Extracto
Actualmente no hay enfoques moleculares dirigidas para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), similar a los utilizados con éxito contra el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Este fracaso se debe a nuestra incapacidad para identificar subtipos clínicamente relevantes de esta enfermedad. Por lo tanto, se necesita un enfoque más sistemático para el descubrimiento de fármacos para el CPCP. En este sentido, dos amplios estudios publicados recientemente en
Naturaleza, España la línea celular de cáncer Enciclopedia y el Proyecto del Genoma del Cáncer, proporcionan una gran cantidad de datos con respecto a la sensibilidad a los fármacos y los perfiles genómicos de muchos tipos diferentes de células cancerosas. En el presente estudio se han extraído estos dos estudios para nuevos agentes terapéuticos para el CPCP y proteínas de choque térmico identificados, quinasas dependientes de ciclina y quinasas polo-like (PLK) como dianas moleculares atractivas con poca actividad en ensayos clínicos en curso en el CPCP. Sorprendentemente, nuestros análisis demostraron que la mayoría de las líneas celulares de SCLC agrupan en un único subgrupo, ya sea predominante, en su análisis de la expresión génica o la CNV, que nos lleva a adoptar un enfoque farmacogenómica para identificar subgrupos de células de SCLC sensibles al fármaco. El uso de inhibidores de PLK como ejemplo, hemos identificado y validado una firma genética de la sensibilidad al fármaco en el CEP líneas celulares. Esta firma genética podría distinguir entre los tumores SCLC subpoblaciones humanos, lo que sugiere su potencial utilidad clínica. Por último, las parcelas Circos se construyeron para dar una visión completa de cómo la transcripción, el número de copias y los elementos de mutaciones afectan a la sensibilidad PLK en líneas celulares de SCLC. En su conjunto, este estudio describe un enfoque para predecir la sensibilidad a fármacos en el CPCP a nuevas terapias dirigidas
Visto:. Wildey G, Chen Y, Cuaresma I, L Stetson, Rosa J, Barnholtz-Sloan JS, et al. (2014) Enfoque farmacogenómica para identificar la sensibilidad a fármacos en cáncer de pulmón microcítico. PLoS ONE 9 (9): e106784. doi: 10.1371 /journal.pone.0106784
Editor: Gagan profunda, de la Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de mayo de 2014; Aceptado: 31 de julio de 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Wildey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Con el apoyo de subvenciones del Centro de Cáncer Seidman Hospitales Universitarios y del National Cancer Institute U01 CA062502 (GW, AD), el Fondo para la Investigación Traslacional Core (IL , JP) y la Bioestadística & amp; Bioinformática Core Facility (YC, ACC-S) del Centro Integral del Cáncer de la caja (Instituto Nacional del Cáncer P30 CA043703), y el Programa Nacional Science Foundation Graduate Research Fellowship (LS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón microcítico (SCLC) representa el 15% de todos los carcinomas de pulmón y por lo general se diagnostica cuando la enfermedad ha hecho metástasis [1], [2]. Desafortunadamente, no ha habido mejoras de poca importancia en el estándar de cuidado para el CPCP en las últimas tres décadas [3] - [5]. Actualmente no existen enfoques moleculares específicos para el tratamiento de CPCP similares a los utilizados con éxito contra el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), como erlotinib focalización de EGFR mutante o crizotinib la orientación de proteínas de fusión EML4-ALK [6], [7] . La cirugía se realiza con poca frecuencia en esta enfermedad (sólo el 1% de los casos), lo que limita la disponibilidad de tejido tumoral para los análisis genómicos completos. Por otra parte, los dos estudios de genómica seminales publicados recientemente en SCLC han dado poca penetración terapéutica en esta enfermedad y han analizado principalmente la forma rara de SCLC susceptible a la cirugía, que no representa el clásico, SCLC metastásica generalizada se ve en la práctica clínica diaria [8] , [9].
se necesita un enfoque diferente para el descubrimiento de fármacos para el CPCP y puede estar en la minería de bases de datos disponibles en las sensibilidades de drogas de líneas celulares de SCLC. Es decir, como la mayoría de las células de SCLC se derivan de los sitios metastásicos o derrames pleurales, pueden ser representativos de una amplia SCLC enfermedad y sus vulnerabilidades asociadas drogas. En este sentido, dos estudios completos de detección de drogas publicados recientemente en
Naturaleza, España la línea celular de cáncer Enciclopedia (CCLE) [10] y el Proyecto del Genoma del Cáncer (CGP) [11], examinaron la sensibilidad a los fármacos de cáncer líneas celulares, incluyendo los pulmones, e intentaron vincular estos a los perfiles genómicos. Los perfiles genómicos de ADN incluyen el estado mutacional, la expresión génica y la variación del número de copia (CNV) de datos.
