Extracto
Antecedentes
La saliva (líquidos por vía oral) es un biofluid emergentes a punto para la detección de enfermedades clínicas. Aunque la razón para aplicaciones de enfermedades orales (por ejemplo, cáncer oral) es intuitiva, la razón y la relación entre las enfermedades sistémicas y biomarcadores de saliva no están claros.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, hemos utilizado modelos de ratones de melanoma y el cáncer no microcítico de pulmón de células y se compararon los perfiles de biomarcadores transcriptoma de ratones portadores de tumores a los de los ratones de control. el análisis de microarrays mostró que transcriptomes salivales fueron alterados significativamente en los ratones frente a los controles portadores de tumores. superposición significativa entre los transcriptomes de tumores de ratón, suero, glándulas salivales y la saliva sugiere que los biomarcadores salivales tienen múltiples orígenes. Por otra parte, hemos identificado que la expresión de dos grupos de alterado de manera significativa los factores de transcripción (TFS) Runx1, Mlxipl, Trim30 y Egr1, TBX1, NR1D1 en salivar tejido de las glándulas de los ratones con melanoma que llevan potencialmente puede ser responsable de 82,6% de la hasta reguladas la expresión génica y 62.5% de la expresión de genes regulados hacia abajo, respectivamente, en la saliva de los ratones de melanoma que llevan. También demostramos que la producción ectópica de factor de crecimiento nervioso (NGF) en el tejido tumoral del melanoma como mediador-lanzado tumor puede inducir la expresión de la TF Egr-1 en la glándula salival.
Conclusiones
en conjunto, nuestros datos apoyan la conclusión de que, al desarrollo de la enfermedad sistémica, cambios significativos pueden ocurrir en el perfil de biomarcadores salivales. Aunque los orígenes de los biomarcadores salivales consecuencia de las enfermedades pueden ser a la vez local y sistémica, la estimulación de las glándulas salivales por los mediadores liberados de los tumores a distancia juega un papel importante en la regulación de los perfiles de biomarcadores sustitutos salivales
Visto:. Gao K, Zhou H, Zhang L, Lee JW, Zhou Q, Hu S, et al. (2009) Enfermedades sistémicas Inducidos salivales biomarcadores Profiles in mouse Modelos de melanoma y células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (6): e5875. doi: 10.1371 /journal.pone.0005875
Editor: Benjamin Rich, Instituto de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Enero, 2009; Aceptado el 16 mayo del 2009; Publicado: 11 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Gao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el NIH subvenciones SR1 DE017170 y R21 CA126733 a DTW los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que existen conflictos de intereses.
Introducción
la saliva alberga un amplio espectro de proteínas /péptidos, ácidos nucleicos, electrolitos y hormonas que se originan en múltiples fuentes locales y sistémicos. Las propiedades bioquímicas y fisicoquímicas de saliva apoyan sus funciones importantes en la salud oral, tales como la digestión de alimentos, la actividad antibacteriana, y el mantenimiento de la integridad de los dientes [1], [2]. Por ejemplo, la xerostomía es una enfermedad oral causada por una disfunción de las glándulas salivales, que se acompaña de disminución o ausencia de secreción de saliva y es la causa de la caries rampantes y mucositis.
diagnóstica, una serie de hallazgos en el década pasada han impulsado el interés en el uso de saliva como una fuente de biomarcadores. El fragmento soluble de c-erbB-2 era detectable en la saliva de los pacientes de cáncer de mama, pero no en los controles sanos o pacientes que tienen tumores benignos [3]. Los niveles de hormonas (por ejemplo, cortisol, oxitocina) y fármacos (por ejemplo, cisplatino, nicotina, metadona) en saliva reflejan su concentración en el suero [4], [5], [6]. En la detección del VIH basada en la saliva de 2004 fue aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA).
