Extracto
Antecedentes
La vitamina factor de activación de la proteína de unión-macrófago D ( DBP-maf) es un potente inhibidor del crecimiento tumoral. Su actividad, sin embargo, se ha atribuido a los mecanismos indirectos, tales como aumentar la respuesta inmune mediante la activación de los macrófagos y la inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos necesarios para el crecimiento de tumores.
métodos y las conclusiones
En este estudio se muestra por primera vez que los objetos expuestos DBP-maf un efecto directo y potente sobre las células tumorales de próstata en ausencia de macrófagos. DBP-maf actividad inhibidora se demuestra en los estudios de proliferación de ambas líneas celulares de cáncer de próstata PC3 y LNCaP, así como clones metastásico de estas células. La citometría de flujo estudios con anexina V y yoduro de propidio mostró que esta actividad inhibitoria no se debe a la apoptosis o muerte celular. DBP-MAF también tenía la capacidad de inhibir la migración de células de cáncer de próstata
in vitro
. Finalmente, DBP-maf fue mostrado para causar una reducción en la uroquinasa del receptor del activador de plasminógeno de expresión (uPAR) en las células tumorales de próstata. Hay pruebas de que la activación de este receptor se correlaciona con la metástasis tumoral.
Conclusiones
Estos estudios muestran una fuerte actividad inhibidora de DBP-maf en las células tumorales de próstata independiente de su activación de los macrófagos.
Visto: Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. Proteína-macrófago (2010) La vitamina D Binding Factor de Activación directamente inhibe la proliferación, migración, y uPAR expresión de las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10.1371 /journal.pone.0013428
Editor: José Najbauer, Nacional City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2010; Aceptado 10 de septiembre de 2010; Publicado: 18 Octubre 2010
Copyright: © 2010 Gregory et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa (DOD) PC030286 subvención e Investigación para Prevención de la Ceguera Challenge Grant. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proteína de unión a vitamina D (DBP) es la principal transportadora de la vitamina D en la sangre. Tiene un peso molecular entre 52 a 59 kDa y se encuentra en el torrente sanguíneo a un nivel entre 300 a 600 mg /ml [1], [2]. DBP es la molécula matriz de DBP-maf [3]. DBP-maf es el producto de desglicosilación selectiva de DBP y se ha demostrado ser una molécula antiangiogénica y antitumoral potente [4] - [6]. Hemos demostrado previamente en un modelo de ratón con xenoinjerto que DBP-maf es un potente inhibidor de los tumores pancreáticos humanos y que su capacidad de inhibir el crecimiento del tumor
in vivo
es debido, en parte, a sus propiedades antiangiogénicas [4] . En ese estudio, se demostró que DBP-maf es antiangiogénico basado en la reducción de los vasos en la membrana corioalantoidea de pollo, y basado en reducción de la densidad de microvasos en los tumores. Se ha sugerido en otros estudios que sus mecanismos antitumorales primaria son inmunológica, debido a su activación de los macrófagos. Los estudios clínicos recientes por Yamamoto
et al
han demostrado actividad antitumoral potente, así como la actividad contra el VIH [7] - [10]. Esta actividad se midió como una función de reducción de los niveles séricos de la enzima α-N-acetilgalactosaminidasa (Nagalase). Nagalase desglicosilación de DBP evita que los macrófagos de activación y, por tanto, suprime la respuesta inmune [11]. El mecanismo básico propuesto en todos los casos es en gran medida la activación de los macrófagos y las consiguientes respuestas inmunes. En el VIH, se ha sugerido que la presentación de antígenos defectuoso es un factor en la deficiencia inmune [12]. La presencia de Nagalase elevada en el plasma de pacientes con VIH sugiere que la activación de los macrófagos se puede inhibir en estos pacientes [13]. Además, Nagalase ha demostrado ser un componente intrínseco de una proteína de la envoltura promover la fusión para el inicio de la infección [11]. También se encontró que la concentración plasmática de Nagalase en pacientes con lupus eritematoso sistémico a ser elevados. En el lupus, los autoanticuerpos forman complejos inmunes patógenos y se depositan en los tejidos. El aclaramiento de estos complejos por los macrófagos se inhibe si la activación de los macrófagos se interrumpe [14]. Las células cancerosas se han demostrado para producir Nagalase [15] y las concentraciones elevadas en suero han sido registrados en un número de pacientes con cáncer que sufren de melanoma [16], de próstata, colorrectal, y cáncer de mama metastásico [7] - [9]. Una comprensión profunda de la actividad DBP-maf aún no se ha alcanzado, pero su potencial como una terapia antiangiogénica e inmunogénica está claro
Cuatro de próstata se utilizaron las líneas celulares de cáncer en este estudio con el fin de incluir.; el andrógeno sensible (LNCaP) y las líneas (PC3M) insensibles, así como líneas altamente metastásicas (LNCaPLN3 y PC3MLN4) derivados de cada línea parental, respectivamente.