En el presente estudio se han extraído sobre los datos de CEP líneas celulares de estos dos estudios y delinear un enfoque bioinformático para identificar nuevos agentes terapéuticos para el CPCP usando quinasa polo-como (PLK) inhibidores como ejemplo.
resultados
Inicialmente se buscó una visión global de la sensibilidad al fármaco en el SCLC CCLE [10] y [11 CGP ] estudios. Había 53 y 31 líneas celulares de SCLC probados para la inhibición del crecimiento por 24 y 92 medicamentos en estos estudios, respectivamente. Los resultados se muestran en las Figuras 1 (CGP) y S1 (CCLE) como diagramas de caja. Una tabla de los datos numéricos para la eficacia de los medicamentos, así como las líneas de células atípicas, también se da en las Tablas S1 (CGP) y S2 (CCLE). Este análisis gráfico nos permitió identificar fármacos que eran ampliamente eficaz contra la mayoría de las células de SCLC. Definimos las drogas "eficaz" como las que inducen la inhibición del crecimiento en la mayoría de las células a dosis bajas (mediana IC
50≤1 M), representada por el paclitaxel. drogas 'ineficaces', representada por erlotinib y sunitinib, no produjeron inhibición del crecimiento en la mayoría de las células de SCLC (IC
50≥8 M), aunque pueden estar presentes los valores atípicos ''. drogas "selectivo", representada por la rapamicina, demostraron un diagrama de caja larga y pueden considerarse eficaz para sólo un subconjunto de CEP líneas celulares.
Hay 31 líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas. Los diagramas de caja muestran medicamentos que aparecen en el eje X y los correspondientes IC
50 valores (en mM) listadas en el eje y. El "techo" de la eficacia del fármaco se estableció en 8 M; si el IC
50 de todas las células de la prueba estaba por encima de esta concentración de una sola línea parece en la parte superior de la gráfica. Esto representa un fármaco ineficaz. Por el contrario, si todas las células ensayadas eran sensibles a un fármaco determinado, una caja y bigotes estrecha trama parece en la parte inferior de la gráfica. La línea dentro de cajas individuales representa la mediana IC
50 valor de todas las células de la prueba y los círculos representan las células atípicas '' cuya IC
50 valores no entran en el cuantil 25-75% del total de IC
50 los valores medidos por ese medicamento (representada por la caja)
como se muestra en la Tabla 1, las drogas clasificadas como "eficaz" para la mayoría de las células de SCLC incluyen CGP-60474, un inhibidor de CDK.; BI-2536 y GW-843682X, inhibidores de PLK ambos; bortezomib, un inhibidor de proteasoma; y elesclomol, un inhibidor de HSP70. Además, varios fármacos dirigidos a la caída vía PI3K-AKT-mTOR dentro de esta categoría, incluyendo A-443654, temsirolimus y NVP-BEZ235. Dos fármacos con una media de IC
50 sólo fuera 1 M incluyen AZD-7762, un inhibidor de CHK; y JW-7-52-1, un inhibidor de mTOR. inhibidores de HSP90 (17-AAG) y HDAC (panobinostat) también pueden representar fármacos eficaces '', aunque su eficacia varió entre los dos estudios. drogas "eficaz" probable llevan el mejor potencial de traslación.