Un impulso significativo a la base científica y la infraestructura de la investigación diagnósticos salivales llegó hace seis años, cuando el Instituto Nacional de Odontología & amp ; Investigación Craneofacial (NIDCR) hizo una inversión importante hacia el desarrollo de la utilización de la saliva como una herramienta de diagnóstico. ya que la saliva se ha convertido en un biofluid que está a punto de traslación y aplicaciones clínicas. Es de destacar la maduración de la proteoma salival, el primer implemento en la caja de herramientas de diagnóstico para el diagnóstico basado en la saliva. Ahora sabemos que hay 1166 proteínas en la saliva humana, cuyas funciones van desde la unión estructural para la participación en diversos procesos biológicos [7]. Un segundo recurso de diagnóstico en la saliva ya ha surgido, el transcriptoma salivar. Usando el transcriptoma salivar como herramienta de diagnóstico, un conjunto de 185 ARNm se identificó como "transcripciones núcleo salival normal" (NSCT) [8]. Por otra parte, el transcriptoma salivar ha demostrado ser clínicamente discriminatorio para la detección de cáncer oral y el síndrome de Sjögren (SS). La combinación de siete biomarcadores transcripciones salivales (
IL8, IL1B, dusp1, HA3, OAZ1, S100P, y SAT
) se puede utilizar para distinguir entre la saliva de pacientes con carcinoma oral de células escamosas (COCE) y el de controles con sensibilidad 91% y especificidad [9]; mientras que cinco marcadores proteómicos salivales (-M2BP, CD59, catalasa, MRP-14 y Profilin) mostrar colectivamente una sensibilidad del 93% y la especificidad, respectivamente, para detectar el cáncer oral usando saliva [10]. Otro estudio mostró que los ARNm 27 y 16 péptidos en muestras de saliva de los pacientes con SS fueron significativamente altura o hacia abajo-regulado [11]. La tecnología del transcriptoma salivar ha sido recientemente avanzado hasta el exón nivel con la capacidad de perfil integral el transcriptoma salivales usando una tecnología basada en el exón [12].
Hay muchas ventajas de utilizar la saliva como biofluid de diagnóstico clínico . La recogida de muestras es simple, no invasiva, y hace poco de ansiedad por parte de los pacientes. El uso de la saliva también ofrece un enfoque rentable para pantallas de gran escala [6]
.
El uso de saliva para la detección de enfermedades orales se ha confirmado, pero su uso para la enfermedad sistémica es en gran medida poco clara. Aunque los informes han descrito la detección de biomarcadores de cáncer sistémico en la saliva (por ejemplo c-erb2 en pacientes con cáncer de mama), los mecanismos que subyacen a este fenómeno siguen siendo no. El objetivo de este estudio fue explorar la evidencia científica y proporcionar una justificación para el uso de saliva para la detección de la enfermedad sistémica. Utilizamos modelos tumorales de ratón singénicas a desarrollar tumores a distancia de la cavidad oral y utilizamos el transcriptoma salivar como la lectura de perfil de biomarcador (Fig. 1). El transcriptoma salivar ha sido validado como fuente de biomarcadores científicamente verosímil y justificado en la saliva [8], [9], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], que permite el análisis de alto rendimiento y de lectura con punto necesario para los estudios
ratones (bien /6 ratones o DBA /2 ratones C57BL) fueron divididos aleatoriamente en dos grupos de la siguiente manera:. del grupo de control (control de ratones ) y el grupo de tumores (ratones tumor) (15 animales por grupo). PBS se inyectó en los ratones de control mientras que los ratones en el grupo de tumores fueron inyectados con células tumorales. establecimiento tumores tomó ~ 3 semanas. tejidos de saliva, la glándula salival, suero y tumorales fueron recogidos de cada ratón. Cinco ratones cada uno se agruparon en un solo grupo y se procesan para perfilar su transcriptoma de los microarrays de expresión.
Resultados
significativas diferencias consecuencia de las enfermedades entre los perfiles de biomarcadores salivales transcriptoma en portadores de tumores y los ratones de control
para evaluar si los cambios en el perfil del transcriptoma salivar biomarcador sobre el desarrollo de un tumor a distancia, se realizó el análisis de microarrays para comparar los perfiles de transcriptoma de biomarcadores en la saliva de los ratones de control (tres grupos, 5 ratones en cada grupo) con tumor-cojinete (melanoma o pulmón) ratones (tres grupos, 5 ratones en cada grupo) (Fig. 1). Es necesario tener cinco ratones en cada grupo tumor o el control con el fin de reunir suficiente saliva para el aislamiento de ARN. criterios de selección de biomarcadores se establecieron de la doble cambio & gt; 2 y
P Hotel & lt; 0,05. Se identificaron 152 genes conocidos significativamente hasta regulados y 359 significativamente las reguladas genes conocidos (Fig. 2A, Tabla S3 y S4) en la saliva de los ratones portadores de melanoma en comparación con los ratones control. Del mismo modo, encontramos 290 transcripciones significativamente hasta regulados y 784 transcripciones significativamente las reguladas (Fig. 2B, .Tabla S5 y S6) en la saliva de los ratones portadores de cáncer de pulmón en comparación con los ratones control.