La capacidad de DBP-maf tener un efecto directo sobre no se ha informado de las células tumorales. En este estudio se investigó el papel de DBP-maf en la inhibición directa de actividades tales como la proliferación, la migración, y la expresión de uPAR que están relacionados con el crecimiento tumoral y la metástasis.
Materiales y Métodos
Síntesis de DBP-maf
(a) Preparación de perlas (1-3) β-D-galactosidasa-agarosa.
Preparación de perlas se realizó utilizando una modificación del método de Yamamoto
et al
[17]. perlas activados con bromuro de cianógeno (0,5 g) se lavaron con HCl 1 mM (3X, 10 ml por lavado) mediante filtración por succión. A continuación, las perlas se lavaron con agua DDI y se resuspendieron en 2 ml de tampón de acoplamiento (0,1 M NaHCO
3, 0,5 M NaCl, pH 8,3). se añadió (1-3) β-D-galactosidasa (1000 unidades) a la /tampón de acoplamiento perlas y luego se agitó con un mezclador de encima y por debajo durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las perlas se lavaron con tampón de acoplamiento y se resuspendieron en tampón de bloqueo (tampón de acoplamiento más 0,2 M glicina). La suspensión se agitó durante la noche a 4 ° C. A continuación, las perlas se lavaron con tampón de acoplamiento, seguido de acetato de sodio 0,1 M, 0,5 M NaCl, pH 4,0, y los lavados se repitieron durante un total de cuatro veces. Las perlas se lavaron con un lavado final de tampón de acoplamiento entonces se centrifugaron y se resuspendieron en 1,0 M NaCl.
(b) Determinación de (1-3) β agarosa-D-galactosidasa-actividad de talón.
Determinación de la actividad del grano se realizó utilizando una modificación del método de Yamamoto
et al
[17]. Con el fin de determinar la actividad de las perlas (1-3) β-D-galactosidasa-agarosa, 50 l de la suspensión de perlas se añadieron a 0,95 ml de tampón de ensayo /sustrato cromogénico (PBS, 3 mM 2-nitrofenil-β- D-galactopiranósido, 10 mM MgCl
2, 0,1 mM β-mercaptoetanol), y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. La reacción se detuvo con 33 l de carbonato de sodio 1 M y la absorbancia se midió a 405 nm. La actividad se expresó como unidades /ml de suspensión de perlas, en donde 1 unidad se define como el número de mol de p-nitrofenol formado por minuto. Una capacidad de absorción molar de 18380 L /mol cm, y una longitud de recorrido de 0,25 cm que corresponden a un volumen de 200 l en una placa de 96 pocillos se utilizaron para calcular la concentración de p-nitrofenol.