datos de la matriz génica se ha utilizado ampliamente en la investigación del cáncer para identificar la expresión "firmas" que pueden ser cualquiera de pronóstico o predicción del comportamiento del tumor. Por lo tanto, se examinó si la agrupación de la expresión génica podría ser utilizado para identificar subgrupos de líneas celulares de SCLC sensibles a fármacos, en particular para medicamentos que demostraron una amplia gama de eficacia contra las células de SCLC en la Figura 1. Se utilizó datos del estudio CGP debido a que contenía la mayor cantidad de datos de sensibilidad de drogas. Sin supervisión agrupación consenso de los datos de expresión de genes demostró que tres grupos de células de SCLC fueron óptimas (Figura 2). Hubo 1006 genes importantes que definieron los subtipos de expresión génica (Kruskal-Wallis test, p-valor. & Lt; 0,05, que se enumeran en la Tabla S3 A continuación, visualizamos el efecto de la agrupación de la expresión génica en la eficacia del fármaco mediante un gráfico de mosaico (Figura 3) En. esta parcela se utilizó una escala de colores que divide la sensibilidad de drogas en seis grupos. drogas, que aparece en el eje y, se agruparon de acuerdo con las moléculas diana. las células, que se enumeran en el eje x, se agruparon utilizando el mismo orden que la obtenida por agrupamiento no supervisado de su expresión génica. no parece haber ninguna correlación de sensibilidad a los fármacos a la agrupación de la expresión génica, sin embargo, como la sensibilidad al fármaco parecía estar distribuidos al azar en todas las líneas celulares para cualquier fármaco dado. Este análisis gráfico hizo resaltar varias dirigidos agentes con excepcional eficacia de base amplia contra las líneas celulares de SCLC. Estos medicamentos incluyen bortezomib, BI-2536 y GW-843682X, así como el inhibidor de la HSP elesclomol y el inhibidor de CDK CGP-60474, aunque con menor eficacia. Estos medicamentos son idénticos a los señalados en la Tabla 1.
agrupamiento no supervisado de consenso se realizó a través de todas las líneas de células 31 (sólo 27 tenían la expresión de genes de datos disponibles; 3 de ellas son duplicados y se obtuvieron los valores medios para su posterior análisis ) y demostraron que 3 grupos fue óptima para este conjunto de datos. Con esta asignación, no paramétrico ANOVA de una vía (prueba de Kruskal-Wallis p-valor & lt; 0,05) fueron obtenidos se realizó en estos 3 clusters y 1006 genes importantes. El mapa de calor se ha generado con estos genes importantes.
sensibilidad de drogas era un código de colores según la leyenda en la parte inferior. Los fármacos se agrupan a lo largo del eje y de acuerdo con su molécula diana. Las células se disponen a lo largo del eje x idéntica a su agrupación expresión gen identificado en la Figura 2.
A continuación se determinó si CNV agrupación se podría utilizar para identificar subgrupos de líneas celulares de SCLC sensibles a fármacos. Tres grupos se identificaron utilizando de nuevo los 426 genes interrogados (Figura 4); Sin embargo no parecía haber ninguna correlación entre la expresión génica y la agrupación CNV. Reordenación de la trama de mosaico en la Figura 3 por la CNV agrupación también no reveló ninguna correlación aparente (Figura S2). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que las células de SCLC sensibles al fármaco no se agrupan en subgrupos por cualquiera de la expresión génica o CNV. Por lo tanto, hemos decidido utilizar un enfoque farmacogenómica para caracterizar los subgrupos de células de SCLC.
agrupamiento no supervisado de consenso se realizó con todas las 30 líneas celulares con números de copias del gen 426, y 3 grupos, se mostró a ser óptimo para este conjunto de datos. Todos estos 426 genes fueron utilizados para generar el mapa de calor. datos de CNV fue re-codificada de acuerdo con la siguiente regla: la pérdida 0-completa; 1-pérdida parcial; 2-ningún cambio; ganancia 3~7-parcial; mayor o igual a la ganancia de 8-completo.
Nuestros análisis identificados inhibición de PLK tener una eficacia prometedora y poca actividad en ensayos clínicos en el CPCP. Por lo tanto, hemos utilizado la inhibición de PLK como un ejemplo de cómo utilizar los conjuntos de datos CGP para desarrollar un perfil genómico de sensibilidad a los fármacos SCLC. En primer lugar hemos tratado de validar la eficacia de los inhibidores de PLK en SCLC. En estos experimentos de validación se utilizó líneas SCLC de células, así como inhibidores, que eran diferentes de los utilizados en los estudios originales para poner de relieve la eficacia de estos nuevos agentes terapéuticos. Las líneas celulares de SCLC utilizados fueron H1048, H1688, SW1271 y DMS454. inhibidores de PLK incluyen BI-6727 (volasertib) y EN-01910 (rigosertib). En estos experimentos irinotecán servido como control positivo, mientras que erlotinib sirvió como control negativo. Los resultados se muestran en la Figura 5. Está claro que la IC
50 valores para los inhibidores de PLK en la mayoría de líneas de células es de entre 10 a 100 nM, apoyando la hipótesis de que las células de SCLC son en general sensibles a los inhibidores de la PLK.
las células adherentes se incubaron con las concentraciones indicadas de medicamentos para 24 h. El medio de cultivo celular fue reemplazado y la viabilidad celular se midió mediante un ensayo de ADN después de 48 h de incubación. Cada concentración de fármaco se ensayó utilizando cinco réplicas. Los resultados son representativos de al menos 2 experimentos.