Un análisis
, Cluster de 152 genes conocidos hasta reguladas (que representan 225 probsets, el panel izquierdo) y 359-regulado por los genes conocidos (que representan 403 probsets, el panel derecho) expresados diferencialmente en la saliva de los ratones con melanoma en comparación con el control los ratones (valor de p & lt; 0,05; ≥2 veces el cambio). Los perfiles de expresión se estandarizaron a tener desviación estándar media y la unidad de cero. El rojo y el verde representan los altos y los bajos niveles de expresión después de la estandarización, respectivamente.
B Opiniones, análisis de conglomerados de 290 hasta reguladas y 784 probesets abajo-regulados diferencialmente expresado en la saliva de los ratones de carcinoma de pulmón en comparación con los ratones de control (P-value & lt; 0,05; ≥2 veces el cambio).
C
y
D
, la superposición de la expresión génica diferencial entre el modelo de melanoma y el modelo de cáncer de pulmón.
C
, la superposición de 225 genes regulados hasta en el modelo de melanoma y 290 genes regulados hasta en el modelo de cáncer de pulmón.
D
, la superposición de 403 genes regulados en el modelo de melanoma y 784 genes regulados en el modelo de cáncer de pulmón.
También se superponen la expresión génica diferencial en la saliva de melanoma ratones con la de los ratones de cáncer de pulmón. Comparar hasta reguladas o hacia abajo de los genes regulados salivales en dos modelos, respectivamente, encontramos 11 hasta reguladas (Fig. 2C) y 17 abajo reguladas (Fig. 2D) existen transcripciones en ambos modelos. Sin embargo, teniendo en cuenta los diferentes antecedentes y líneas celulares de cáncer genéticas en los dos modos de ratón, no se sorprende de que sólo una fracción del total de genes alterados se solapó (4.8% (11/225) o 3,8% (11/290) hasta reguladas genes en el modelo de melanoma o modelo de cáncer de pulmón, respectivamente;. 4,2% (17/403) o 2,1% (17/784) transcripciones en los dos modelos abajo-regulados, respectivamente)
múltiples fuentes contribuyen a la tumor inducida por la saliva perfil ARNm alteración
para examinar las posibles fuentes que contribuyen a las alteraciones del transcriptoma salivar en ratones en respuesta a la enfermedad sistémica, que filtra la expresión de datos de perfiles de los ratones portadores de melanoma (tumor, suero, de las glándulas salivales y la saliva) para seleccionar ARNm "presente" con un
P
valor & lt; 0,001 y un valor de intensidad & gt; 200. En el modelo de melanoma, 20175, 5493, 19904, y 306 transcripciones fueron identificados en el tumor, suero, saliva y las glándulas salivales, respectivamente (Fig. 3A). Después de la superposición de todos los presentes genes de tumor, suero, saliva y las glándulas salivales, la fig. 3B mostró que de los 306 transcripciones presentes en saliva, 67,6% también están presentes en tejido de melanoma-tumor, 51,6% también están presentes en el suero y 69,6% también están presentes en la glándula salival. Estos datos indican que los orígenes de la presente transcriptoma en la saliva pueden estar asociados con diversos compartimentos en todo el cuerpo que constituyen totalmente ~75.2% de las 306 transcripciones salivales. Además, el 24,8% de las 306 transcripciones no se solapan con los genes en el tumor, las glándulas salivales y el suero, lo que sugiere que pueden proceder de la cavidad oral.
Un
, superposición de las transcripciones presente en saliva, la glándula salival, el suero y el tumor en los ratones de melanoma que llevan.
