Extracto
CD44 y CD147 están asociados con la metástasis del cáncer y la progresión. Nuestro propósito en este estudio fue investigar los efectos de la baja regulación de CD44 o CD147 en la capacidad metastásica del cáncer de próstata (CaP) las células, su docetaxel (DTX) la capacidad de respuesta y posibles mecanismos implicados
in vitro
y
in vivo
. CD44 y CD147 fueron derribados (KD) en células de CaP PC-3M-luc utilizando ARN corto horquilla (shRNA). La expresión de CD44, CD147, MRP2 (multi-fármaco resistencia a la proteína-2) y MCT4 (monocarboxilato Transporter-4) se evaluó mediante inmunofluorescencia y Western Blot. La dosis-respuesta y la proliferación DTX se midió mediante ensayos de MTT y de colonias, respectivamente. El potencial invasor se evaluó mediante un ensayo de cámara de matrigel. proteínas de transducción de señales de PI3K /Akt y MAPK /ERK se evaluaron por Western Blot. Un
in vivo
subcutánea (s.c.) modelo de xenoinjerto se estableció para evaluar CaP tumorigenecity, metástasis de ganglios linfáticos y la respuesta DTX. Nuestros resultados indican que KD de CD44 o CD147 disminuyó MCT4 y expresión MRP2, la proliferación CaP reducido y la sensibilidad DTX potencial y mejorado invasivo; y KD de CD44 o CD147 reducido regulado p-Akt y Erk-p, los principales moduladores de señales asociadas con el crecimiento celular y la supervivencia. el crecimiento del tumor
In vivo
, CD44 o CD147 xenoinjertos-KD PC-3M-luc mostrado en pantalla suprimida con mayor capacidad de respuesta DTX comparación con el control xenoinjertos. Tanto CD44 y CD147 mejorar la capacidad metastásica de las células y la quimio-resistencia PAC, posiblemente mediada por la activación de las vías PI3K y MAPK. la orientación selectiva de CD44 /CD147 solo o combinado con DTX puede limitar la metástasis CaP y aumentar la quimiosensibilidad, con la promesa para el tratamiento futura PAC
Visto:. Hao J, Madigan MC, Khatri A, CA Energía, Hung TT, Beretov J, et al. (2012)
in vitro
y
En Vivo
cáncer de próstata y metástasis quimiorresistencia puede ser modulada por la expresión de cualquiera de CD44 o CD147. PLoS ONE 7 (8): e40716. doi: 10.1371 /journal.pone.0040716
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de Febrero, 2012; Aceptado: June 12, 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Hao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el National Health & amp; Consejo de Investigación Médica (NH & amp; MRC) (YL), St George Fundación de Investigación Médica (YL), el Fondo de Investigación de Urología (PJC) y el Fondo de St George Hospital Trust (PHG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los EE.UU. [1]. Mientras que inicialmente responden a la terapia de privación de andrógenos (ADT), la mayoría de los pacientes sufren de recurrencia del cáncer después de 12 meses, y el CaP en esta etapa ya no es curable [2]. La progresión del CaP a una etapa avanzada se caracteriza por la diseminación de las células cancerosas malignas y pequeños grupos de células a través de los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos. Aunque se reportan varios cambios genéticos y epigenéticos en la progresión del CaP, los mecanismos celulares implicados en la progresión del CaP localizado en la enfermedad metastásica permanecen sin definir.
La quimioterapia se utiliza tradicionalmente para la paliación de los síntomas asociados con CaP avanzado. Dos recientes docetaxel (DTX) basado en estudios clínicos tienen por primera vez demostrado los beneficios potenciales de la quimioterapia para prolongar el tiempo de supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con NAC [3], [4]. DTX es actualmente el fármaco quimioterapéutico más eficaz para metastásico CaP [3] - [6]. Sin embargo, la naturaleza resistente a los medicamentos de la tapa todavía cuestiona la eficacia de este tipo de terapias. Claramente, resistencia a múltiples fármacos y la enfermedad metastásica siguen siendo las principales causas de fracaso del tratamiento y la mortalidad en pacientes con NAC. Por lo tanto, es de gran valor para investigar los mecanismos y vías de Cap metástasis y la resistencia a los medicamentos, identificar dianas terapéuticas útiles para mejorar las modalidades terapéuticas actuales.
