Extracto
El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. La resección quirúrgica y la quimioterapia y la radioterapia convencional en última instancia fallan debido a la recurrencia del tumor y la resistencia de HCC. Se requiere por lo tanto con urgencia el desarrollo de nuevas terapias contra el HCC. Los quinasa dependiente de ciclina (CDK) itinerarios son objetivos importantes y bien establecidos para el tratamiento del cáncer. En particular, CDK2 es un factor clave en la regulación del ciclo celular G1 a S de transición y un sello para los cánceres. En este estudio, hemos utilizado nuestra libre y de código abierto de software de proteína-ligando de acoplamiento, idock, de forma prospectiva para identificar inhibidores potenciales de CDK2 4.311 aprobadas por la FDA fármacos de moléculas pequeñas que utilizan una estrategia de reutilización y de una metodología de acoplamiento conjunto. Ordenado por puntuación media idock, nueve compuestos fueron comprados y probados
in vitro
. Entre ellos, el fluspirileno fármaco anti-psicótico exhibió el efecto anti-proliferativo más alto en las células HepG2 y Huh7 de carcinoma hepatocelular humano. Hemos demostrado por primera vez que el fluspirileno tratamiento aumentó significativamente el porcentaje de células en fase G1, y una disminución de la expresión de CDK2, ciclina E y Rb, así como las fosforilaciones de CDK2 en Thr160 y Rb en Ser795. También se examinó el efecto anticancerígeno de fluspirileno
in vivo
en ratones desnudos BALB /C por vía subcutánea con xenotransplantes de células Huh7 carcinoma hepatocelular humano. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento oral de fluspirileno inhibió significativamente el crecimiento del tumor. Fluspirileno (15 mg /kg) mostró actividad anti-tumor fuerte, comparable a la del líder fármaco contra el cáncer 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Por otra parte, el tratamiento con cóctel fluspirileno y 5-fluorouracilo presentó el mayor efecto terapéutico. Estos resultados sugieren por primera vez que el fluspirileno es un potencial inhibidor de CDK2 y un fármaco anti-cáncer candidato para el tratamiento de carcinoma hepatocelular humano. En vista del hecho de que el fluspirileno tiene una larga historia de uso humano seguro, nuestro descubrimiento de fluspirileno como un potencial medicamento contra el HCC puede presentar una terapia clínica de aplicación inmediata
Visto:. Shi XN, Li H, Yao H, Liu X, Li L, Leung KS, et al. (2015)
in silico
Identificación y
in vitro
y
En Vivo
Validación de la droga antipsicótica fluspirileno como un potencial inhibidor de CDK2 y un candidato anti-droga contra el cáncer. PLoS ONE 10 (7): e0132072. doi: 10.1371 /journal.pone.0132072
Editor: Jia Yu-Chang, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 20 de enero de 2015; Aceptado: June 9, 2015; Publicado: 6 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la estación de trabajo académico Hsiang-fu de Kung de la Universidad de Medicina de Kunming, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF) 81272549, Laboratorio clave proyecto de Shenzhen (ZDSY20130329101130496) de china, la donación directa de la Universidad china de Hong Kong, el GRF Grant (proyecto Referencias 414413, 772910, 470911 y) del Consejo de Ayudas a la investigación de Hong Kong.
Conflicto de intereses los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (CHC) es el tipo más común de cáncer de hígado.. Sólo 30% a 40% de los pacientes con HCC son elegibles para tratamientos curativos, que incluyen la resección quirúrgica como la primera opción, el trasplante de hígado y la ablación percutánea. Sin embargo, hay una alta frecuencia de la recidiva del tumor después de la resección quirúrgica, y la mayoría de los HCC parecen resistentes a la quimioterapia convencional y radioterapia. Por tanto, el desarrollo de nuevas terapias contra el CHC es muy demandado.