B Opiniones, de las 306 transcripciones salivales, el 69,6% estaban presentes en las glándulas salivales, el 51,6% presente en el suero, el 67,6% presentes en el tumor (melanoma), y el 24,8% puede proceder de la cavidad oral (local).
la expresión alterada de los factores de transcripción (TFS) en las glándulas salivales de los ratones portadores de melanoma se correlaciona con el factor de transcripción mediada por la alteración cambios de expresión génica en la saliva del ratón
Debido a que el transcriptoma salivar estaba claramente alterado en portadores de tumores frente a los ratones de control, la hipótesis de que los tumores se comportan como órganos endocrinos en que secretan mediadores (hormonas, linfoquinas, citoquinas) que pueden afectar a la actividad de TF en las glándulas salivales y por lo tanto inducir hacia arriba o hacia abajo-regulación de las transcripciones niveles en la saliva.
a pesar de que están bien establecidos los dos modelos de cáncer de ratón en este estudio [34], [35], el modelo de melanoma de ratón simula melanoma humano mejor que modelo de cáncer de pulmón en teoría y patológicamente debido a que tanto el melanoma humano y esto se produce de melanoma de ratón por vía subcutánea. Por lo tanto, se utilizó el melanoma ratones C57BL devengan /6 como modelo de trabajo para poner a prueba nuestra hipótesis.
En primer lugar, se compararon los perfiles de expresión génica de los tejidos de las glándulas salivales en ratones con melanoma de bolas con los ratones de control e identificamos una lista de 46 TFS significativamente hasta reguladas (doble cambio & gt; 2 y
P Hotel & lt; 0,05) (Tabla S1). A continuación, calcula los coeficientes de correlación entre los perfiles de expresión de estos TFS alterado de manera significativa y los genes expresados diferencialmente (tanto arriba y hacia abajo) regulado en la saliva de los ratones portadores de melanoma. Los TFS se clasifican por el número de genes altamente co-expresaron cuya correlación con la expresión TF es & gt; 0,5. Las 6 TFS hasta reguladas con más alto rango eran runx1 (runt relacionados con el factor de transcripción 1), MLXIPL (musculus MLX interacción proteína-like) y TRIM30 (proteína tripartita motivo 30) para los genes salivales upregulated y Egr1 (crecimiento inicial del factor-1), TBX1 (T-cuadro 1) y NR1D1 (subfamilia de receptores nucleares musculus 1, grupo D, miembro 1) para reguladas por los genes salivales (Fig. 4A, e, F).
Un
, las 6 TFS (
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, NR1D1, TBX1
) se expresan significativamente mayor en las glándulas salivales de los ratones portadores de melanoma en comparación con los ratones de control (P & lt; 0,05, Tabla S1).
B Opiniones, los niveles de mRNA de expresión de estos 6 TFS (
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, NR1D1, TBX1
) en la glándula salival de los ratones con melanoma versus la de los ratones normales validado por qRCR . La línea de trazos horizontal indica los niveles de expresión génica en ratones de control, que se fija arbitrariamente a 1. Las columnas representan los niveles de expresión de genes en las glándulas salivales de los ratones con melanoma respecto a ratones control. Los experimentos se realizaron por triplicado; bares, Dakota del Sur.
C
, cinco niveles de expresión de TFS (Runx1, Mlxipl, Egr1, NR1D1, y TBX1) en los tejidos de las glándulas salivales de los ratones de control y ratones con melanoma se midieron mediante inmunotransferencia. (C1, C2, C3 y T1, T2, T3 son del mismo lote de los tejidos utilizados en el ensayo de microarray). Tenga en cuenta que el anticuerpo comercial no estaba disponible para murino Trim30.
D
, los niveles de expresión de proteínas de los anteriores cinco TFS melanoma en ratones frente a los ratones de control. intensidad de señal de la mancha en la Figura 4
C
se cuantificó por software Image J (NIH). La línea de trazos horizontal indica los niveles de expresión de estos 5 TFS en los ratones de control, que se fija arbitrariamente a 1. Columnas muestran que los niveles de proteína relativos de los 5 TFS en ratones portadores de tumores en comparación con los ratones de control; bares, Dakota del Sur.