(c) La desglicosilación de DBP con perlas (1-3) β-D-galactosidasa-agarosa.
desglicosilación de DBP se realizó utilizando una modificación del método de Yamamoto
et al
[17]. DBP (Calbiochem, San Diego, CA) se añadió a una concentración final de 0,05 mg /ml en PBS pH 6,0, MgCl 10 mM
2, con 0.007 U de (1-3) β-D-galactosidasa-agarosa y se 0.004 U de neuraminidasa-agarosa (Sigma, St. Louis), y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El volumen total de reacción fue de 1 ml. Las perlas se sedimentaron por centrifugación y se eliminan. DBP-maf se almacenó en alícuotas a -20 ° C.
DBP-maf péptido
Un péptido de 14 aminoácidos DBP-maf se sintetizó (Ana Spec, Fremont, CA) con el amino secuencia de ácido: Ac-TPTELAKLVNKRSE. La pureza fue & gt;. 90%
Cultivo de células
PC3M, PC3MLN4, las células LNCaP y LNCaPLN3 fueron amablemente proporcionados por el doctor Curtis Pettaway y el Dr. Isaías J. Fidler (MD Anderson Cancer Center ). La línea celular PC3M fue aislado de metástasis hepáticas producidas en ratones desnudos posteriores a la inyección intraesplénica de la línea de andrógenos insensible PC3 humano de células de carcinoma de próstata [18]. Las sublíneas metastásicos, PC3MLN y LNCaPLN, se crearon mediante la inyección de las células parentales ortotópicamente en el lóbulo dorsal de la próstata de ratones desnudos y el cultivo de las células que habían metástasis en el ganglio linfático centinela (paraaortic). Después del cultivo durante 3-5 pasajes, se volvieron a inyectar estas células en la próstata de ratones desnudos posteriores. Este proceso se repitió durante 3 ciclos para crear la línea metastásico, LNCaPLN3 y durante cuatro ciclos para crear la línea metastásico, PC3MLN4 [18]. Todas las células tumorales se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen) con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U /ml) /estreptomicina (100 mg /ml) y L-glutamina y se incuban a 37 ° C, 10% CO
2.
fosfatasa ácida ensayo colorimétrico
a la conclusión de cada experimento, las células se lavaron en PBS y luego 450 l de tampón de fosfatasa ácida (10 mM de fosfato de p-nitrofenol, 0,1 M acetato de sodio, 0,1% de Triton X-100, pH 5,8) se añadieron a cada pocillo. Las células se incubaron a 37 ° C durante 45 minutos. Cincuenta l de NaOH 1 N se añadieron a cada pocillo para detener la reacción y se midió la absorbancia a 405 nm [19], [20]. El número de células de cada tipo de célula se calibró con la absorbancia usando un hemocitómetro para asegurar que los niveles de fosfatasa ácida correlacionados de forma lineal con número de células. Los análisis y trazado para todos los ensayos se realizaron utilizando Origen Pro 8 (Northampton, MA).
ensayos de migración celular
Migración ensayos se realizaron utilizando un modificadas insertos de cultivo de Boyden cámara de Millicell (Millipore, Billerica, MA) con 8 micras poros [20] - [22]. membranas superiores se pre-incubaron durante la noche con fibronectina (10 mg /ml en PBS), que se aspiró de los pocillos de la mañana siguiente. Las células (150.000 células /pocillo) se sembraron en medio basal with.010% de gelatina, con o sin DBP-maf o DBP. Algunos pocillos de muestras se tiñeron a la finalización del período de incubación para asegurar que la adhesión celular en las membranas superiores fue uniforme en todas las condiciones. El medio basal se añadió a pocillos de fondo con o sin 10% de FBS. Las células se incubaron durante seis horas a 37 ° C, 10% de CO
2. Las células que no migraron se retiraron de la parte superior de la membrana y las células migradas se cuantificaron usando un ensayo colorimétrico de la fosfatasa ácida.