La causa de HCC involucra múltiples vías. Las vías de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) como dianas terapéuticas importantes para el tratamiento del cáncer han sido bien establecidos. CDK son enzimas implicadas en la replicación celular, y su papel en el crecimiento tumoral a largo les ha convertido en dianas de fármacos atractivos. Pero los primeros intentos industriales en las CDK de inhibición para restaurar el crecimiento de las células normales a los problemas de toxicidad han encontrado. inhibidores de CDK de primera generación eran no específica, la inhibición de muchos CDK diferentes (hay más de 20, muchos de los cuales han sido implicados en varios tipos de tumores), y que resulta en el tipo de toxicidades y eficacia silenciado visto con quimioterapias mayores.
quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2) es una de las proteínas quinasas serina /treonina. Desempeña un papel fundamental en la regulación de la transición del ciclo celular de G1 a la fase S, y por lo tanto en el control de la proliferación celular. Por lo tanto, los inhibidores de CDK2 son potencialmente agentes eficaces contra el cáncer. Aunque un número de inhibidores de CDK2 se han descrito en la literatura [1] y algunos han entrado en etapas de ensayos clínicos, por ejemplo flavopiridol [2], roscovitina [3] y olomoucina [4], ninguno de ellos ha sido aprobado para uso clínico debido a diversas razones tales como la toxicidad y especificidad de objetivos múltiples. Además, ninguno de los inhibidores de CDK2 son reportados para el tratamiento del CHC.
En este estudio, hemos utilizado nuestra libre y de código abierto proteína-ligando software de soporte para idock [5, 6] a la pantalla pequeña aprobados por la FDA fármacos de moléculas contra CDK2, evitando así el problema de toxicidad. Adoptamos el
in silico
método de cribado virtual basado en la estructura y el acoplamiento del conjunto de reutilizar fármacos aprobados para el tratamiento de los cánceres que implican la regulación de CDK2, con un mayor enfoque en el carcinoma hepatocelular humano (HCC). Hemos probado nueve compuestos computacionalmente favorecidos
in vitro Hoteles en líneas celulares de HCC HepG2 y Huh7, y con éxito identificado el fluspirileno fármaco anti-psicótico como un inhibidor potencial de CDK2. A continuación realizó
in vivo
experimentos en ratones desnudos xenoinjertados con células Huh7, y mostraron que el fluspirileno exhibió una fuerte actividad anti-tumor comparable a la de la droga contra el cáncer 5-fluorouracilo conduce, estableciendo además fluspirileno como un candidato anti- medicamento contra el cáncer. También puso de manifiesto que el tratamiento cóctel con tanto fluspirileno y 5-fluorouracilo podría producir un efecto terapéutico sinérgico. Por último, se analizó la conformación de unión predicha de fluspirileno y revelado las interacciones moleculares críticos que posiblemente rigen la unión a CDK2 fluspirileno.
Métodos y materiales
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el comité de ética animal de laboratorio de la Universidad de Medicina de Kunming.
acoplamiento Ensemble y el compuesto de la selección
Hay tantos como 346 de rayos X que resuelve las estructuras cristalográficas de CDK2 de la AP (Protein Data Bank ) [7, 8] con un UniProt ID de P24941 (S1 Tabla). Entre ellos, se recogieron 44 estructuras cristalinas de CDK2 en complejo con un ligando unido (Tabla 1; la figura S1). Se seleccionaron estas estructuras 44, ya que no contienen iones metálicos, que pueden influir en la precisión de acoplamiento de idock [6], y también debido a que contienen un ligando unido, cuyo coordinar ayuda a definir un espacio de búsqueda fácilmente. Un guión escrito previamente [6] fue re-utilizado para definir automáticamente el espacio de búsqueda de acoplamiento mediante la búsqueda de la caja cúbica más pequeña que cubre todo el ligando co-cristalizado y posteriormente se extiende a la caja por 10 Å en todas las tres dimensiones. Las 44 estructuras CDK2 se extrajeron manualmente desde sus correspondientes complejos con los ligandos co-cristalizado y aguas removidas, y luego convertidas de formato PDB al formato PDBQT mediante el script de prepare_receptor4.py autodocktools [9].
para probar la exactitud redocking de idock, los ligandos co-cristalizado también se extrajeron manualmente desde sus correspondientes complejos y convierten de formato PDB al formato PDBQT usando la secuencia de comandos de prepare_ligand4.py autodocktools [9]. Estos ligandos se acopló a continuación, volver a su estructura CDK2 correspondiente, y su raíz cuadrada media desviación (RMSD) se calculó a partir de la conformación de co-cristalizado.