Inicialmente, hemos tratado de identificar una firma genética que podría predecir la sensibilidad a los inhibidores de PLK en cohortes de pacientes, ya que no todas las células de SCLC demostraron la misma sensibilidad. Se han comparado los datos de expresión génica para los cinco CEP células más sensibles (H82, H446, H526, COR L88, IST) con SL1 que para las cinco líneas celulares de SCLC menos sensibles (DMS114, H64, DMS79, H2171, IST SL2); como se define en la CGP por sus BI-2536 IC
50 valores. Hemos identificado una lista de 185 genes que son expresados diferencialmente significativa entre estos dos grupos (listados en la Tabla S4). Estos 185 genes fueron utilizados para realizar la agrupación sin supervisión de todas las líneas celulares de SCLC, dando como resultado el mapa de calor se muestra en la Figura 6. En particular, el cinco por lo menos (cuadro superior verde) y la mayoría (cuadro superior de color rojo) líneas celulares sensibles agrupadas en los extremos opuestos el mapa de calor mientras que todas las otras células (cajas amarillas indican sensibilidad intermedia y cajas grises que indica sensibilidad desconocido) agrupadas en el centro. A continuación realizó el análisis de una sola licencia de la firma genética PLK con las 26 líneas celulares disponibles. A partir de este análisis se generaron mapas de calor 26, donde en cada mapa de calor las células sensibles y resistentes permanecieron agrupados excepto en tres mapas de calor; en el que clasificó erróneamente una o dos líneas de células sensibles. Las células resistentes siempre agrupados juntos. Por lo tanto, creemos que esta firma genética PLK es robusto en la categorización CEP líneas celulares sensibles y resistentes.
Los cinco líneas celulares de SCLC que demuestran la mayor parte (H2171, H64, IST-SL2, DMS-114, DMS-79 ) y menos (IST-SL1, COR-L88, H526, H446, H82) resistencia al inhibidor de PLK BI-2536 en el estudio CGP se utilizaron como estándares para identificar una firma gen para la sensibilidad PLK. Todas las líneas celulares de SCLC en el estudio CGP que contenían datos de expresión de genes se someten a continuación a la agrupación sin supervisión. El mapa de calor muestra el resultado de este análisis. Las cajas de colores en la parte superior del mapa de calor indican la sensibilidad CGP BI-2536. Verde = células resistentes, rojo = células sensibles, amarillo = células del intermedio, pero conocido, la sensibilidad, gris = células de la sensibilidad no probado, pero con los datos de expresión de genes.
Para validar que la firma genética PLK hace , de hecho, predecir la sensibilidad a los inhibidores de PLK, se determinó la eficacia del inhibidor de PLK BI-6727 en una línea celular, H1092, que tenía los datos de expresión de genes, pero no hay datos de sensibilidad PLK en el estudio CGP, representada por un recuadro gris en la la parte superior de la figura 6. Como controles, se utilizó una línea de células resistentes, DMS79 (caja verde), y dos líneas de células sensibles, H82 y H526 (cajas de color rojo). Se eligieron estas células, ya que todos crecieron en suspensión y podrían ser sometidos a protocolos de tratamiento de drogas idénticas. Los resultados, mostrados en la Figura 7, demostraron que H82 y H526 células fueron sensibles al inhibidor de PLK BI-6727 mientras que las células no eran DMS79, similar a los resultados reportados para BI-2536. Además, se demostró que las células H1092, con sensibilidad PLK desconocido, fueron en su mayoría resistentes a la BI-6727 como las células DMS79, como se predijo por el mapa de calor.
Las células en suspensión se incubaron de forma continua con las concentraciones indicadas de medicamentos para 72 h, cuando la viabilidad celular se midió por el ensayo de MTS. Cada concentración de fármaco se ensayó utilizando cinco réplicas. Los resultados son representativos de 2 experimentos.