CD44 es una proteína multifuncional implicada en la adhesión celular, la migración, la resistencia a los medicamentos , la transmisión de la señal, la migración y la apoptosis [7], [8]. El gen de CD44 contiene 20 exones empalmados alternativamente para dar muchas isoformas o variantes (CD44v), algunas de las cuales forman el dominio extracelular de CD44 invariante estándar (CD44s). CD44 es un receptor principal de hialuronano (HA), un componente principal de la matriz extracelular (ECM) y crítica para las interacciones de señalización célula y célula-ECM en el cáncer. CD44-HA estimula la unión efectos aguas abajo de las proteínas del citoesqueleto implicados en la migración de las células tumorales, además de estimular la resistencia a múltiples fármacos protein1 (
MDR1
) expresión y la resistencia a los medicamentos [9]. CD44s está presente en la membrana de la mayoría de las células de vertebrados [7]. La expresión de ciertas variantes de CD44 se informó a estar estrechamente asociada con la progresión tumoral, y esto varía dependiendo del tipo de tumor estudiado [10]. Los estudios han implicado intrigantes interacciones HA /CD44 en epitelio mesenquimal transición (EMT), "troncalidad" y el cáncer [11], [12]. La interacción entre HA y CD44 se ha demostrado para desencadenar vías relacionadas con el crecimiento del tumor y la supervivencia [13], [14]. Sin embargo, el papel de CD44s y CD44v en el desarrollo y la progresión de CaP es diferente, con estudios que muestran tanto los efectos promotores de tumores (CD44s) e inhibidora de tumores (CD44v) [15] - [17]. La implicación de CD44 y sus variantes en el casquillo de progresión y metástasis requiere investigación adicional.
CD147 (metaloproteinasa de matriz extracelular inductor proteína-EMMPRIN) es una glicoproteína multifuncional que puede modificar microambiente del tumor mediante la activación de proteinasas, la inducción de factores angiogénicos en tanto tumor y las células del estroma, y la regulación del crecimiento y la supervivencia de las células independientes de anclaje tumorales (micrometástasis), así como resistencia a múltiples fármacos [18]. análisis del transcriptoma y la hibridación genómica comparativa de las células tumorales individuales aisladas de la médula ósea de pacientes con CaP mostraron que CD147 es la proteína más frecuentemente expresada en tumores primarios y micrometástasis [19]. Por otra parte, el aumento de la expresión de CD147 se asocia con un mayor riesgo, incluyendo el antígeno prostático específico (PSA), el hecho metástasis, y la reducción de la supervivencia global en cáncer de próstata humana [20]. Recientemente, hemos mostrado que los altos niveles de expresión CD147 se correlacionan con la progresión de CaP y se asocian con la expresión de MMP (metaloproteinasas de la matriz) en tumor, así como las células del estroma [21]. Estos resultados sugieren que CD147 puede ser una diana terapéutica útil para la terapia CaP. Sin embargo, el papel de CD147 en cáncer de próstata metástasis y resistencia a los medicamentos sigue siendo poco clara.
En el presente estudio, la hipótesis de que (1) la expresión de CD44 y CD147 se correlacionan con la capacidad metastásica y quimio-resistencia de la tapa y pueden cooperar para influir en la progresión de la PAC y (2) la baja regulación de la expresión de CD44 o CD147 podría tener un potencial terapéutico en la limitación de CaP metástasis y la mejora de la sensibilidad CaP quimioterapéutico. Nosotros demostramos en las siguientes secciones que CD44 y CD147 confieren propiedades significativas para el tapón de la metástasis y la quimio-resistencia
in vitro
y
in vivo
, y son objetivos terapéuticos útiles para el tratamiento futuro de la PAC.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
Los anticuerpos se obtuvieron a partir de diferentes fuentes. La información y condiciones detalladas de todos los anticuerpos se enumeran en la Tabla 1.
línea celular y cultivo celular
El andrógeno-no responde PC-3M-luc-C6 (PC- 3M-luc) línea celular se obtuvo de CaP Xenogen Corp, EE.UU.. Todos los reactivos de cultivo de tejidos fueron suministrados por Invitrogen Australia Pty Ltd (Melbourne, VIC, Australia), a menos que se indique lo contrario. células PC-3M-luc se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% (vol /vol) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 50 U /ml de penicilina y 50 U /ml de estreptomicina. PC-3M-luc-scr (control shRNA revueltos), PC-3M-luc-CD44-caída (KD), las células PC-3M-luc-CD147-KD se cultivaron en el mismo medio suplementado con adicional 1 mg /ml de puromicina para el cribado. Todas las líneas celulares se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2.
