestras de cáncer. Expresión de sólo el
HSA-mir
-31 fue significativamente hasta reguladas en la leucoplasia pero ninguno en las muestras de liquen plano. Análisis de la heterogeneidad de expresión dividido 18 muestras de cáncer en grupos de 13 y 5 muestras y reveló que la expresión de miRNAs 30 (incluyendo los 7 miRNAs anteriormente mencionados), fue desregulado significativamente en el grupo de 13 muestras. A partir de la minería de bases de datos y análisis de vías, se observó que estos miRNAs pueden dirigirse significativamente muchos de los genes presentes en diferentes vías relacionadas con el cáncer, tales como "proteoglicanos en el cáncer",
PI3K-AKT
etc., que juegan un papel importante en la expresión características moleculares de diferentes de cáncer. La expresión de
hsa-miR-31
fue significativamente hasta reguladas en ambos tejidos de cáncer y la leucoplasia y, por lo tanto, puede ser uno de los marcadores moleculares de leucoplasia que puede avanzar hasta gíngivo-cáncer bucal.
Visto: De Sarkar N, Roy R, Mitra JK, Ghose S, A Chakraborty, Pablo RR, et al. (2014) En busca de una miARN Bio-Marcador: Un Enfoque Pista A la vuelta de gingivo cáncer bucal a dos diferentes tipos de lesiones precancerosas. PLoS ONE 9 (8): e104839. doi: 10.1371 /journal.pone.0104839
Editor: Ratna Ray B., Universidad de Saint Louis, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Abril, 2014; Aceptado: July 15, 2014; Publicado: 15 de agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 De Sarkar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Todos los fondos provinieron del Departamento de Biotechnolgy, Gobierno de la India, y el Instituto de Estadística de la India al Prof. Bidyut Roy. El donante no tiene ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis, decisión de publicar y preparación de manuscritos
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
gingivo carcinoma de células escamosas bucal (GBSCC) es uno de los (~ 60%) cánceres más prevalentes en la cavidad oral, especialmente entre los consumidores de tabaco en la India. El sistema entero de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas se coloca como el quinto cáncer más común en todo el mundo [1]. Sin embargo, cáncer de cabeza y cuello comprende ~ 24% del total de cánceres en la India como se registra en un hospital terciario, Tata Memorial Centre, Mumbai y sobre ~13.5% de ellos son de la cavidad oral [2]. Cinco años la tasa de supervivencia (~ 50%) de los pacientes que sufren de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas no ha mejorado mucho, incluso después de una intensa investigación durante los últimos 15 años, por lo que, la detección temprana es todavía una cuestión clave para una mejor supervivencia [3].
Desde 1993, miARN ha surgido como uno de los reguladores biológicos más importantes, que desempeñan un papel importante en el control y ajuste fino de la expresión de su objetivo (ARNm) [4] - [9]. En los últimos años, se ha demostrado que microRNAs (miRNAs) también están implicados en la tumorigénesis humana y pueden actuar ya sea como moléculas tumorigénicas /oncogénico o anti-tumorigénicos. Por lo tanto, se está haciendo una nueva capa en los acontecimientos moleculares en el cáncer humano. estudios de expresión génica revelaron que muchos miRNAs están desreguladas en diferentes tipos de cáncer y estudios funcionales aclararon que los miRNAs están involucrados en varios procesos moleculares y biológicos que conducen a la tumorigénesis [10] - [12]. Por lo tanto, además de diferentes escalas de variabilidad en términos de nuevas mutaciones en el genoma o los antecedentes genéticos de los pacientes (es decir, de germen de línea de mutación), la variabilidad en la expresión de diferentes miRNAs es también un aspecto importante para la investigación. Con esta creencia, se estudió la expresión de la desregulación de 762 miRNAs en GBSCC y comprobado también si el mismo tipo de desregulación de expresión se pudo observar en leucoplasia y liquen plano precancerosas tejidos de la cavidad oral. Se han hecho esfuerzos para entender cómo estos miRNAs pueden estar implicados en el cáncer utilizando la vía de análisis e información de Lit
e
turas y bases de datos.