E
y
F
, la expresión de TFS (6
Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, NR1D1, TBX1
) en la glándula salival de los ratones con melanoma se correlacionaron con la expresión génica diferencial en la saliva del ratón. Tres de ellos (Runx1, Trim30 y
Mlxipl
) puede ser potencialmente responsable de 180, 35 y 16 de las transcripciones salivales hasta reguladas en ratones con melanoma (
P Hotel & lt; 0,05), respectivamente , mientras que los otros 3 TFS (
Egr1, TBX1 y NR1D1
) están potencialmente correlacionadas con 119, 116 y 77-regulado transcripciones salivales (
P Hotel & lt; 0,05).
G
, la expresión de los 3 TFS (Runx1, Trim30 y Mlxipl) totalmente correlacionado con el 82,6% ((180 + 5 + 1) /225 = 82,6%) hasta reguladas expresión génica en la saliva de melanoma de ratón por la superposición de todos los genes salivales que se correlacionan con estos 3 TFS de la Fig. 4
E
.
H
, la expresión de los otros 3 (TFS Egr1, TBX1 y NR1D1) totalmente correlacionados con el 62,5% ((119 + 58 + 2 + 73) /403 = 62,5%) las reguladas expresión génica en el saliva de ratones con melanoma mediante la superposición de todos los genes salivales que se correlacionan con estos 3 TFS de la Fig. 4
F
.
A continuación, la alteración de los patrones de expresión de estos TFS glándulas salivales fueron validados en ambos los niveles de transcripción y proteínas por qPCR e inmunotransferencia. Figura 4
B
muestra que los niveles de mRNA de los seis TFS se aumentaron de 3 a 16 veces en las glándulas salivales de los ratones de melanoma que llevan en comparación con los ratones control. detección de inmunotransferencia utilizando anticuerpos 5 TFS murinos comercialmente disponibles reveló 1.5 a 3.5 veces mayores niveles de estos TFS expresión en las glándulas salivales de los ratones de melanoma que llevan que en los ratones de control (Figura 4
C y 4D
). A continuación, la figura 4
E y F muestran que los
6 TFS anteriores se asocian con una serie de expresiones de genes diferenciados en la saliva del ratón. Después de la superposición de los genes asociados de cada TF, se puede observar que las actividades alteradas de los tres TFS (RUNX1, MLXIPL y TRIM30) pueden ser potencialmente responsable de 83% de los mRNAs regulados hasta en la saliva (Fig. 4
G
), mientras que las actividades alteradas colectivos de Egr1, TBX1 y NR1D1 potencialmente pueden dar cuenta de un 63% de la expresión regulada hacia abajo de los ARNm salivales (Fig. 4
H
).
la vía de Egr-1 de señal y detección de factor de crecimiento nervioso (NGF) en el tejido tumoral de melanoma y el suero
Para investigar si los tumores desarrollados pueden mediar en la expresión alterada de TFS en las glándulas salivales de ratones portadores de tumores, examinamos la vía de señal de NGF /Egr1 porque Egr1 fue identificado como un TF-up regulado en la glándula salival de ratones melanoma-tumorales. Es bien sabido que el Egr-1 es un TF en el NGF vía [18] de señalización, [19] (Fig. 5A). Por lo tanto, la hipótesis de que el NGF se secreta en la circulación por el melanoma, circula a la glándula salival donde activa la cascada de señalización mediada por el receptor que conduce a Egr-1 upregulation y la inducción de la transcripción de genes específicos y la traducción de proteínas. La Figura 5B muestra que el NGF se produce en tejido de melanoma en una niveles significativamente más altos que en la piel normal (
P
& lt; 0,001). La Figura 5C muestra que el NGF también es significativamente mayor en el suero de los ratones de melanoma que llevan en comparación con los ratones control (
P
& lt; 0,05). En conjunto, estos datos sugieren que el melanoma puede producir NGF y es secretada en el torrente sanguíneo. Al llegar a las glándulas salivales, el aumento de los niveles de NGF en la sangre podrían entonces estimular el aumento de la expresión de TFS como Egr-1 conduce a la expresión y los perfiles de proteínas de genes alterados en la saliva de los ratones de melanoma que llevan.
Una
, una vía que implica factor de transcripción Egr1. factor de crecimiento nervioso (NGF) puede ser un factor de aguas arriba de Egr1.
B Opiniones, expresión de NGF en los tejidos de los ratones de piel y melanoma medidos por ELISA. Las columnas son los valores medios absolutos de concentración de NGF en los tejidos de cinco ratones de melanoma. ***,
P Hotel & lt; 0,001.