Las estructuras de los medicamentos aprobados por la FDA se obtuvieron de la FDA y DBAP catálogos de la base de datos ZINC [10, 11], donde el catálogo DBAP comprende medicamentos obtenidos de la base de datos DrugBank [12] y el catálogo de medicamentos aprobados por la FDA comprende recogidos a través del proyecto DSSTox (Estructura aceptan búsquedas de toxicidad Distribuido) aprobados. El catálogo DBAP de la versión 3.19.2014 con 1.738 compuestos y el catálogo de la FDA de la versión 2012-07-25, con 3.176 compuestos fueron descargados. Entre estos compuestos 4.914, 4.311 eran únicas en términos de CINC ID. Estos compuestos 4.914 en formato Mol2 fueron luego convertidas a formato PDBQT mediante el script de prepare_ligand4.py autodocktools [9].
Nuestro libre y de código abierto de software de acoplamiento idock v2.1.2 [6] se ejecuta entonces para predecir las conformaciones de unión y las afinidades de unión de los compuestos 4.914 cuando se acopla contra las estructuras de CDK2 44 utilizando una estrategia de acoplamiento del conjunto [13-15]. Para cada estructura de proteínas, red de energía libre de los mapas con una granularidad fina de 0,08 Å se construyeron en paralelo, y para cada compuesto, 256 Monte Carlo tareas de optimización conformacional se ejecuta en paralelo a través de múltiples núcleos de CPU.
Después de acoplamiento, idock emite un número máximo de nueve conformaciones predichos para cada compuesto de entrada. La conformación se acopló con la mejor puntuación idock fue seleccionado porque se había demostrado ser el más probable es más cercano a la conformación de cristal con una tasa de éxito redocking de más del 50% en tres puntos de referencia diferentes [6]. Los compuestos 4.914 fueron ordenados en el orden ascendente de su unión predicha energía libre promedio a través de las estructuras de CDK2 44, y los de puntuación superior se examinaron visualmente usando iview [16] en el contexto de CDK2 usando la estructura cristalina de rayos X del más alta resolución, es decir, PDB ID 1GZ8 en este caso (Tabla 1). A continuación, compuestos disponibles comercialmente fueron consultados y adquiridos a través de la página web del libro Química http://www.chemicalbook.com/y posteriormente validados
in vitro e
in vivo
.
Productos químicos, anticuerpos, líneas celulares y cultivo celular
los productos químicos seleccionados y el principal medicamento contra el cáncer 5-fluorouracilo se adquirieron de Sigma-Aldrich, EE.UU.. Anti-ciclina D, B1, E, CDK2, Rb, pho-CDK2 (Thr160), pho-Rb (Ser795) y GAPDH se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, EE.UU..
líneas celulares de hepatoma HepG2 y Huh7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EE.UU.. Estas líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino al 10% fetal (FBS) (Invitrogen, Rockville, Maryland, EE.UU.) a 37 ° C en 5% de CO
2 y 95% de aire humidificado.
las células se sembraron en 96-, 24-, o placas de 6 pocillos con medio FBS 0,125% durante 24 horas y después se trataron con 10% de medio FBS que contiene los compuestos de ensayo a diversas concentraciones de 1, 3, 10, 30
mu M, y se incubó durante 24, 48 o 72 horas.
MTT ensayo
Las células se sembraron a una densidad inicial de 9 × 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron con 0,5 mg /ml de 3- (4,5-metiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio para 4 horas. El medio se desechó y
se añadieron 200 μ l
de formazan en dimetilsulfóxido (DMSO). La absorbancia se midió a 570 nm de acuerdo con el protocolo estándar. El IC
50 valores se calcularon mediante GraphPad Prism 5.
células
Análisis del ciclo celular
HepG2 o Huh7 (4 × 10
4) se sembraron en placas de 24 pocillos en RPMI 1640 que contiene 0,125% de FBS, y se cultivaron durante 24 horas. Las células se incubaron en medio que contiene 10% de FBS y diversas dosis de fluspirileno (1, 3, 10, 30
μ
M) para 12, 24, 36 horas a 37 ° C, después se fijaron en hielo frío 70% de etanol y se tiñeron con un kit de Coulter DNA-Prep reactivos (Beckman Coulter, Fullerton, California, EE.UU.). contenido de ADN celular de 1 × 10
se determinó 4 células de cada muestra con el uso de un flujo EPICS ALTRA citómetro (Beckman Coulter). distribución de fase del ciclo celular se analizó con el software ModFit LT 2.0 (Verity Software House, Topsham, Maine, EE.UU.). Todos los resultados se obtuvieron a partir de dos experimentos separados, cada uno de los cuales se realizó por triplicado.