Fue de interés determinar si la firma de genes PLK estaba presente en los tumores de los pacientes y podría ser utilizado para predecir la sensibilidad del tumor a los inhibidores de PLK. El mayor estudio de la expresión génica de tumores SCLC es el de Rudin et al. [8], que analizó 30 tumores primarios por RNAseq. Por lo tanto, se extrajeron los datos de conteo de los 185 sondas presentes en nuestra firma PLK (que representa 173 genes, sólo 169 genes fueron encontrados y utilizados a partir del conjunto de datos Rudin) y estándar normalizada para crear sustitutos arrays de expresión génica PLK para estos tumores. a continuación, estos datos normalizados se sometieron a la agrupación sin supervisión para generar el mapa de calor se muestra en la Figura 8. También se incluyeron en este análisis la línea celular H82 SCLC que tenía los datos del estudio RNAseq Rudin y también fue validado por nosotros en la Figura 7 como ser sensible a el inhibidor de PLK BI-6727. Los resultados demuestran dos puntos importantes: en primer lugar, los subtipos de tumores SCLC se pueden identificar mediante la firma de genes PLK, y en segundo lugar, los datos de la línea de células H82 amontonan entre un subconjunto de ocho tumores primarios. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la firma de genes PLK generado utilizando datos de la línea de células de SCLC puede ser útil en la predicción de la sensibilidad de tumores específicos a PLK inhibidores.
RNAseq datos de Rudin et al. [8] se transformó a contar de datos. Los datos correspondientes a los genes que componen la expresión de genes firma PLK fueron extraídos y utilizados en el agrupamiento no supervisado de consenso tumores SCLC y la línea de células H82. El cuadro de color rojo en la parte superior del mapa de calor indica la ubicación de la línea de células H82, que era una línea celular CGP validado como PLK sensible.
Finalmente, se utilizaron parcelas Circos [12], que se muestran condensada en la Figura 9 y la vista en la figura S3, para visualizar las diferencias genómicas entre las líneas celulares de SCLC sensibles y resistentes al inhibidor de PLK BI-2536. Sorprendentemente, las parcelas Circos demuestran que todas las células resistentes poseían sin sentido o de desplazamiento del marco mutaciones en cualquiera de
TP53
o
RB1
, ya veces ambos genes, mientras que todas las células sensibles muestran mutaciones de significado proteína desconocida (intrónica y missense), típicamente en sólo uno de estos genes. Todos menos una de las mutaciones de genes fue homocigotos, lo que indica que las células resistentes probablemente no tienen RB1 funcional o proteína TP53. Todas las células sensibles muestran
MYC gratis (H82, H446),
MYCN
(H526, IST SL1) o
MYCL gratis (CORL88) amplificación, mientras que sólo una muestra de líneas celulares resistentes
MYC
amplificación (H2171). También parece que hay poco o nada de la CNV en el cromosoma X en las células sensibles relativos a las células resistentes, que suelen mostrar cierta pérdida CNV. Los genes en el cromosoma 13 están generalmente regulados por incremento en células sensibles PLK y downregulated en las células resistentes PLK, mientras que los genes ubicados en el cromosoma 19 están generalmente regulados a la baja en las células sensibles PLK y upregulated en las células resistentes PLK. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión génica, la CNV y el estado mutacional pueden contribuir a la sensibilidad de las células de SCLC a PLK inhibición.
Circos parcelas se muestran (de izquierda a derecha, en el orden que se indica) de los cinco más sensible (H82, H446, H526, COR-L88, IST-SL1) y más resistentes (DMS-114, H64, DMS-79, H2171, IST-SL2) CEP células a la inhibición BI-2536 el crecimiento, tal como se definen en el CGP estudiar. El anillo exterior negro designa la localización cromosómica; el siguiente anillo interior indica el nivel de expresión de los genes de la firma PLK; y el más anillo interior indica la CNV. datos de CNV fue re-codificada de acuerdo con la siguiente regla: 0 pérdida completa; 1 pérdida parcial; 2 sin cambio; 3~7 ganancia parcial; mayor o igual a 8 ganancia completa. En el centro es el estado de la mutación de los genes (triángulo abierto: SNP intrónica, círculo negro: SNP de sentido erróneo, cuadrado negro: SNP sin sentido, triángulo rojo: la inserción de cambio de marco, triángulo verde: la supresión de cambio de marco). Todas las mutaciones eran homocigóticos excepto por la inserción de cambio de marco.