Materiales y Métodos
Este estudio fue aprobado por el "comité de Revisión para la protección del riesgo de la investigación en seres humanos, Instituto indio de estadística". Todos los individuos de este estudio han proporcionado consentimientos informados por escrito para publicar los detalles del caso. Todos los participantes firmaron un cuestionario que contiene la demografía, el hábito tabáquico y una declaración que describe que él /ella no tiene ninguna objeción para el uso de muestras de sangre y tejidos en este estudio y está participando en este estudio voluntariamente. pacientes no relacionados que sufren de cáncer (n = 18), el liquen plano (n = 12) y la leucoplasia (n = 18) fueron considerados para este estudio de Guru Instituto Nanak de Ciencia Investigación Dental y, Panihati, Calcuta, (Tabla 1, Tabla 2 , Tabla 3). Un golpe de tejido de cáncer de sitio /precáncer y otro golpe de sitio adyacente "clínicamente" normales (al menos 1.5 pulgadas de distancia del borde de la lesión) la biopsia se realizó por el patólogo oral. Una porción de los tejidos de biopsia se utiliza para la confirmación histopatológica y la parte restante de los tejidos se mantuvieron por separado en "ARN Más tarde" a -80 ° C y utilizarse dentro de 2 meses.
ARN aislamiento y TLDA ensayo
El aislamiento de ARN se realizó utilizando el kit mirVana (Life Technologies, EE.UU.). cuantificación de ARN rendimiento hecho por Nano gota y la integridad se comprobó con Bioanalyzer (Agilent Kit Nano RNA6000) de Agilient, respectivamente. número RIN de corte fue elegido como ≥6.9. ensayo de expresión paralela de 762 miRNAs se realizó mediante TLDA-A (V2) y TLDA-B tarjeta (V3) en el sistema de PCR en tiempo real RÁPIDO 7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.) utilizando TLDA bloque plano [13]. El análisis primario se realizó utilizando SDS y datos de asistencia (Life Technologies, EE.UU.) paquetes de software para obtener la expresión en términos de valores Ct, Ct y ΔΔCt donde Ct = Ciclos en la que la cantidad de producto de PCR alcanza un umbral definido, Ct = Ct
de un miARN en el tejido canceroso - Ct
de la media geométrica de la expresión de 3 miRNAs endógenos de control más estables de ese tejido y ΔΔCt = Ct
de un miARN en el tejido canceroso - Ct
de ese miARN en el tejido de control . De los 762 miRNAs ensayadas, cinco eran candidatos para los controles endógenos. Sin embargo, sobre la base de su estabilidad de la expresión en todas las muestras, RNU-48, RNU-44 y U6 /MMU-6 fueron seleccionados como controles endógenos. Para obtener Ct como la medida normalizada de expresión de un miARN en ambos tejidos de cáncer /precáncer y de control, la expresión de todos los miRNAs en los tejidos se normalizó independientemente utilizando la media geométrica de la expresión de 3 miRNAs endógenos de control seleccionados en el mismo tejido. Ct valor inferior a 40 solamente se consideraron para su posterior análisis.
Análisis
La poda de datos.
Si se observó expresión de miRNA particular, para estar presente en al menos 9- de 18 tejidos emparejados con cáncer de lo normal, sólo entonces, se ha considerado para su posterior análisis aguas abajo. Anotación de TLDA V2 de ensayo (A-tarjeta) y V3 (B-tarjeta) sigue liberación-14 miRBase [13] - [14]. Ahora, se consideraron los datos de expresión de estos miRNAs para su posterior análisis cuya anotación sigue siendo válido en miRBase liberar-19 [15] - [16]. De esta manera la expresión de 531 miRNAs se consideró para el análisis de aguas abajo posterior.
Análisis estadístico.