análisis de la apoptosis de la célula
células
HepG2 y Huh7 se sembraron en placas de 24 pocillos con medio FBS al 0,125% durante 24 horas y después con 10% de medio FBS que contiene fluspirileno a concentraciones de 3, 10 y 30
μ
M. Siguiendo las instrucciones del fabricante para cuantificar las células apoptóticas, la aparición de apoptosis se determinó por tinción de las células con tanto la anexina V y yoduro de propidio (PI) (Life Technologies). Brevemente, las células se tripsinizaron con 0,25% de tripsina en ausencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Las células se lavaron con PBS dos veces y se resuspendieron en 500
μ
l de tampón de unión a una concentración de 2 x 10
5 - 10
6 células /ml. Dos microlitros de la anexina V-EGFP y 5
μ
l de PI se añadieron a la suspensión seguido por 5 a 15 minutos de incubación en la oscuridad. Después, las células se analizaron mediante citometría de flujo (CyFlow Espacio /Partec, Alemania).
Western Blot
células
HepG2 y Huh7 se sembraron en placas de 6 pocillos con 0,125% de medio FBS durante 24 horas y luego con 10% de medio FBS que contiene fluspirileno a una concentración de 3, 10, 30
μ
M. Las células se recogieron después de 6 horas de incubación. Las células se lisaron con tampón RIPA que contiene PMSF 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa a 4 ° C durante 30 minutos. Después de centrifugación a 13.000 rpm durante 15 minutos, los sobrenadantes se recuperaron y la concentración de proteína se midió por BCA Protein Assay Kit (Thermo). Cantidades iguales de lisados celulares se resolvieron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Sigma). Después del bloqueo, las membranas se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y secundarios diluidos adecuados. Las proteínas fueron detectados por el sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (Amersham, Piscataway, Nueva Jersey, EE.UU.). Para garantizar la igualdad de carga de las muestras, las membranas se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-GAPDH (Señalización Celular Technologies).
tratamiento fluspirileno
in vivo
hembra Balb /C ratones desnudos, de 4 a 5 semanas de edad de River Laboratory Vital Technology Co. Ltd, Pekín, china, se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Para el ensayo de crecimiento del tumor xenoinjertado, se inyectaron 1 x 10
6 /0,2 ml por vía subcutánea células Huh7 PBS en el flanco derecho de los ratones. El tamaño del tumor se midió cada día. Tres semanas después de la inoculación, cuando los tumores crecieron hasta un volumen de 80 a 100 m
3, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de 5 ratones por grupo, y se alimenta por sonda oral con 0,5% CMC-NaCl que contiene fluspirileno (15 mg /kg) y por inyección intraperitoneal de 5-fluorouracilo (10 mg /kg) al día durante 21 días. volúmenes de carcinoma se midieron cada 3 a 4 días después de la aparición del tumor. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula
V
=
ab
2/2, donde
a
es el eje más largo y
b es
eje más corto. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical.
El análisis estadístico
Los resultados se obtuvieron a partir de al menos tres experimentos diferentes y se expresan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de la t de Student y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p & lt; 0.05. resultados estadísticamente significativos están marcados con el símbolo * en las figuras.
Resultados
Resultados Redocking
En los complejos de CDK2 44, los ligandos cocristalizadas se acoplan en contra de su correspondiente estructura CDK2 para ver si podía predecir idock poses de unión como conformacionalmente cerca de la co-cristalizado plantean como sea posible. Tal precisión redocking se cuantificó por la raíz cuadrada media desviación (RMSD) de las poses predichos de la co-cristalizado pose. Para cada uno de los 44 complejos, idock predijo nueve poses, por lo tanto, nueve valores RMSD. Los valores de RMSD de los nueve poses en los ensayos redocking 44 se proporcionan en la Tabla S2.