Discusión
de células pequeñas de cáncer de pulmón es una enfermedad en la necesidad urgente de nuevos tratamientos farmacológicos. Desafortunadamente, la limitada disponibilidad de tejido tumoral impide la adquisición de análisis genómicos completos necesarios para la identificación y validación de nuevas dianas drugable en este cáncer. Por lo tanto, las estrategias alternativas de descubrimiento de fármacos necesitan ser desarrolladas hasta que nuestra comprensión de la genómica de conducción SCLC puede empezar a aproximarse a la de NSCLC, que se beneficia de un amplio análisis de grandes cohortes de tumores de pacientes, como el del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA).
en este informe se han adoptado un enfoque bioinformáticas para el descubrimiento de fármacos para el CPCP de minería de datos de dos estudios de detección de drogas en grandes líneas de células cultivadas, la CCLE [10] y CGP [11]. Como un sistema modelo, líneas celulares de SCLC conservan los perfiles de mutación génica (cósmica) y el número de copias cambia [13], [14] similar a SCLC humano. Por lo tanto, hemos extraído y analizado datos de CEP líneas celulares con el fin de identificar las sensibilidades de medicamentos específicos para esta enfermedad, ya que no era la intención de los estudios originales, que era poner en común datos a través de una multitud de líneas de células con el fin de identificar genómico determinantes de la sensibilidad a los fármacos. Se identificaron quinasas polo similar a como dianas moleculares atractivas con poca experiencia en ensayos clínicos en curso en el CPCP. La inhibición del crecimiento por los inhibidores de PLK fue validado en nuestro estudio, atención de reclamaciones realizadas en un reciente informe sobre la inconsistencia en los datos de respuesta de drogas en grandes estudios de detección de drogas [15]. El potencial de traslación de los inhibidores de PLK en el tratamiento del SCLC el soporte de nuestro demostración de que el perfil de sensibilidad a los fármacos de las líneas celulares de SCLC refleja lo que se observa clínicamente para tumores metastásicos SCLC [16]. Es decir, la mayoría de las células eran extremadamente sensibles a los inhibidores de la topoisomerasa y de microtúbulos, agentes quimioterapéuticos que tienen actividad contra SCLC quimioterapia anteriormente; por el contrario, muchos inhibidores de la tirosina quinasa fueron ineficaces.
El estudio CGP también identificado sensibilidades de fármacos que tienden a agruparse en todas las líneas de células (véase la Tabla 1 Suplemento de referencia 11) y el perfil de sensibilidad a los fármacos para las células de SCLC, como se muestra en la Tabla 1, es muy similar a agruparse 4 del estudio CGP [grupo 4 = GW-843682X (Plk1), BI-2536 (Plk1 /2/3), a-443654 (AKT1 /2/3), epotilona B (microtúbulos), CGP-60474 (CDK1 /2/5/7/9), paclitaxel (microtúbulos) y MS-275 (HDAC)]. Aunque aún no es claro si estos cúmulos de los productos indican una vía específica común (s) que conduce a la inhibición del crecimiento, estos grupos pueden proporcionar un punto de partida práctico para probar terapias con medicamentos combinatorias para la actividad sinérgica en el CPCP. De hecho, nuestros propios datos preliminares muestran sinergismo entre los inhibidores de CDK y PLK.
Hemos desarrollado un análisis altamente integrado de la sensibilidad PLK en líneas celulares de SCLC, gráficamente representado en la Figura 9 parcelas como circos, que incorpora la expresión génica, la CNV y los datos de mutación de genes. Un análisis de esta profundidad nunca se ha aplicado previamente a SCLC, y demuestra lo que puede lograrse interrogar a un único linaje celular y la clase de fármaco en el CCLE y conjuntos de datos CGP. Además, nuestro hallazgo de que la firma de genes PLK para líneas celulares de SCLC se dispersó entre los perfiles de expresión muestra de tumor de SCLC (Figura 8) demuestra claramente que estas células conservan fenotipos tumorales. Características de las parcelas Circos tales como la doble mutación de ambos
TP53 Opiniones y
Hoteles en RB1 PLK células resistentes, así como la expresión recíproca de PLK firma genes en los cromosomas 13 y 19, son fácilmente aparente y debe ser examinado en las cohortes más grandes para determinar su contribución individual a la sensibilidad global inhibidor de PLK. En su conjunto, este tipo de análisis puede ayudar a identificar eventos genómicas aguas arriba que se correlacionan con fenotipos intermedios tales como la sensibilidad PLK.