Ensayos de proliferación
Las células tumorales se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen) con 10% de FBS, penicilina /estreptomicina y L-glutamina y se incubaron a 37 ° C, 10% de CO
2. Las células se trataron con tripsina y se añadieron a placas de 24 pocillos (5.000 células /pocillo) en 0,5 ml de medio de cultivo. Las células se privaron de suero durante la noche a continuación, se reemplazó el medio con RPMI 1640, 1% FBS, penicilina /estreptomicina y L-glutamina y se incubó durante 72 horas con o sin DBP-maf o PAD [23]. La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico de la fosfatasa ácida [4], [23].
La citometría de flujo
Las células fueron cultivadas a ~ 80% de confluencia en 100 mm
2 platos. Las células fueron tratadas con o sin DBP-maf (1 mg /ml) y se incubaron a 37 ° C durante 48 horas. Las células se tripsinizaron, se centrifugaron, se dividió en alícuotas en tubos y se marcaron con anexina V y yoduro de propidio utilizando un kit de detección de apoptosis (APOAF, Sigma, St. Louis, MO). Anexina V y PI tinción se realizaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. La citometría de flujo análisis se realizó utilizando un clasificador de células Cytomation MoFlo siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RTqPCR)
ARN total fue extraído a partir de células humanas utilizando Trizol reactivo (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y fueron tratados con DNasa libre de RNasa (Ambion). La integridad del ARN y la calidad se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y las concentraciones se determinaron por espectrofotometría (NanoDrop espectrofotómetro 1000 V3.7, ThermoFisher Scientific). El ARN total (1 g) fue transcrito inversa como se describe anteriormente [24] utilizando ADNc qScript Supermix (Quanta Biosciences). Los productos de RT (ADNc) se amplificaron por cuantitativos (Fast Real-Time PCR sistema de Applied Biosystems 7900 HT) PCR en tiempo real con Mix Master SYBR verde de alimentación. Los cebadores de oligonucleótidos específicos para uPAR humana variante 1 (Banco de Genes adhesión n ° NM-002659, hacia adelante 5'CAACGAGGGCCCAATCCT 3 'y revertir 5'-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3'), uPAR variante 2 (Banco de Genes adhesión n ° NM-001005376, delantero 5 '- CAACGAGGGCCCAATCCT 3' y revertir 5'CACTGGCGGCCATTCTG -3 '), uPAR variante 3 (Banco de Genes adhesión n ° NM-001005377, hacia adelante 5'GCCGTTACCTCGAATGCATT 3' y revertir 5'GGCCCCTCTCACAGCTCAT -3 '), y 18S rRNA (hacia adelante 5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 'e inverso 5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3') se utilizaron. Las condiciones de los ciclos eran QPCR 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de un programa de amplificación de dos etapas (95 ° C durante 15 s y 58 ° C durante 1 min). Al final de la amplificación, se aplicó análisis de la curva de fusión utilizando el protocolo de disociación del sistema de detección de secuencia para excluir la contaminación con productos de PCR inespecíficos. Los productos de PCR también fueron confirmadas por gel de agarosa y mostraron solamente una banda específica del tamaño predicho. Para los controles negativos, no hay productos de RT se utilizan como plantillas en la QPCR y no se detectó ninguna banda en el gel.
Las expresiones relativas de los genes diana se determinaron por el 2
-ΔΔCt método [25]. Las células no tratadas se eligieron como los calibradores.
Immunoblotting
Immunoblotting se realizó utilizando una modificación del método de Besch
et al
[26]. Las células se cultivaron en 100 mm
2 platos y cultivadas a ~ 80% de confluencia y luego privaron de suero-durante la noche. El medio se reemplazó con RPMI (1% de FBS). Se añadieron DBP o PAD-maf a las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 24 o 72 horas a 37 ° C después se lisaron usando tampón de HTG (20 mM HEPES, pH 7.4,10% de glicerol, 1% Triton X-100) y se recogieron usando un rascador de células. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) se añadió (100 m). Los lisados se separaron usando SDS-PAGE. Los carriles se normalizaron mediante la carga igual de proteínas (40 g /carril). Los niveles de proteína se determinaron usando un ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Las bandas se transfirieron a una membrana PVDF. La membrana se bloqueó durante la noche en leche en polvo no grasa al 10% y 0,10% de Tween 20 en PBS. La membrana se hibridó con un anticuerpo anti uPAR (Santa Cruz, CA), seguido por hibridación con un anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rábano picante y se visualizó usando quimioluminiscencia. Vinculina se utilizó como control de carga.