C
, la expresión de NGF en el suero de los ratones de control y ratones tumorales. Las columnas son los valores medios absolutos de concentración de NGF en el suero de cinco ratones de control y cinco ratones de melanoma. Bar, Dakota del Sur. **,
P Hotel & lt; 0,05
Discusión
Los estudios han demostrado el potencial de uso de la saliva como biofluid diagnóstico en traslación y aplicaciones clínicas. Como muestra biológica, saliva es barato y fácilmente accesible por medios no invasivos. La amplia base de conocimientos de la composición de diagnóstico de la saliva ofrece un recurso valioso e informativo para el descubrimiento de biomarcadores (www.skb.ucla.edu). biomarcadores altamente discriminatorias salivales para dos enfermedades orales cáncer oral y el síndrome de Sjögren se han identificado y validado [9], [11]. Sin embargo, la relación entre las enfermedades sistémicas y biomarcadores de saliva todavía no está claro. En este estudio, hemos utilizado modelos de ratón de cáncer para determinar si los perfiles de biomarcadores salivales se ven afectados por el desarrollo de enfermedades distal. Nuestros datos demuestran que los perfiles de transcriptoma salivales se alteran significativamente en los ratones que llevan cualquiera de los dos tumores: melanoma y carcinoma de pulmón (Fig. 2). Cada tipo de tumor se asoció con un perfil salival transcriptoma diferente. Además, nuestro análisis de la producción de NGF y la TF Egr1 sugieren que la producción de factores de crecimiento en el tejido tumoral representa un mecanismo por el que un tumor distante puede alterar el transcriptoma de la glándula salival y por lo tanto la saliva. Estos resultados también muestran que las glándulas salivales pueden jugar un papel clave en la mediación de las alteraciones inducidas por el tumor en el perfil de biomarcador transcriptoma saliva. Además de mostrar que circula biomarcadores pueden encontrar su camino en la saliva inducida por enfermedad, estos hallazgos sugieren que la inducida por la enfermedad de la glándula salival biomarcadores sustitutos pueden tener valor diagnóstico para la detección o la vigilancia de las enfermedades sistémicas
.
Desde nuestra primer informe sobre el transcriptoma salivales [8], [9], hemos examinado los orígenes de ARNm salival, lo que parece ser diferente de los ARNm se encuentran en otros fluidos corporales. Se cree que los ácidos nucleicos en suero de pacientes de cáncer para ser derramada directamente de las células cancerosas o para ser lanzado como el resultado de la lisis de células en órganos dañados mientras que los ácidos nucleicos en la orina pueden proceder de ARNm de sangre o de ADN [20], [21 ]. En un estudio de la saliva humana, transcripciones en el transcriptoma salivales pueden ser detectados en todas las fuentes de saliva incluyendo la glándula parótida, glándulas submandibulares y sublinguales, los fluidos del surco gingival y de las células epiteliales orales [16]. Recientemente se ha demostrado que la mayoría de los mRNAs en el transcriptoma salivar tiene un elemento AU-rico (ARE) en su 3'UTR que confiere estabilidad por complejación con proteínas son de unión [17]. En el presente estudio, se compararon los transcriptomes de los tumores, suero, glándulas salivales y la saliva y encontramos el transcriptoma salivar en ratones portadores de tumores altamente superponen en gran medida con la transcriptomes de las glándulas salivales, el suero y el tumor. Estos análisis sugieren que puede haber múltiples orígenes de mRNA salival y /o que puede existir una compleja relación sistémica entre la cavidad oral y la salud sistémica.