Recientemente se ha informado que las mutaciones en el
Plk1
gen en sí mismo son los principales responsables para la resistencia adquirida a BI2536 en una línea celular de cáncer de colon humano cultivadas [17]. Esto es poco probable que sea un mecanismo de resistencia en las líneas celulares de SCLC porque las listas CCLE sólo cuatro líneas celulares con un solo
PLK
mutación entre los cuatro miembros de la familia PLK (PLK1-4) y 53 líneas celulares de SCLC examinados. Ninguna de estas líneas de células mutadas PLK se incluyeron en nuestro estudio. Nuestra firma genética PLK, sin embargo, incluyen genes en los cromosomas normalmente eliminados (4q, 13q) y amplificados (19p) en el CPCP [9], [13], [14], a pesar de nuestras parcelas Circos no muestran una correlación obvia entre los dos. Curiosamente, el cromosoma Xq, que no se ve típicamente como una región importante de la CNV en el CPCP, fue el hogar de varios de los más importantes genes expresados diferencialmente que comprenden el gen PLK en firmas todos eran miembros de la MAGE-A, o melanoma- antígeno asociado-A, subfamilia. Esta subfamilia de genes se encuentra en el cromosoma Xq28 y sólo se expresa en células germinales de testículo y células tumorales [18]. Aunque su función biológica está claro, que representan una clase de antígenos tumorales que están siendo investigados activamente como un objetivo para la inmunoterapia [19], [20]. Los genes MAGE-A se upregulated en líneas celulares PLK-sensibles relativos a las líneas de células PLK-insensibles. Por otra parte, estos patrones de expresión se pueden correlacionar con la CNV, como las células sensibles demostraron poco CNV en el cromosoma X, mientras que las células más resistentes demostraron una cierta pérdida de la CNV. Actualmente estamos probando la importancia de esta familia de genes como un biomarcador de la sensibilidad PLK.
Durante nuestro estudio un informe de Sos et al. [21] fue publicado en PNAS que examinó específicamente sólo CEP líneas celulares (44 en total) para la sensibilidad a los fármacos. De los 267 compuestos probados en este estudio, sólo 13 fueron también examinadas en el CCLE y /o estudios de CGP. Curiosamente, cuando Sos et al. buscado sensibilidad a los fármacos específicamente en
MYC líneas celulares
-amplified, también encontraron que el inhibidor de PLK BI-2536 para ser activo, similar a nuestros resultados, pero no persiguió más a fondo. También mostraron que la mayoría de las células sensibles a la Aurora inhibidor de quinasa VX-680 demostrado
MYC
-amplification. Curiosamente, el CGP también incluyó dos inhibidores de la Aurora quinasa (VX-680 y ZM-447439) en su estudio; Sin embargo, no se encontró ninguna agrupación significativa de PLK con inhibidores de la quinasa Aurora, indicando que no hay relación entre estas dos clases de inhibidores cuando se analizaron en la población general de las líneas celulares de cáncer.
En el presente estudio se identificaron tres consistentemente subtipos de CEP líneas celulares utilizando agrupamiento no supervisado de cualquiera de la expresión génica o la CNV conjuntos de datos de la CGP o CCLE (Figura S4 y S3 cuadro) estudios. Sorprendentemente, hubo poca concordancia entre estos dos análisis excepto que una gran mayoría de las células agrupadas en un solo subtipo predominante, mientras que las células restantes divididos desigualmente entre dos subtipos de menor importancia. Expresión de genes y subtipos de la CNV también no se alinean con sensibilidad a los fármacos en general (ver figuras 3 y S2) o sensibilidad PLK en particular. Esto sugiere que un enfoque de la genómica amplia, tales como análisis de la representación circos, es necesario identificar los determinantes críticos de sensibilidad a los fármacos y otros fenotipos en SCLC. Este enfoque integrado puede ayudar a seleccionar a los pacientes con CPCP que más se beneficiarían del uso de agente único de fármacos como HDAC [22] y PLK [23] inhibidores que son ampliamente efectiva a través de las líneas celulares de SCLC, pero demuestran una actividad limitada en ensayos clínicos.