La figura 1 representa la distribución de los valores de RMSD de la primera postura (denotado como plantean 1), que se prevé que tienen los más bajos energía libre entre los nueve poses, así como la distribución de los valores RMSD de la pose que tiene la RMSD mínimo entre los nueve poses (denotado como pose m). Explicación detallada y la justificación de la selección de estos dos tipos de poses se pueden encontrar en [6]. Semánticamente, el valor RMSD de actitud 1 (denotado como RMSD1) y el valor RMSD de pose m (denotado como RMSDm) reflejan la exactitud redocking si sólo la parte superior y la parte superior de nueve predijeron poses son considerados, respectivamente. Por definición, RMSDm ≤ RMSD1 está siempre garantizada. Fuera de los ensayos redocking 44, 10 ensayos produjeron RMSD1 & lt; 2A y 28 ensayos producidos RMSDm & lt; 2a. Estos resultados reflejan redocking en cierta medida la conveniencia de utilizar idock para atracar compuestos contra las estructuras de CDK2.
Las distribuciones RMSD de posar y posar 1 m se muestran en negro y rojo, respectivamente. 10 y 28 puntos por debajo de la línea de base de RMSD = 2a para pose 1 y plantean m, respectivamente.
Resultados de conexión de conjunto y de selección de candidatos a inhibidores
Totally 4.914 fármacos aprobados por la FDA se acopló y clasificado de acuerdo a su afinidad de unión media prevista en 44 estructuras cristalinas de rayos X de CDK2. Sus valores de energía libre predichos se proporcionan en la Tabla S3. Los resultados de la predicción de acoplamiento con iview visualización [16] están libremente disponibles en http://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?1GZ8-dbap y http://istar.cse.cuhk.edu.hk /idock /iview /? 1GZ8 por la FDA.
la figura 2 representa gráficamente la distribución de la puntuación media de los idock 4.914 compuestos. 15 compuestos habían predicho energía libre de -10 kcal /mol o menos, con uno de los mejores que tiene -10,46 kcal /mol. Sobre la base de la disponibilidad comercial, 9 compuestos con mayor puntuación (Tabla 2; 3; Tabla S4) fueron adquiridos para futuras investigaciones
842 y 783 fueron compuestos en los rangos de [-7.5, -8.0) y [. ,,,0],-7,0, -7,5), respectivamente, que constituyen los dos contenedores más grandes. 15 y 63 fueron compuestos en los rangos de [-10.0, -10.5) y [-9.5, -10.0), respectivamente, que constituyen los dos contenedores apropiados para la selección de fármacos candidatos.
Esta cifra se creado por RDKit (http://rdkit.org/).
fluspirileno disminución de la viabilidad celular de carcinoma hepatocelular
Se evaluó en primer lugar el efecto anticancerígeno de los nueve compuestos mediante ensayo de MTT (Fig 4). Todos los nueve compuestos disminución de la viabilidad celular en las células HepG2 y Huh7, pero tenía citotoxicidad discrepante a diferentes concentraciones. Entre ellos, fluspirileno tuvo la menor IC
50, es decir, 4.017
μ M
para HepG2 y 3.468
μ M
para Huh7. Fluspirileno exhibe la más alta citotoxicidad en comparación con el control con significación estadística (p & lt; 0,05). Tal efecto de inhibición fue la dosis y dependiente del tiempo. Se observó una inhibición marcada a las 10
μ M y 30
μ
M, pero no se observó ningún efecto significativo a concentraciones por debajo del 3
μ M.
(a) los nueve compuestos tenían citotoxicidad discrepante a líneas de células HepG2 y Huh7 en diferentes concentrationas, con fluspirileno que exhibe la más alta citotoxicidad en comparación con el control (p & lt; 0,05). (B) fluspirileno exhibió inhibición de la dosis y dependiente del tiempo en la viabilidad celular en las líneas celulares HepG2 y Huh7 en comparación con el control (p & lt; 0,05).