ARN corto horquilla (shRNA) transfección de CD44 /CD147
PC-3M-luc células con KD mediada por shRNA de CD44 (s y v) /CD147 o un control de secuencia revueltos para efectos fuera de objetivo (PC-3M-luc-scr) se generaron utilizando un método publicado previamente con la modificación [22]. Cinco MISSION® lentiviral partículas de transducción de codificación para shRNAs contra CD44 o CD147 y no son objeto de partículas de transducción de control shRNA MISSION® se utilizaron (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia) (Tabla S1). Brevemente, 2 x 10
4 células PC-3M-luc se cultivaron en placas de 24 pocillos y transducidas con los cinco clones de partículas lentivirales o la misma cantidad de partículas de transducción de no diana de control de shRNA siguiendo el protocolo del fabricante (multiplicidad de infección = 2, unidades de transducción virales /célula). Los clones transducidas se seleccionaron en medio de cultivo celular que contiene puromicina (0,5 mg /ml) (Invitrogen Australia Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australia), propagada y finalmente transferida a los 25 cm
matraces de cultivo de 2 células y se mantiene en un medio de que contiene 1,0 mg /ml de puromicina para los siguientes experimentos.
inmunofluorescencia confocal análisis de microscopía de PC-3M-luc y PC-3M-luc-KD líneas celulares
la tinción de inmunofluorescencia se realizó como se ha descrito previamente [23]. Brevemente, se fijaron las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio, se enjuagaron y se incubaron con diferentes anticuerpos primarios durante la noche (o /n) a 4 ° C: anticuerpo monoclonal CD44 anti-humano de ratón (MAb) (1:200 dilución), CD147 anticuerpo policlonal (PAB ) (1:100 dilución), MRP2 MAb (1:50 dilución), de conejo anti-humano MCT1 Pab (1:200 dilución) o MCT4 Pab (1:400 dilución). Después de aclarar en TBS, se incubaron las células durante 45 minutos en Alexa Fluor-488 de cabra anti-ratón o Alexa Fluor 488-IgG de cabra anti-conejo (1:1000 diluciones) a temperatura ambiente (RT). El yoduro de propidio (PI) (0,2 mg /L) se utilizó para teñir los núcleos. Controles negativos se tratan de manera idéntica, pero incubadas con el ratón o control de isotipo de conejo. La inmunofluorescencia fue visualizado utilizando un FV300 /FV500 Olympus escaneo láser confocal microscopio (Olympus, Tokio, Japón).
Western Blot análisis
niveles de expresión de proteínas se determinaron por análisis de transferencia de Western como se describe [24] . Brevemente, los lisados de células enteras fueron separados por NuPAGE Novex electroforesis en gel de Bis-Tris al 4-12% y después se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después del bloqueo de los sitios no específicos con leche descremada al 5%, la membrana se incubó con anticuerpos específicos a concentraciones apropiadas (Tabla 1), seguido de la incubación con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (de cabra anti-ratón o anti-cabra apropiada de conejo para la especie huésped de anticuerpo primario) (1:5000 dilución). Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando mayor quimioluminiscencia (ECL) sustrato (Pierce Chemical Co, Rockford, EE.UU.), y la imagen utilizando el sistema ImageQuant LAS4000 (GE cuidado de la Salud, EE.UU.). Para confirmar la igualdad de carga de lisados de proteínas, membranas fueron despojados (Restaurar Western Blot Stripping Buffer, Pierce) y se volvieron a sondar el uso de anti-ratón
β-tubulina
MAb (1:10000 dilución), luego se procesaron como anteriormente. Las imágenes fueron procesadas en Adobe Photoshop.
Co-inmunoprecipitación (IP) de ensayo
El lisado celular que contiene 200 mg lisados de células enteras de células PC-3M-luc, se incubó con 2 g de anti- CD44 o anticuerpos anti-CD147 (ABS) o suero normal (control Ig) o /n a 4 ° C. Los complejos inmunes se aislaron por precipitación usando proteína A /G PLUS-agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EE.UU.) durante 8 horas a 4 ° C. Las perlas se lavaron 4 veces en 1000
y g
se suspendieron en 20
μ
L de tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen Australia Pty Ltd, Australia), después se calentó a 100 ° C durante 5 minutos . Los extractos fueron entonces a inmunotransferencia con CD44 y CD147 anticuerpos primarios, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se detectó usando sustrato ECL. El análisis de imagen fue como se describió anteriormente (Western Blot).