se han tomado
Otros enfoques únicos para identificar nuevas y efectivas terapias para el CPCP. Jahchan et al. identificado una sorprendente sensibilidad de las células de SCLC a los antidepresivos tricíclicos en un estudio de reposicionamiento de drogas, que utilizan la bioinformática para encontrar fármacos que inducen cambios en la expresión génica opuesto al perfil de expresión génica de las células de SCLC [24]. Se han usado de fase inversa arrays de proteínas (RPPA) para identificar PARP1 y EZH2 como posibles dianas terapéuticas en SCLC [25]. En última instancia, hay una necesidad de revelar la biología subyacente de SCLC si esperamos realizar cualquier mejora en el tratamiento de esta enfermedad similar a la NSCLC. Por desgracia, sólo alrededor de cincuenta tumores SCLC han sido objeto de análisis genómico amplio para la fecha-siendo la mayoría de la enfermedad en etapa primaria, temprana [8], [9]. Por lo tanto, el progreso terapéutico inmediato en este campo dependerá de descubrimiento en sistemas modelo, como la descrita aquí, seguido de la validación en cohortes de pacientes.
Materiales y Métodos
inhibición
Cultivo de células y el crecimiento los estudios
se obtuvieron Todas las células de la ATCC y se cultivaron en su medio recomendado. La proliferación celular se determinó cuantitativamente mediante el ensayo de ADN fluorescente [26] para las células adherentes o ensayo MTS utilizando el CellTiter 96 Solución acuosa Una proliferación celular Kit de ensayo de Promega Corp. (Fitchburg, WI) para las células en suspensión. Las células se añadieron a una placa de 96 pocillos en 100 l de medio completo. Drogas que contiene el medio se añadió a las concentraciones indicadas un día después de la siembra. Irinotecan se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), mientras que todos los demás medicamentos se obtuvieron de Selleck Químicos (Houston, TX). Después de la incubación durante tres días a 37 ° C, el ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de DNA, la fluorescencia se midió usando filtros de excitación /emisión 355/460 nm, mientras que de absorbancia para el ensayo de MTS se midió a 490 nm. Ambos ensayos se midieron con un lector de placas de 96 pocillos. Cada condición experimental se ensayó utilizando cinco réplicas. Medicamentos que contienen medio se retiró de las células adherentes después de 24 h de incubación y se reemplazó con 100 l de medio completo, mientras que las células en suspensión se cultivaron en presencia continua de fármaco durante 72 h.
Conjuntos de datos
el CCLE a disposición del público y de la sensibilidad de drogas CGP (IC
50), la expresión génica, la CNV, y la mutación de datos ha sido descargado de http://broadinstitute.org/ccle (CCLE) y http://cancerrxgene.org (CGP) [10], [11]. Los datos RNAseq obtenidos en el estudio de Rudin et al. [8] ha sido descargado de la base de datos del genoma Europea. Todos los análisis de manipulación de datos y estadísticos se realizaron con SAS versión 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) o R 2.15.3 (http://www.r-project.org/).
IC
50 análisis de datos
en SCLC solamente, 24 medicamentos y 53 líneas celulares fueron incluidos en el CCLE, mientras que 92 medicamentos y 31 líneas celulares fueron incluidos en el CGP. Todo IC
50 mayor que 8 M en el CGP se thresholded en 8 M. Se elaboraron diagramas de caja para el IC
50 a partir de los dos conjuntos de datos, respectivamente, utilizando R (http://www.r-project.org/). parcelas de mosaico se extrajeron utilizando sgrender proc en SAS versión 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Los datos de expresión génica análisis
La normalización de los datos de expresión génica (Affymetrix U133 Plus 2.0 para CCLE , Affymetrix U133A para CGP) que participan cuatro pasos: 1) los datos en bruto se normalizaron a través del método robusto multi-array media (RMA); 2) sondas sin un nombre de genes fueron retirados; 3) los datos a nivel de genes se obtuvo promediando el valor de la sonda dentro de cada gen y 4) los datos a nivel de genes era entonces estándar normalizada por el gen. Para los datos de expresión génica, la CCLE incluye 51 líneas celulares, mientras que el CGP incluyó a 30 líneas celulares, entre los cuales tres líneas celulares tenían mediciones por duplicado. Promedio de los duplicados generan 27 líneas de células únicas para el CGP. agrupamiento no supervisado de consenso se realizó sobre los datos a nivel de gen normalizadas con el paquete R "Consenso Cluster Plus";