El análisis estadístico
El efecto de DBP-maf se probó por separado para los ensayos de migración celular y la proliferación. Se utilizó una prueba t de una cara para medir la significación estadística de las reducciones de crecimiento del tumor en varios niveles. Se utilizó una prueba Z de dos caras para medir el efecto de la PAD-maf en la apoptosis o necrosis. Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico SAS versión 9.1 (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte) y un
P-valor
≤0.01 se utilizó para identificar la significación estadística.
Resultados
DBP-maf inhibe la migración de las células tumorales
la invasión y la migración de las células tumorales son pasos importantes en el crecimiento del tumor y la metástasis. DBP-maf se ensayó para determinar su efecto sobre la migración de células en cuatro tumor líneas- dos líneas de próstata parental cáncer (LNCaP y PC3M) y dos clones metastásico de estas líneas (LNCaPLN3 y PC3MLN4), utilizando una cámara de Boyden modificada. El nivel basal de la migración entre cada línea parental y su respectivo clon metastásico se mantuvo sin cambios. En todas las dosis probadas, no se observó inhibición de la migración (Figura 1).
LNCaP (A), se añadieron las células (D) LNCaPLN3 (B) PC3M (C) o PC3MLN4 (150.000 /pocillo) a la cima de la cámara de una cámara de Boyden modificada (+/- DBP-maf) con 10% de FBS en la cámara inferior. Después se retiraron 6 horas las células que no habían migrado y las células restantes se cuantificaron usando un ensayo de la fosfatasa ácida. Los resultados fueron normalizados a controlar. Los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces y se muestra como error +/- SD. En comparación con el crecimiento celular sin DBP-maf, la adición de DBP-maf tenían una reducción global estadísticamente significativa de la migración celular en 30% (P = 0,0003) para los cuatro tipos de células tumorales combinados. las tasas de reducción significativa individuales fueron encontrados con cada uno de estos tipos de células tumorales. Comparado con el control, la reducción significativa se observó con DBP-maf en (A) 20% P = 0,0022 (B) 20% P = 0,0029 (C) 10% P = 0,0045 (D) 30% P = 0,0094. n = 3.
Un péptido DBP-maf inhibe la migración de células tumorales
La preparación de DBP-maf implica procesos enzimáticos de varios pasos. La desglicosilación selectiva es un paso necesario en el proceso porque la expresión de DBP-maf en E. coli produce una proteína sin actividad [4]. Una versión activa, pero más fácilmente formulado de la molécula haría que la fabricación de DBP-maf más fácil y menos caro. Por estas razones un péptido DBP-maf se sintetizó usando una secuencia de la molécula de partida que se había mostrado actividad en otros estudios [27]. El péptido fue probado para determinar su potencial para inhibir la migración de células tumorales. Como se muestra en la Figura 2, el péptido mostró capacidad significativa para inhibir la migración de todas las líneas tumorales. El efecto inhibitorio no aumentó en dosis más altas, lo que sugiere su IC
50 fue menor que el rango de dosis probado.
LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) o PC3MLN4 (D) se añadieron células (150.000 /pocillo) a la cámara superior de una cámara de Boyden modificada (+/- DBP-maf) con 10% de FBS en la cámara inferior. Después se retiraron 6 horas las células que no habían migrado y las células restantes se cuantificaron usando un ensayo de la fosfatasa ácida. Los resultados fueron normalizados a controlar. Los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces y se muestra como error +/- SD. En comparación con la migración sin DBP-maf, la adición de DBP-maf tenían una reducción estadísticamente significativa de la migración en un 40% (P & lt; 0,0001) para la combinación de los cuatro tipos de células tumorales. las tasas de reducción significativa individuales fueron encontrados con cada uno de estos tipos de células tumorales. Comparado con el control, la reducción significativa se observó con DBP-maf en (A) 30% P = 0,0038 (B) 40% P = 0,0016 (C) 20% P = 0,0038 (D) 40% P = 0,0005. n = 3.
DBP-maf inhibe la proliferación de células tumorales
Las cuatro líneas celulares fueron analizadas para determinar su sensibilidad a la DBP-maf en estudios de proliferación. Como se muestra en la Figura 3A, DBP-maf a 1 mg /ml proliferación reducida a los niveles basales o por debajo de todas las líneas celulares con la excepción de PC3M. Era interesante que, aunque las células PC3M no fueron sensibles a DBP-maf en este ensayo, la PC3MLN4 clon metastásico había desarrollado la sensibilidad a la misma.
LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) o PC3MLN4 células (D) se sembraron en placas de 24 pocillos durante la noche, luego medio +/- DBP-maf se añadió con FBS al 1%. Después de 72 horas las células se cuantificaron usando un ensayo de la fosfatasa ácida. Los resultados fueron normalizados a controlar. Los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces y se muestra como error +/- SD. Comparado con el control, la reducción significativa se observó con DBP-maf en (A) 50% P = 0,0001 (B) 50% P = 0,0001 (C) una reducción significativa (D) 40% P = 0,0073. n = 3.
A 1 mg /ml, DBP-maf tuvo una reducción estadísticamente significativa del crecimiento de células en 40% (P = 0,0073) para la combinación de todos los tipos de células tumorales. tasas significativas de reducción individuales (sin DBP-maf vs.1 g /ml) también fueron encontrados entre estos tipos de células tumorales excepto PC3M en el que no se encontró una reducción significativa (Figura 3).
estudios de proliferación utilizando el DBP- péptido maf no mostró reducción en la proliferación de cualquiera de las líneas celulares (datos no mostrados). Esto sugiere que la capacidad de inhibir la migración y la proliferación puede residir en áreas distintas de la proteína y que esta secuencia peptídica puede tener ningún papel en la inhibición de la proliferación. También es posible que el sitio responsable de la actividad DBP-maf completo es más complejo y requiere la secuencia desglicosilada selectiva de la proteína que esté presente.
Con el fin de determinar si la inhibición de la proliferación de células tumorales se debe a la muerte celular o apoptosis, citometría de flujo El análisis se realizó utilizando marcadores de yoduro de propidio y anexina V. Estos estudios no mostraron evidencia de cualquiera de muerte celular significativa o la toxicidad resultante de células MAF-DBP tratadas (Tabla 1) y, con la excepción de la línea parental PC3M, mostró una reducción.