Inicialmente, una muestra de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba para los datos de expresión de los 531 genes se realizado de forma independiente con el fin de comprobar la normalidad de los valores de expresión diferencial a través de todas las muestras de [(Zi = {(Ci-Ni) - (media C- media N)}, por lo Zp = ΣZi /SD Z, se hizo prueba de KS en Zp; Ci: i
º valor Ct de la muestra del cáncer, Ni: i
º valor Ct de la muestra normal] y, finalmente, se encontró que la expresión que se distribuye normalmente es de señalar que los valores de Ct ya están transformados log, así. ., no más lejos log transformación se realiza con este conjunto de datos de expresión seguida de la prueba de normalidad, se realizó una prueba t pareada cola [(Ci-ni) & gt; 1 /& lt; 1]. la hipótesis nula de uno de cola bifurcada t pareada -test fue "una expresión de miRNA particular no es mayor que 2 veces arriba /abajo regulado" Así que, naturalmente, la hipótesis alternativa era "la expresión de los genes miARN particular es & gt;. 2 veces arriba /abajo regulado. Prueba para la regulación (menor prueba de una cola) se lleva a cabo si la mediana de ΔΔCt de un miARN particular es menor que cero. Del mismo modo, la prueba de baja regulación se lleva a cabo si la mediana de ΔΔCt de un miARN en particular es más que cero. Múltiples correcciones de pruebas, utilizando el método de Benjamini-Hochberg se llevó a cabo a nivel de significación del 5% [17] y corregido cortaron valor de p fue 0,00065.
Análisis de conglomerados de miRNAs expresó en tejidos de cáncer.
método de la agrupación K-mediana se utilizó para la totalidad de los datos establecidos podados para ver si las variaciones de expresión del genoma amplia miARN entre individuos eran lo suficientemente grandes para dividir de forma fiable las muestras en una serie de grupos sub. Por esta agrupación, distancia métrica elegido fue euclidiana. Puesto que, la expresión de muchos miRNAs estaba ausente en nuestro conjunto de datos, que estaba creando situación de "datos Ausente". Esta situación es conocida por el sesgo de la agrupación si se adoptó la agrupación K-dologías medios más populares. Por lo tanto, la elección de la agrupación fue K-mediana. El número de grupos fiables, los datos formarían, se determinó utilizando el método de "codo".
ensayo TaqMan.
La expresión de miRNAs significativamente desregulados, que se detectó en tejidos de cáncer por el método TLDA , también fueron validados en la mismos tejidos de cáncer y se examinaron en leucoplasia y liquen plano tejidos de ensayo TaqMan (Fast real 7900HT sistema de PCR en tiempo, Applied Biosystems, EE.UU.). Las sondas y cebadores fueron suministrados por Invitrogen Ltd y la India, se recuperaron datos como "factor de cambio" en comparación con los controles adyacentes. Normalización de la expresión de cada gen en cada muestra se hizo usando la media geométrica de los mismos 3 controles endógenos, a saber.
NUR-44, NUR-48
y
MMU-6
, para obtener el valor de ese ΔΔCt miARN.
Resultados
perfil de expresión en tejidos de cáncer por TLDA
Los datos de expresión de 762 miRNAs se ensayaron por este método, pero después de la poda de datos, se utilizaron los datos de expresión de miRNAs 531 (incluidos los 5 controles endógenos) para otros análisis de aguas abajo (archivo S1). Durante la prueba estadística, se consideró al menos 2 veces el cambio de expresión en el tejido canceroso en comparación con su tejido y controles emparejados para ser el banco marca de desregulación expresión. De este modo, se encontró expresión de miRNAs 7 para ser desregulado significativamente después de la corrección de pruebas múltiples y todos estos siete miRNAs tenido & gt; 4 veces desregulación medio de expresión (es decir, ya sea hacia arriba o hacia abajo-regulación). Validación de la expresión mediante el ensayo TaqMan específicos miARN también volvió a confirmar la desregulación de expresión en tejidos de cáncer, aunque se disminuyeron los factores de cambio en comparación con el resultado TLDA (Tabla 4). La diferencia en la sensibilidad de estos métodos experimentales basados en dos RT-PCR (TLDA y de ensayo TaqMan miR-específica), junto con el hecho de que estos dos conjuntos de experimentos se llevaron a cabo en dos momentos diferentes, podrían ser los factores que influyen para la diferencia en grados desregulación de la expresión de miRNAs. ubicaciones relativas de estos miRNAs 7, junto con otros genes miARN en diferentes cromosomas reveló que
HSA-miR-133a
y
HSA CD -
MIR-7
están situados en dos ( Chr 18 y 20 Chr) y tres cromosomas (Chr 9, Chr 15 y Chr 19), respectivamente (Figura 1a). A continuación, se realizaron ensayos de sólo miRNAs maduros, por lo tanto, la expresión de
HSA-miR-133a
y
HSA CD -
MIR-7 podría ser
suma acumulada de todos madura formas de respectivos miRNAs. Entre estos 7 miRNAs, la expresión de miRNAs 4 a saber.