MTT ensayo de respuesta DTX
Se llevaron a cabo ensayos de MTT como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con un intervalo de concentraciones (0,001 a 1000 nM) de DTX diluido en etanol al 100%, y un control del vehículo. Después de 72 h de incubación, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene 0,5 mg /ml de MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 4 h, los sobrenadantes se retiraron y el MTT formazano resultante solubilizado en DMSO y se mide espectrofotométricamente a 562 nm en un lector de microplacas BIO-TEK (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Los resultados representan la relación de la DO del DTX-células tratadas y tratadas con vehículo. La curva de inhibición del crecimiento se generó usando el programa GraphPad Prism 4 (GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.). Absoluta IC
50 valores se calcularon utilizando la intersección de la respuesta a los fármacos normalizaron 50% y las curvas de inhibición de crecimiento para cada línea celular, para encontrar los valores de x para los ejes en IC
50 DTX concentración (nM).
Formadoras de colonias ensayos
PC-3M-luc y células PC-3M-luc-KD se utilizaron para los ensayos de formación de colonias como se ha descrito anteriormente, con modificaciones menores [25]. Brevemente, 1500 células /placa se sembraron en placas de 10 cm durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO
2 y después se trata con una dosis fija de DTX en 3.5 nM de concentración final (media dosis de la IC más bajo
50 a partir del ensayo MTT en cuatro líneas de células de CaP) o el mismo volumen de control del vehículo (100% de etanol). Después del tratamiento de 3 días, los medios de comunicación que contiene DTX-se reemplazó con medio fresco y se incubaron todas las culturas durante otros 7 días hasta que las colonias eran lo suficientemente grandes como para ser claramente discernido. Las colonias, que se definen como grupos de & gt; 50 células, se puntuaron de forma manual con la ayuda de un Olympus INT-2 microscopio invertido (Tokio, Japón). El número medio de colonias se trazan (Media ± SD, n = 3).
se determinó Matrigel invasión de ensayo
capacidad invasiva de las líneas celulares de CaP usando matrigel comercial y controlar cámaras transwell (BD Bioscience , NSW, Australia). En resumen, 2 × 10
4 PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, las células PC-3M-luc-CD44-KD y PC-3M-luc-CD147-KD PAC en 500 l de suero libre medio se añadieron a cada transwell insertar y se añadió medio de 750 l completa a la bien exterior para proporcionar quimioatrayente y prevenir la deshidratación. Las células fueron incubadas a 37 ° C en 5% de CO
2 para 24 horas y después se tiñeron con un kit de tinción Diff-Quik (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, Illinois, EE.UU.). El exceso de colorante se eliminó por lavado con agua del grifo y el número de células teñidas que invadió a través de Matrigel o de control de las inserciones se contó en cinco campos de alta potencia (HPF) por microscopía óptica (microscopio Leica, Nussloch, Alemania). potencial invasor se calculó como sigue:% Invasion = [(Mean células que invaden a través de matrigel insertar la membrana) /(células que migran a través de la membrana de inserción promedio de control)] x 100%. las tasas de invasión celular se representaron, con media y SD (n = 3).
subcutáneas (sc) de xenoinjertos de modelos animales
Varón, 6-8 semanas de edad Balb /c ratones nude (Recursos Animales Centre, Australia occidental) fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Universidad de Nueva Gales del Sur (UNSW) Cuidado de Animales y Comité de Ética (ACEC) y las manipulaciones se llevaron a cabo en cabinas de flujo laminar. La ACEC específicamente aprobado este estudio (ID aprobación es de 10 /121A). Los ratones fueron mantenidos al menos 1 semana antes de la manipulación experimental. Todos los ratones se mantuvieron sanos y activos durante el experimento. Como se ha descrito anteriormente [26], culta PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD o PC-3M-luc-CD147-KD CaP células (1,5 x 10
6 /inyección) en 100 l DPBS se implantaron por vía subcutánea en la región derecha del flanco trasero de los ratones (n = 10 ratones /por grupo). La progresión tumoral se documentó semanalmente por mediciones con calibradores, y los volúmenes tumorales se calcularon de la siguiente manera: longitud x anchura x altura x 0,52 (en milímetros) [27] para un máximo de 8 semanas. Después del sacrificio, los tumores primarios y los ganglios linfáticos regionales locales se retiraron para el examen histológico.