RT-PCR muestra una reducción de la expresión de uPAR en las células tratadas con DBP-maf
La expresión del receptor de uroquinasa plasminógeno activador (uPAR) se ha demostrado que se correlaciona con el aumento de la metástasis en las células tumorales [28] - [30] y con resistencia a los medicamentos [31] (para revisión ver [32]). RT-PCR se realizó en todos los tipos de células usando tres isoformas conocidas de precursores de uPAR, incluyendo el receptor soluble, la isoforma 2 (ver Métodos). Como se muestra en la Figura 4D, se observó reducción de la expresión de ARN para LNCaPLN3 en presencia de DBP-maf tanto a 0,001 y 1 mg /ml de DBP-maf para ambas isoformas uPAR2 uPAR1 y. Las isoformas uPAR2 y uPAR3 mostraron una reducción similar de la expresión con el tratamiento DBP-maf de células PC3M. Curiosamente, aunque las células PC3MLN4 no mostraron respuesta significativa a DBP-maf (Figura 5D), hubo una reducción estadísticamente significativa de uPAR2 con DBP en 1 mg /ml. En casi todas las condiciones examinadas, después de 72 horas los niveles de uPAR habían vuelto a los valores de control (datos no mostrados). El péptido también se ensayó usando la línea celular (LNCaPLN3), que era activa en todos los ensayos y (PC3M), que era activo en la migración, pero no en la proliferación. Ellos mostraron ningún cambio significativo en cualquiera de los niveles de isoformas de uPAR con el péptido (Figura 6A y 6B). Las líneas tumorales se ensayaron después para observar el efecto de DBP-maf sobre la expresión de uPAR a nivel de proteínas. Las células se recogieron después de 24 horas y los lisados se inmunotransfirieron. Como se muestra en la Figura 4, DBP-maf no inhibió la expresión de uPAR en las líneas de células después de 24 horas (figura 7A), sin embargo, una reducción se observó después de 72 horas solamente en las células LNCaPLN3 (Figura 7B). células tratadas DBP no mostraron cambios significativos en la expresión del receptor.
LNCaP y LNCaPLN3, las células se trataron con DBP o DBP-maf (0,001 y 1 mg /ml) y se incubaron durante 24 horas después se recogieron. RT productos (ADNc), identificados como uPAR1, 2 y 3, se amplificaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa.
PC3M, y las células fueron tratadas con PC3MLN4 DBP o PAD-maf (0,001 y 1 g /ml) y se incubaron durante 24 horas después se recogieron. productos de RT (ADNc), identificados como uPAR1, 2, y 3, se amplificaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa. p & lt;. 0.05
LNCaPLN3 (A) y las células PC3M (B) fueron tratados con DBP o DBP-maf (0,001 y 1 mg /ml) y se incubaron durante 24 horas después se recogieron. productos de RT (ADNc), identificados como uPAR1, 2, y 3, se amplificaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa. p & lt;. 0.05
LNCaP, LNCaPLN3, PC3M y PC3MLN4 fueron tratados con DBP o DBP-maf y se incubaron durante 24 horas (A) a continuación cosechadas y a inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-uPAR. células LnCaPLN3 a las 72 horas (B). p. & lt; 0,05
Discusión
La vitamina D proteína DBP-maf vinculante, se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor y los vasos sanguíneos. Se demuestra aquí, por primera vez, un efecto directo sobre las células de cáncer de próstata en la ausencia de macrófagos, lo que aumenta el alcance de DBP-maf más allá de sus características antiangiogénicas e inmuno-moduladores ya demostrada. DBP-maf demostrado potente inhibición de la proliferación y migración de células tumorales.
Es interesante observar la respuesta de las células PC3M parentales en comparación con el clon metastásico. PC3M células no mostraron sensibilidad a la DBP-maf en ensayos de proliferación, pero su migración fue inhibida por el DBP-maf. Hubo una reducción de la expresión de uPAR como se detecta por RT-PCR, pero la expresión de proteínas de la uPAR isotipos probado apareció sin cambios. Finalmente, DBP-maf causó un ligero aumento en la pérdida debido a la apoptosis o necrosis (Tabla 1), mientras que las otras líneas celulares demostraron disminución de la apoptosis o necrosis. El PC3MLN4 clon metastásico exhibió una respuesta potente para el tratamiento tanto de la proliferación y la migración, incluso a baja dosis (1 ng /ml), pero no mostró reducción en la expresión de uPAR, ya sea en el ARNm o el nivel de proteína. Se realizaron estudios adicionales de proliferación para determinar si la discrepancia en la respuesta entre el clon parental y metastásico era debido a un cambio general en la sensibilidad de las células. Calcitriol mostró una inhibición potente y consistente entre todos los tipos de células dentro de los intervalos de dosis idénticas. células PC3M y PC3MLN4 también se probaron con etopósido y sus respuestas fueron similares (datos no presentados), lo que sugiere que el clon metastásico ganó sensibilidad a la DBP-maf que la línea parental no demuestra. El efecto de DBP-maf en células causado PC3MLN4 las tasas de reducción significativos más altos de proliferación y migración en comparación con las otras líneas celulares. Los estudios mostraron todas las líneas de células tumorales a ser sensibles a DBP-maf en ensayos de migración.