hsa-miR-1293, hsa-miR-31, hsa-miR-31 *
y
hsa-miR-7
fueron significativamente hasta reguladas y los de 3 miRNAs a saber.
hsa-miR-206, miR-HSA-204
y
HSA-miR-133a
se regula de manera significativa en las muestras de cáncer (Tabla 4). mapa de calor se construyó según dos maneras sin supervisión agrupación jerárquica. Por lo tanto, todos los miRNAs-regulado encuentran agrupados en la parte superior de la trama mientras que todos los miRNAs hasta reguladas agrupados en la parte inferior (Figura 1b). Se mostró valores de expresión (es decir ΔΔCt) en comparación con control adyacente, así como número de muestras que proporcionan los datos de expresión. La expresión de
HSA-mir-1293
se obtuvo de muestras pareadas 9 de control del cáncer, pero 6 de ellos tuvieron valores ΔΔCt ≤-2 y 3 muestras restantes presentaron valores ΔΔCt entre 0 y -2. Así, por
HSA-mir-1293
, todos estos 9 muestras tenían valores con signo ΔΔCt -ve, lo que significa; cada vez que se obtuvo la expresión, siempre es hasta reguladas, pero 6 de ellos mostró más de 4 veces el cambio de expresión. Del mismo modo, los datos de expresión de
HSA-mir-31 *
se obtuvieron de muestras pareadas 16 de control del cáncer. Fuera de estas 16 muestras, una muestra tenía ΔΔCt entre 0 & amp; +2, Dos muestras tenían valores entre 0 ΔΔCt & amp; -2 Y 13 muestras restantes presentaron valores ΔΔCt ≤-2
A:. Parcela Manhattan de los valores de p para los 528 miRNAs 18 muestras. La línea AB (es decir, la línea horizontal en el centro de la figura) representa P-valor de corte, p = 0,00065. Se representó la ubicación relativa de 528 miRNAs (a lo largo del eje horizontal) en todo el genoma humano y sus correspondientes -log
10 transformado p-valor (a lo largo del eje vertical). B: diagrama de mapa de calor de los valores ΔΔCt. Bidireccional sin supervisión agrupación jerárquica de 7 miRNAs cuya expresión fue significativamente muestras desregulados. Cada fila representa la expresión de un miARN y cada columna representa una muestra. Las células de color azul cielo de pie para el ensayo fallido es decir, no existen datos en esas células. colores rojos y verdes significan arriba y abajo de la regulación, respectivamente. Dendograma lo largo del eje vertical representa la clasificación jerárquica de miRNAs sobre la base de las expresiones similitud. métricas de distancia de la agrupación jerárquica fue la distancia euclídea. mapa de calor se construyó utilizando Heatmap 2 del envase "gplot" de R. C:. Expresión altamente correlacionada de
miR-206
y
MIR-1
expresión normalizada (Ct) de estos 7 miRNAs en el cáncer y tejidos de control fueron en su mayoría no se solapan y los valores de Ct de diferentes miRNAs a través de los tejidos de control también mostraron una gama bastante amplia de variación (Figura 2). Así que para conseguir la expresión relativa correcta, es importante para comparar la expresión de miRNAs en el tejido de cáncer con los de tejido de control de la misma persona. En esta figura, los miRNAs fueron colocados de acuerdo con el aumento de los valores de p (de arriba a abajo) verticalmente. Los valores de Ct de 8 miRNAs en diferentes muestras de tumores y de control habían sido representada en el eje horizontal para mostrar la distribución de los valores de Ct en todas las muestras. Es evidente que más el solapamiento entre los rangos de expresión de miRNAs en el cáncer y de control de tejidos, menos es el nivel de significación. Aquí,
HSA-mir1293 con valor de p menor 0,000028 había sido colocado en la parte superior y
HSA-mir-1