tratamiento fluspirileno detenido ciclo celular en la fase G1
para entender si fluspirileno inhibe las actividades de CDK2 en células de carcinoma hepatocelular, se analizó el efecto del tratamiento con fluspirileno concentraciones de 3, 10, 30
μ M
de 6, 12, 24 horas en el ciclo celular perfil en células HepG2 y Huh7 por citometría de flujo (Fig 5). tratamiento fluspirileno aumentó significativamente el porcentaje de células en fase G1 en comparación con el control (p & lt; 0,05) de una manera dosis-y dependiente del tiempo. A los 30
μ
M o 10
μ
M de concentración, el tratamiento fluspirileno aumentado continuamente el porcentaje de la fase G1 durante 24 horas. Después de 24 horas de tratamiento fluspirileno, el aumento de la fase G1 fue acompañada por la disminución simultánea de la fase S. Los porcentajes de sub-G1 se proporcionan en la Tabla S5. Los histogramas representativos de contenido de ADN se proporcionan en S5 Fig.
(A) fluspirileno dosis-tratamiento y el tiempo aumentó de forma dependiente el porcentaje de células en fase G1. A los 30
μ
M o 10
μ
M de concentración, el tratamiento fluspirileno aumentado continuamente el porcentaje de la fase G1 durante 24 horas. (B) la distribución del ciclo de la célula a las 24 horas después del tratamiento fluspirileno. El aumento de la fase G1 fue acompañada por la disminución simultánea de la fase S.
fluspirileno tratamiento inducida por apoptosis de las células
Un medicamento que sólo puede inducir la detención del ciclo celular no es suficiente, porque buena los tumores serán fáciles volver a crecer después de retirar el fármaco. Por lo tanto, también se investigó si fluspirileno podría inducir la apoptosis de las células (Figura 6). tratamiento fluspirileno en 30
μ
M o 10
μ
concentración M aumentó significativamente el porcentaje de apoptosis en líneas de células Huh7 y HepG2 en comparación con el control de una manera dosis-y dependiente del tiempo (p & lt; 0,05). Los gráficos de dispersión de PI contra la anexina V se proporcionan en la figura S6.
fluspirileno tratamiento en 30
μ
M o 10
μ
concentración M aumentó significativamente el porcentaje de apoptosis en líneas celulares Huh7 y HepG2 en comparación con el control de una manera dosis-dependiente del tiempo y (p & lt; 0,05).
fluspirileno tratamiento disminuyó la expresión de CDK2, Rb, ciclina e, Pho-CDK2 y pho-Rb, pero no la ciclina D1 y ciclina B1
se investigó el efecto de fluspirileno en las expresiones de proteínas críticos implicados en la transición G1 a S en las células HepG2 y Huh7 por transferencia de western (Fig 7) . tratamiento fluspirileno reduce la expresión de CDK2, Rb, pho-CDK2, pho-Rb y ciclina E. Por el contrario, los niveles de expresión de la ciclina D1 y ciclina B1 se mantuvo sin cambios. Estos resultados son consistentes con lo que se espera de un inhibidor de CDK2.
tratamiento fluspirileno disminución de la expresión de CDK2, Rb, ciclina E, Pho-CDK2 y pho-Rb, pero no la ciclina D1 y ciclina B1.
también se observó que el tratamiento fluspirileno disminuyó la expresión, muy adelantado en lugar de la fosforilación de CDK2. Proponemos que tales diferencias son razonables en el sentido de que después de la unión, los complejos de CDK2-fluspirileno pueden someterse directamente la degradación, por lo tanto resulta en una mayor reducción de la expresión de CDK2 de fosforilación. Además, fluspirileno puede unirse a CDK2 con una alta afinidad, pero después de CDK2 es fosforilada, la unión de fluspirileno puede debilitarse, y la afinidad de unión por lo tanto se puede debilitado.
El tratamiento diario por vía oral fluspirileno reducción del crecimiento del tumor
in vivo
Se evaluó el efecto de fluspirileno en el crecimiento del carcinoma hepatocelular
in vivo
en ratones desnudos BALB /C por vía subcutánea inyectados con células Huh7 (figura 8). En el día 21 después del tratamiento, fluspirileno (15 mg /kg) dio como resultado una reducción significativa de peso del tumor y el volumen en comparación con el control (p & lt; 0,05), mientras que hacer ningún cambio significativo en el peso corporal. La actividad anti-tumor de fluspirileno oral (15 mg /kg) fue comparable a la de 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Es importante destacar que la terapia combinada exhibió el mayor efecto terapéutico. Estos resultados sugieren por primera vez que el fluspirileno es un potencial inhibidor de CDK2 y un fármaco candidato anti-cáncer para el tratamiento de carcinoma hepatocelular humano.