Nuestras observaciones en el cultivo de estas células fueron que los clones metastásicos de ambos PC3M y LNCaP fueron más sensibles a tripsinización de las líneas parentales. Hay muchos factores que pueden regular la migración de las células y, aunque uPAR es un posible mediador, puede que no sea el único mecanismo por el cual el DBP-maf inhibe la migración. El péptido fue eficaz en los estudios de migración, pero no mostró capacidad de afectar a la proliferación o la expresión de uPAR. Dado que el péptido representa sólo una parte de la proteína que no posee todos los dominios de la DBP-maf nativa, como la región de unión a vitamina D. Es posible que la capacidad para regular la migración y la proliferación reside en dominios separados de la proteína. Aunque todas las líneas de células respondieron a DBP-maf en uno o más de los ensayos, solamente LNCaPLN3 demostró una reducción del nivel de proteína uPAR. Es posible, sin embargo, que el anticuerpo no reconoce todas las isoformas de uPAR.
Ahora es comúnmente aceptado que el microambiente tumoral, y no sólo la célula tumoral solo, representa un objetivo efectivo para la terapia. Además de la investigación de los efectos antitumorales, se está estudiando el método de entrega de estos fármacos. La biodisponibilidad es un componente esencial de cualquier estrategia terapéutica. absorción deficiente, internalización, corta vida media en circulación, y una serie de otras deficiencias pueden hacer una terapia que ha demostrado una gran promesa
in vitro
, ineficaces en la clínica. La efectiva
in vivo
dosis para la PAD-maf (pág-ng) han tendido a ser más bajo que el
in vitro
dosis (rango ng-g) [4], [6] - [10]. Tal vez esto se debe a múltiples mecanismos de su actividad. El potencial de impactar en el crecimiento de los vasos sanguíneos y el crecimiento de las células tumorales, así como estimular una respuesta inmune potente a través de la activación de macrófagos es difícil de medir
in toto
utilizando
in vitro
enfoques. Ellos, sin embargo, proporcionan una manera de caracterizar a estos efectos de forma individual.
El efecto del tratamiento con DBP-maf sobre la expresión de uPAR en las células tumorales de próstata era desconocida hasta entonces. uPAR expresión se ha correlacionado con la metástasis del tumor en un número de tumores [26], [28] - [30], [32]. Estudios de tumores de esófago mostraron PAI-1 y de uPA se expresa en todo el tumores, pero no en el tejido esofágico normal y que uPAR se expresa en las fronteras tumorales [33], [34]. Un vínculo entre el cáncer de páncreas y UPA se ha demostrado, lo que podría explicar el potente efecto de DBP-maf en nuestros estudios de tumor pancreático anteriores [33].
La relación entre las proteínas relacionadas con plasmina de PAI-1, uPA y uPAR es complejo [35]. Aunque PAI-1 inhibe la expresión de uPA, que se cree que inhibe la progresión del tumor, PAI-1 también promueve el crecimiento tumoral y la angiogénesis en su propia [36], [37]. En este sentido, una terapia que atenuaría expresión uPAR sin promover el crecimiento del tumor sería valioso. Dado que la metástasis es la causa principal de muerte en los pacientes con cáncer, la sensibilidad a uPAR DBP-maf puede representar una vía atractiva para su posterior estudio.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Jayakrishna Ambati y Royce Mohan para sus debates.