respuesta DTX en CaP s.c. modelo animal
Después de establecer por vía subcutánea modelos con líneas celulares de CaP, cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó 30 ± 10 cm
3 en cada subgrupo (n = 10 /subgrupo), 5 ratones (n = 5) fueron tratados con 25 mg /kg DTX forma continua durante 3 semanas por ip inyección, y 5 ratones (n = 5) se trataron con control de vehículo (solución salina). El crecimiento del tumor se calculó mediante mediciones utilizando pinzas de freno, publicado [27].
tejidos de ratón y la histología
Todos los tejidos se fijaron en formol o bien se congelaron rápidamente. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) teñidas secciones fueron revisados para evaluar la estructura del tumor. xenoinjertos de tumor y los ganglios linfáticos regionales locales se recogieron al final de los experimentos y se procesaron para histología, inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL. Cinco micras secciones congeladas de muestras tumorales recientes se utilizaron para CD31 y CD44 inmunotinción.
La inmunohistoquímica
procedimientos estándar de inmunoperoxidasa se utilizaron para visualizar CD147, Ki-67, y la caspasa-3 (activo) como se publicó anteriormente [28]. Brevemente, las secciones de parafina fueron desparafinados y rehidratados, a continuación, se incubaron con anticuerpos primarios (ABS) anti-CD147 (1:200), Ki-67 (1:1000 dilución) y 3 caspasa-(dilución 1:100) (activo), respectivamente O /N a 4 ° C. Los portaobjetos se incubaron después con porcina anti-cabra, ratón, conejo biotinilado segundo anticuerpo IgG (1:150 dilución) durante 45 minutos a RT y con solución de estreptavidina /HRP (1:300 dilución) durante 30 minutos a TA. Las secciones se desarrollaron por fin con 3,3 'diaminobencidina solución de sustrato (DAB) (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia), entonces contraste con hematoxilina; células positivas aparecieron marrón. diapositivas de control se trataron de una manera idéntica, y el uso de Abs isotipo u omitiendo el anticuerpo primario como un control negativo.
CD44 y CD31 inmunotinción sobre secciones congeladas se realizó como se publicó previamente (28). Las secciones se incubaron con CD44 de ratón anti-humano (1:200 dilución) o rata anti-ratón CD31 MAb (1:100 dilución) o /n a 4 ° C. Las secciones se incubaron con anticuerpo de conejo anti-ratón /rata biotinilado IgG (1:200 dilución) durante 45 minutos a TA, y luego con /HRP (dilución 1:200) conjugado estreptavidina durante otros 30 minutos. Las secciones fueron desarrollados mediante el uso de solución de DAB (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia), y el contraste con hematoxilina. Para los controles negativos, las secciones se tiñeron con el mAb isotipo o con la omisión de los anticuerpos primarios.
ensayo de TUNEL de células apoptóticas
in vivo
La apoptosis se evaluó en los tejidos de xenoinjertos de tumores utilizando el método de TUNEL con el TdT-fragel in situ kit de detección de apoptosis (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La especificidad de la reactividad se confirmó con TUNEL negativa apropiada (TdT omitido de la mezcla de marcaje) y positivos (HL-60 tratadas diapositivas proporcionadas por la empresa) controles. Las láminas fueron examinadas usando un microscopio Leica luz (Nussloch, Alemania).
Evaluación de la inmunotinción
intensidad de la tinción (0-3) se evaluó mediante microscopía de luz (Leica, Alemania) y un objetivo x40 . Los criterios utilizados para la evaluación se informó anteriormente [29], donde: 0 (negativo, & lt; 25%); 1+ (débil, 25-50%); 2+ (moderada, 50 a 70%); 3+ (fuerte, & gt; 75%) de las células tumorales teñidas. Evaluación de la tinción de tejidos se realizó, independientemente, por tres observadores experimentados (JH, JB y il). Todas las muestras se puntuaron ciegas y fue tomada un promedio de calificaciones.