La actividad anti-tumor de fluspirileno oral (15 mg /kg) se comparable a la de 5-fluorouracilo (10 mg /kg). Por otra parte, su terapia de cóctel exhibió efecto terapéutico sinérgico
Análisis estructural de la conformación de unión predicha de fluspirileno
La figura 9 parcelas de la conformación predicha de fluspirileno en complejo con CDK2 (AP ID.: 1GZ8) utilizando iview [16]. Fluspirileno se predijo para unir el interior del bolsillo de unión del ATP de CDK2 e interactuar con CDK2 principalmente a través de enlaces de hidrógeno, contactos hidrofóbicos y cationes
π
interacciones. Supuestamente, el átomo H8 forma un enlace de hidrógeno con el oxígeno columna vertebral de Ile10, y el átomo de H32 forma otros dos enlaces de hidrógeno con el oxígeno columna vertebral de Leu83 y His84. Las cadenas laterales de Ile10, Ala31 y Leu134 establecer un túnel hidrofóbico para la cola hidrófoba de fluspirileno para enterrar en el interior. Uno de los dos anillos aromáticos situados en la cola de fluspirileno forma un catión
π
interacción con la cadena lateral de carga positiva de Lys33. Todos estos enlaces de hidrógeno putativos, contactos hidrofóbicos y cationes
π
interacciones están repartidas en los fragmentos de la cabeza, medio y cola de fluspirileno, por lo tanto sujeta firmemente fluspirileno en su posición predicha y la orientación. En comparación, el conocido inhibidor de CDK2 2-Amino-6- (3'-metil-2 'oxo) butoxypurine (nombre código MBP para abreviar), que es un O (6) sustituido con derivado de guanina, es conocido para establecer cuatro de hidrógeno bonos con Lys33, Glu81 y Leu83 (S2 figura).
residuos de CDK2 se representan como líneas de color según el tipo de átomo. Fluspirileno se representa como palos de colores según el tipo de átomo. Los átomos que interactúan y residuos están etiquetados. El cian, verde y rosa líneas discontinuas representan enlaces de hidrógeno, contactos hidrofóbicos y
pi
interacciones, respectivamente. Esta figura fue creada por iview [16].
Se examinaron además la conformación predicha de fluspirileno en presencia de superficie molecular CDK2 (Figura S3). En comparación con la guanina derivado de MBP (S4 Fig), fluspirileno ocupa una porción mucho mayor de la bolsa de unión, y su forma coincide correctamente la de la cavidad de unión. Sobre la base de este análisis estructural, junto con nuestra
e in vitro
in vivo
experimentos, inferimos que fluspirileno puede unirse físicamente a la CDK2.
Discusión
el progreso del ciclo celular se procesa secuencialmente y estrictamente a través de las interacciones de las CDK y ciclinas [17]. Diferentes complejos de ciclina-CDK se activan en diferentes fases del ciclo celular. Cuando el ciclo celular pasa a través de G1 a la fase S, la ciclina D1-CDK4 /6 y ciclina E-CDK2 complejos se activan ordinally y la proteína retinoblastoma (pRb) es hiper-fosforilados en residuos de serina y treonina [18]. El PRB hiper-fosforilada promueve la liberación de factores de transcripción E2F, que a su vez facilitan la transcripción de numerosos genes necesarios para la transición de G1 a S y la progresión de la fase S [19]. Desde el punto de vista medicinal, CDK2 ha sido durante mucho tiempo un objetivo clásica e importante para la terapia del cáncer.
A pesar de una serie de inhibidores de CDK2 han entrado en etapas de ensayos clínicos, ninguno ha sido aprobado oficialmente para su uso clínico, probablemente a causa de su toxicidad y especificidad de objetivos múltiples. Teniendo en cuenta el obstáculo que el desarrollo de un nuevo fármaco
de novo
es una tarea laboriosa y costosa, la reutilización de viejos medicamentos sin toxicidad para nuevos usos es una estrategia favorable.