Se investigaron posibles mecanismos por los que los tumores distales median cambios en biomarcador salival perfiles en ratones portadores de tumores. Estudios anteriores han demostrado que las enfermedades sistémicas o tratamientos pueden afectar a la función de la glándula salival que resulta en cambios en la composición de la saliva [22], [23], [24]. los niveles de sodio y proteínas salivales fueron elevados después del tratamiento de interleuquina-2 (IL-2) en los pacientes. Un estudio usando un modelo de ratón también mostró que los niveles de factores inflamatorios tales como IL-1 beta se incrementaron en la saliva después de la inflamación a distancia en el cuerpo [24]. Como la glándula salival es la principal fuente de saliva, la hipótesis de que las glándulas salivales pueden ser responsables de saliva específica alteraciones de biomarcadores relacionados con los tumores distales. Dado que nuestro experimento se realizó por triplicado, el método bayesiano puede ser aplicable. Sin embargo, este método requiere supuestos del modelo específicos para los datos. Por último software de la consola Expresión (Affymetrix, Inc.) y dCHIP (http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) se aplicaron en este estudio. Para el modelo de melanoma singénico, se identificaron 46 TFS son significativamente hasta reguladas en las glándulas salivales de los ratones de melanoma que llevan que pueden conducir a la inducción directa o supresión de la expresión génica. Los cambios veces relativos de expresión de FT como Egr1 y NR1D1 son diferentes entre los niveles de mRNA y los niveles de proteína, lo que puede reflejar translacional modificación o degradación proteasomal [25]. Luego encontramos que estos expresión alterada de TFS se asocia con el transcriptoma melanoma inducida en la saliva. Se encontró que aproximadamente el 83% de las transcripciones significativamente hasta reguladas en la saliva pueden ser explicados por tres TFS (Runx1, Trim30 y Mlxipl) (Fig. 4G) y 63% de las transcripciones salivales significativamente baja regulado puede explicarse por otros tres TFS (Egr1, TBX1 y NR1D1) (Fig. 4H). En conjunto, estos resultados nos permiten concluir que las glándulas salivales cumplen un papel poco apreciado anteriormente como órgano control de la enfermedad sistémica mediante la inducción de TFS específicos de la enfermedad y la alteración de la expresión de genes específicos y la traducción de las proteínas correspondientes. Estos mRNAs y proteínas salivales alterados son biomarcadores indirectos asociados a la enfermedad que se secretan en los fluidos glandulares y entran en la cavidad oral como toda la saliva
.
Dado que la inducción de la expresión TFS en las glándulas salivales se produjo en ratones con un tumor distal , la hipótesis más hay mediadores específicos de tumores que pueden afectar la expresión TG alterada en las glándulas salivales. Es bien conocido que los tumores expresan ectópica mediadores que tienen efectos sistémicos sobre los órganos distales y facilitan la metástasis de las células del cáncer [26], [27]. Los melanomas se sabe que expresa ectópica TGF-beta [28] mientras que los tumores pulmonares ectópica gonadotropinas expresos y otras hormonas [29], [30]. Investigamos si uno de tales vía de señalización puede relacionado con uno de los TFS identificados que pueden ser responsables de la inducción o represión de la transcriptoma salivar en el modelo de melanoma de ratón. En efecto, el NGF se sabe que estimula la expresión de la TF Egr-1 a través de una vía de señalización bien estudiada (Fig. 5A). El uso de un ensayo de ELISA NGF, se observó que la concentración de NGF en el tejido de melanoma y el suero es significativamente más alto que en los tejidos de control de contraparte (Fig. 5B, C). Estos datos sugieren un escenario biológico y razón en la que el tumor de ratón en desarrollo segrega NGF en la circulación, donde circula en la sangre a las glándulas salivales y se une a receptores de NGF expresado por las células acinares salivales, la activación de una vía de señalización que conduce a la regulación al alza de Egr-1 mRNA y niveles de proteína. Debe tenerse en cuenta que las células de melanoma se derivan de los melanocitos, que migran desde la cresta neural durante el desarrollo embrionario. NGF puede estimular la proliferación y la metástasis de células de melanoma [31]. Por otra parte, el NGF y su receptor (TrkA IR y TrkC IR) se han encontrado en la glándula salival [32], [33]. Por lo tanto, es razonable proponer que el NGF secretado por tumor melanoma fue transferido a través de la sangre y unido a sus receptores afines en la glándula salival, en última instancia resulta en la estimulación de múltiples expresión TFS incluyendo Egr-1 (Fig. 6).
los mediadores tales como NGF secretadas por los tumores remotos se transfieren a través de las glándulas salivales de sangre para estimular la expresión de TFS y alterar el perfil de ARNm salival.