El análisis estadístico
Todos los datos numéricos se expresaron como la media de los valores obtenidos, y la desviación estándar (SD) se calculó. Los datos de los diferentes grupos se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas. Todos los
P
valores fueron de 2 caras. Se realizó el análisis estadístico de la inmunotinción intensidad en xenoinjertos de animales como se describe en una publicación reciente [28]. ANOVA de una vía, seguido de la prueba post hoc de Dunnett se realizó para determinar la significación de las diferencias entre las curvas de crecimiento en s.c. modelo para los cambios de volumen del tumor.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. Todos los análisis estadísticos numéricos se realizaron con el paquete GraphPad Prism 4.00 (GraphPad, San Diego, CA).
Resultados
La expresión de CD44, CD147, MCT4 y MRP2 en CD44 o CD147-KD y control líneas celulares
líneas de células PC-3M-luc-scr CaP PC-3M-luc y mostraron una fuerte tinción positiva para CD44, CD147, MCT4 y MRP2 (Fig. 1A). Después de CD44 derribar, la reducción en la expresión de CD44 también se asoció con una reducción concomitante en los niveles de expresión de CD147, MCT4 y MRP2 (Fig. 1A). Del mismo modo, después de eliminar a CD147, los niveles de expresión de CD147 se redujeron y una reducción concomitante en los niveles de expresión de CD44, MCT4 y MRP2 también se observó (Fig. 1A). No tinción detectable se observó en las células incubadas con controles de isotipo (datos no mostrados). Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia en diferentes líneas celulares de CaP se resumen en la Tabla 2. Los resultados de inmunofluorescencia para la expresión de CD44, CD147, MCT4 y MRP2 en líneas celulares de CaP fueron confirmados por Western Blot (Fig. 1B). lisados de células PC-3M-luc también se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-CD44, anticuerpo anti-CD147 o suero normal (Ig), y a inmunotransferencia con CD44 y CD147 Abs (Fig. 1C). Tanto CD44 (90 KDa) y CD147 se detectaron (~ 50 kDa) en bandas de anti-CD44 y anti-CD147 lisados IP anticuerpo respectivamente, pero no en la Ig precipitaron lisado.
imágenes confocales representativos de CD44, CD147 , MCT4 y MRP2 inmunofluorescencia (verde) después de eliminar a CD44 o CD147 (A). Los núcleos se tiñeron con PI (rojo). Ampliación: todas las imágenes × 400. transferencia de Western representativo se muestra para confirmar la tinción de inmunofluorescencia (B). β-tubulina se utilizó como control de carga. scr: revuelto de control shRNA. PC-3M-luc lisados de células inmunoprecipitadas con anti-CD44, anti-CD147 anticuerpo, y el suero normal (Ig) seguido de inmunotransferencia con anticuerpos o bien CD147 CD44 o (C). IB: inmunotransferencia; IP:. Inmunoprecipitación
Knock abajo de CD44 o CD147 sensibiliza a las células monocapa gorra para el tratamiento DTX
in vitro
KD (PC-3M-luc -KD-CD44 y PC-3M-luc-KD-CD147) y control (PC-3M-luc y PC-3M-luc-SCR) líneas de células de CaP con diferentes niveles de expresión de CD44 y CD147 respondió de manera diferente a DTX tratamiento. El IC
50 valores (la dosis para la obtención de la muerte celular 50%) fuertemente correlacionada con los niveles de CD44 y CD147 expresión (Fig. 2A). En consecuencia, las células de control PC-3M-luc y PC-3M-luc-SCR (altos niveles de CD44 y CD147) fueron los menos sensibles (IC
50: 118 y 104 nM, respectivamente), mientras que PC-3M-luc -CD44-KD células y PC-3M-luc-CD147-KD (niveles bajos de CD44 y CD147) eran muy sensibles al tratamiento DTX (IC
50: 7 y 19 nM, respectivamente). Diferencias significativas (
P Hotel & lt; 0,05) en el CI
50 se observó entre el PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD células y PC-3M-luc células /PC-3M-luc-SCR.
PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD y PC-3M-luc-CD147-KD CaP las células tratadas con DTX (0.001-1000 nM) mostraron respuesta variable. La sensibilidad de las células CD44 /CD147-KD a diferentes concentraciones de DTX comparación con los controles fue obviamente aumentó mediante el ensayo de MTT (A) (
P
& lt; 0,01). Cuatro líneas de células de CaP se sembraron en placas de 10 cm y se trataron con una dosis DTX fija (3,5 nM) durante 3 d. Después del tratamiento, las células se cultivaron en medio de crecimiento para 7 d. Los resultados se presentan como el número de colonias formadas. imágenes típicos se muestran para el crecimiento de colonias en las líneas celulares de CaP tratados con VC o DTX (B). Los resultados típicos de sensibilidad DTX en colonias de líneas de células de CaP se muestran (C): "▴" indica que no hay diferencia significativa en el número medio de colonias entre las células tratadas DTX y VC células tratadas en PC-3M-luc /PC-3M- líneas celulares Luc-SCR (
P
≥0.05); "○" indica una diferencia significativa en el número medio de colonias entre las células tratadas DTX y VC células en líneas /PC-3M-luc-CD147-KD células PC-3M-luc-CD44-KD (tratado
P
& lt; 0,05); líneas celulares "Δ" indica una diferencia significativa en el número medio de colonias entre las células tratadas DTX en PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD y VC células en PC-3M-luc /PC tratados líneas celulares -3M-luc-SCR (
P Hotel & lt; 0,05). ensayo de invasión de Matrigel se utilizó para estudiar el cambio en el potencial de invasión en el PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR y células PC-3M-luc-CD44 /CD147-KD. potencial invasivo se redujo significativamente a 25% y 50% en PC-3M-luc-CD44-KD y PC-3M-luc-CD147-KD, respectivamente, en comparación con 69% y 64% en PC-3M-luc y PC-3M -luc-scr, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,01) (D). Imágenes representativas de microscopía de luz para la invasión de células tapa (E). Cuatro moléculas de transducción de señales (p-Akt, Akt-t, p-ERK y t-ERK) fueron evaluados para investigar la relación entre CD44, CD147 y vías de señalización celular. Los niveles de p-Akt y p-Erk se redujeron en líneas celulares de KD en comparación con el de tipo salvaje y los controles SCR. Los resultados representativos se muestran (F). Todos los resultados fueron de tres experimentos independientes (Media ± SD, n = 3). DTX: docetaxel; KD: derribar; p-Akt: fosforilada Akt-; p-Erk: fosforilados-Erk; scr: revueltos control de shRNA; t-Akt: Total-Akt; t-Erk: Total-Erk; VC: control del vehículo; * Indica 0,01 & lt;
P Hotel & lt; 0,05; ** Indica 0,001 & lt;
P Hotel & lt; 0,01; *** Indica
P Hotel & lt; 0,001
Knock abajo de CD44 o CD147 reduce la capacidad clonogénico y sensibiliza colonias gorra para el tratamiento DTX
Para investigar si KD. de CD44 y CD147 afecta a la clonogenicidad de ya sea solo o combinado con un tratamiento DTX, se evaluó KD y las células de control de CaP en cultivo. El número de colonias se redujo significativamente, ya sea con el control del vehículo o con tratamiento DTX en PC-3M-luc-CD44 o células CD147-KD en comparación con las células PC-3M-luc-Scr PC-3M-luc o, mientras que no hubo significativo diferencia (
P
≥0.05) entre el número de colonias generadas a partir de PC-3M-luc y las células PC-3M-luc-Scr. Diferencias significativas (
P
& lt; 0,05) en el número medio de colonias se observó 1) entre DTX células tratadas y VC células en PC-3M-luc-CD44-KD /CD147-KD líneas celulares tratados; 2) entre DTX tratada células PC-3M-luc-CD44 /CD147-KD-KD y VC tratado células PC-3M-luc /PC-3M-luc-scr. Imágenes representativas se muestran en la Fig. 2B. La respuesta DTX en líneas de células CD147-KD PC-3M-luc-CD44 o era mayor que para las líneas celulares PC-3M-luc-SCR (Fig. 2C) PC-3M-luc y. El clonogenicidad (colonias promedio DTX-tratada /colonias de control tratados con vehículo promedio%) fue del 89%, 84%, 56% y 74% para la PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-LUC- CD44-KD, y PC-3M-luc-CD147-KD líneas celulares, respectivamente
Knock abajo de CD44 o CD147. reduce la invasión de células de CaP
Después de derribar CD44 o CD147, la invasión de células se redujo significativamente tanto para PC-3M-luc-CD44-KD (
P Hotel & lt; 0,001) y las células PC-3M-luc-CD147-KD (
P Hotel & lt; 0,01) en comparación con PC-3M-luc y control de las células PC-3M-luc-SCR (Fig. 2D). Un relativamente mayor reducción de la capacidad de invasión se encuentra en las células PC-3M-luc-CD44-KD que en las células PC-3M-luc-CD147-KD (Fig. 2D). La invasión porcentual para PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD y las células PC-3M-luc-CD147-KD era 70%, 62%, 22% y 47 % respectivamente (Fig. 2D). Imágenes representativas para cada línea celular se muestran en la Fig. 2E.