La poderosa sinergia de
en silico
métodos de reutilización de drogas por cribado virtual basado en la estructura (SBVS) se destacó en varias publicaciones recientes [20]. Para nombrar unos pocos casos exitosos por la reutilización de SBVS, [21] redescubierto ácido 2,4-diclorofenoxi, un conocido auxina vegetal, como un nuevo agente anti-inflamatorio a través de
in silico
estudios de modelos moleculares y de conexión junto con la formulación de fármacos y
in vivo
inspección antiinflamatorio; [22] trató de cambiar la finalidad de fármacos aprobados por la FDA por un enfoque integrado y SBVS informado del descubrimiento de piperacilina 1 como inhibidor de la enzima activadora de NEDD8 (NAE) en sistemas libres de células y basados en células con alta selectividad.
Además de SBVS, el cribado virtual basado en ligando (LBVs) también encuentra sus aplicaciones exitosas en la reutilización. [23] utilizó ultrarápido de Reconocimiento de formas (USR) [24] para buscar compuestos con forma similar a un inhibidor previamente informado de proteína arginina deiminasa tipo 4 (PAD4), una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la artritis reumatoide, y identificado un nuevo compuesto que tiene una estructura sorprendentemente diferente del inhibidor de la plantilla todavía mostró una inhibición significativa de la actividad enzimática de PAD4.
Alentados por estas historias de éxito, en este estudio hemos adoptado la estrategia de reutilización, y se utiliza la metodología de cálculo de SBVS por acoplamiento proteína-ligando a favoritos candidatos de fármacos de molécula pequeña aprobados por la FDA. En concreto, hemos utilizado nuestro programa de acoplamiento rápido idock [5, 6] en combinación con nuestra conveniente iview visualizador [16] para la tarea de volver a descubrir fármacos existentes como inhibidores de CDK2. idock es un desarrollo emocionante, no sólo porque se ha demostrado vigorosamente [6] para superar al software de soporte para el estado de la técnica AutoDock Viña [25] en términos de velocidad de conexión de al menos 8,69 veces y en la mayoría de las 37.51 horas mientras se mantiene las tasas de éxito comparables redocking, sino también porque es libre y de código abierto bajo una licencia permisiva. Este último garantiza que los usuarios tanto de la industria y el mundo académico pueden utilizar libremente idock en sus propios proyectos que requieren de acoplamiento proteína-ligando.
Para facilitar el uso de idock, sus argumentos de entrada y de salida de resultados fueron diseñados a propósito para ser similar a los de AutoDock Vina, por lo tanto, los usuarios existentes pueden fácilmente tránsito hacia iDock y beneficiarse de un considerable aumento de velocidad en el rendimiento SBVS. Por otra parte, para promover SBVS posibles por idock, un servidor web llamado Istar [6] fue desarrollado y hecho disponible gratuitamente en http://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock, donde hay tantos como más de 23 millones adquirible pequeña molécula compuestos listos para el acoplamiento contra cualquier proteína suministrada por el usuario. El 1 de mayo de 2015, se han producido más de 1000 los envíos de trabajos de conexión de los usuarios de 98 países. Tanto idock [5] y Istar [6] con suerte podría complementar los esfuerzos de los químicos medicinales en la investigación de descubrimiento de fármacos. Además de para fines de investigación, algunas universidades también utilizan nuestra idock para la enseñanza de propósito en sus cursos de bioinformática.
En cuanto a los datos estructurales en uso, hasta el momento no son tantos como 346 que resuelve las estructuras cristalinas de rayos X de CDK2 con una UniProt ID de P24941 (S1 Tabla). Para dar cuenta de su variabilidad estructural y al conocimiento mío de múltiples estructuras de CDK2, se seleccionaron 44 estructuras holográficas de CDK2 en un estado ligado con un ligando en el complejo para llevar a cabo acoplamiento conjunto. La puntuación final que se usa para dar prioridad a los compuestos fue deliberadamente diseñado para ser la puntuación media de este compuesto cuando se acopla a las 44 estructuras seleccionadas de CDK2 con sus ligandos eliminado manualmente antes del acoplamiento co-cristalizado.