también medimos los niveles de NGF en el lisado tumoral del pulmón de ratón modelo de cáncer. Aunque NGF fue detectable, fue en un nivel significativamente más bajo que el lisado de tumor melanoma (20,9 ± 4,3 pg /mg en el tumor de pulmón vs. 75,73 ± 24 pg /mg de tejido de melanoma, P & lt; 0,05, datos no mostrados). Además, sólo el 11 hasta reguladas transcripciones y 17-regulado se solapan cuando se comparó el perfil de ARNm salivales del modelo de melanoma con el modelo de cáncer de pulmón (225 hasta reguladas o 403 genes regulados en el modelo de melanoma vs 290 hasta reguladas o 784 transcripciones abajo-regulada en el modelo de cáncer de pulmón, respectivamente, Fig. 2C y D). Y 2 de los 17 se traslapan con genes regulados hacia abajo se correlacionaron con la expresión Egr1 (datos no mostrados). En conjunto, estos datos permiten concluir que el NGF derivado de melanoma es un mediador potencialmente importante en la regulación a la baja del transcriptoma salivar específica sólo en los ratones portadores de melanoma.
Mientras que nuestro informe no demuestra ampliamente la conexión mecánica entre sistémico desarrollo de la enfermedad y las alteraciones de los biomarcadores salivales, que comienza a pintar la imagen para el concepto de que existen redes sistémicas en nuestro cuerpo, lo que permite la comunicación entre las enfermedades distales y las glándulas salivales. Las señales transmitidas a través de tales redes pueden inducir vías de señalización relacionadas que dan como resultado la expresión del gen alterado y la traducción de proteínas y por lo tanto producen perfiles de biomarcadores salivales inducida por la enfermedad. Se postula que este tipo de transcriptomes glándula mediada salivales inducida por la enfermedad y los productos de la traducción pueden servir como indicadores valiosos de aparición y /o progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la glándula salival se puede considerar como un reactivo enfermedades sistémicas de vigilancia de órganos y la saliva se pueden investigar como un biofluido de enfermedad reflectante biomarcador enriquecida. La producción local y la secreción de saliva de una sola fuente anatómica (las glándulas salivales), y el hecho de que se puede aprovechar de forma sencilla y no invasiva, así como con relativamente pocas molestias para los pacientes, proporciona un fuerte incentivo para la continua investigación de la salvia como un indicador potencial de diagnóstico de enfermedades sistémicas.
Materiales y Métodos
Animales
de seis a ocho semanas de edad ratones DBA /2 y C57BL /6 ratones fueron comprados a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y alojados en la División de Medicina de laboratorio Animal (DLAM) de la Universidad de California en los Ángeles. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller (ARC) de la Universidad de California en Los Angeles (UCLA).
Las líneas celulares
líneas celulares murinos KLN-205 y B16-F1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). KLN-205 es una línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), establecido originalmente en ratones DBA /2. Las células se cultivaron en MEM (GIBCO). Y B16-F1, una línea de células de melanoma de origen 6 C57BL /, se mantuvo en DMEM (GIBCO) [34]. Todas las células se mantuvieron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 ° C.
En vivo y modelos tumorales
modelo de melanoma de ratón se indujo mediante inyección subcutánea (sc) de inyección de 1 × 10
5 células B16-F1 en 0,1 ml de PBS en el costado inferior derecho de ratones C57BL /6. El modelo de cáncer de pulmón fue establecido por vía subcutánea inyección de 2 × 10
5 KLN-205 células en ratones DBA /2 [34], [35]. Los animales de control fueron inyectados con PBS solo. No se observaron tumores establecidos después de 2-3 semanas (Fig. 1).
se recogió la acumulación de tejido de la saliva del ratón, la sangre y el tumor
Cuando los tumores alcanzaron los 15 mm de diámetro y la saliva de los ratones eran sacrificado. La anestesia leve fue inducida por la inyección intramuscular (IM) de 1 ul /kg de peso corporal de una solución que contiene 60 mg /ml de ketamina (Phoenix Scientific, St. Joseph, MO) y 8 mg /ml de xilazina (Phoenix Scientific). Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con pilocarpina (0,05 mg de pilocarpina /100 g de peso corporal) entre las orejas de la secreción de saliva estimulada. La saliva se obtuvo de la cavidad oral por micropipeta y se colocó inmediatamente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml pre-refrigerados.