PI3K /Akt y MAPK /ERK vías de señalización están relacionados con la expresión de CD44 y CD147 en las células de CaP
Después de derribar CD44 o CD147, se encontró que la expresión de p- Akt y Erk-p fueron regulados a la baja tanto en las células PC-3M-luc-CD44 o CD147-KD en comparación con PC-3M-luc y control de las células PC-3M-luc-scr, con una reducción más significativa en el PC-3M-LUC- células CD44-kD; no hubo ningún cambio obvio en t-Akt y Erk la expresión t-en todas las líneas celulares de cabeza (Fig. 2F).
Knock abajo de CD44 o CD147 afecta tumorigenicidad, las metástasis de los ganglios linfáticos y la sensibilidad DTX en un s.c. modelo de xenoinjerto
Tal como se muestra en los gráficos de crecimiento tumoral en la Fig. 3A, en comparación con el control de scr, las mediciones semanales de CD44 y CD147 KD xenoinjertos, tratados ya sea con el control del vehículo (VC) o DTX (25 mg /kg), mostraron una tasa de crecimiento del tumor reducido significativamente en ambos VC (
P
& lt; 0,05) y los grupos tratados con DTX (
P Hotel & lt; 0,05) (en los paneles izquierdo y central al). No hubo diferencias significativas en la tasa de crecimiento de los tumores de tipo salvaje y PC-3M-luc-scr xenoinjertos PC-3M-luc en cualquiera de CV o DTX grupos tratados (
P Hotel & gt; 0,05). En los xenoinjertos tratados con VC, una regresión ligeramente más fuerte del crecimiento tumoral se observó en xenoinjertos de CD44 KD en comparación con los xenoinjertos de CD147 KD, mientras que no se encontró ninguna diferencia obvia entre el crecimiento de CD44 KD y CD147 KD tumores (
P
& gt; 0,05). En los xenoinjertos tratados con DTX, los xenoinjertos de tumores de las cuatro líneas de células de CaP tenían volúmenes tumorales más pequeños en comparación con los xenoinjertos tratados con VC correspondiente en todos los puntos de tiempo (
P
& lt; 0,05). Un poco más la regresión del tumor se observa en xenoinjertos de CD44-KD tratados con DTX, pero no se encuentra ninguna diferencia significativa entre las curvas de crecimiento CD147-CD44 KD-KD y (
P
& gt; 0,05). Además, se comparó la relación de los volúmenes tumorales entre DTX y VC xenoinjertos tratados (DTX /VC) (Fig. 3A, panel derecho). La relación de los volúmenes tumorales CD147-CD44 KD-KD y (DTX /VC) disminuyó más rápido en respuesta a DTX o tratamiento VC, lo que sugiere que la KD de cualquiera de CD44 o CD147 puede inducir la supresión del desarrollo de tumores, en comparación con el de tipo salvaje y scr escriba xenoinjertos.
curvas de crecimiento tumoral para PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc -CD44-KD y PC-3M-luc-CD147-KD xenoinjertos se muestran ya sea con VC (el gráfico de la izquierda) o con tratamientos DTX (la trama en el medio). La relación de DTX tratados frente a VC tratado volúmenes de los tumores (DTX /VC) fue trazado desde el principio del tratamiento hasta el final del experimento (que se muestra en el diagrama de la derecha) (A). Al final de los experimentos, el peso del tumor de PC-3M-CD44-KD y 3M-luc-CD147-KD PC ratones grupo fue obviamente reducido en comparación con que a partir de PC-3M-luc y los ratones del grupo de PC-3M-luc-Scr con el CV y tratamientos DTX (
P Hotel & lt; 0,05) (B). Imágenes representativas de tamaños de los tumores y metástasis de ganglios linfáticos de diferentes grupos y tratamientos se muestran (C). DTX: docetaxel; KD: derribar; scr: revueltos control de shRNA; VC: el control del vehículo. * Indica 0,01 & lt;