Extracto
El número de cánceres renales ha aumentado en los últimos diez años y la supervivencia del paciente en etapas avanzadas sigue siendo muy pobre. Por lo tanto, los nuevos enfoques terapéuticos para el cáncer renal son esenciales. Englerin A es un producto natural con una citotoxicidad muy potente y selectivo contra las células de cáncer renal. Esto hace que sea un candidato prometedor fármaco que puede mejorar los niveles actuales de tratamiento para los pacientes con cáncer renal en todas las etapas. Sin embargo, poco se sabe sobre el modo de acción de englerin A en atacar a las células cancerosas específicamente renales. Nuestro estudio es el primero para investigar el mecanismo biológico de englerin Una acción en detalle. Nos informan de que englerin A es específico para las células tumorales renales y no afecta a las células normales del riñón. Encontramos que englerin Un tratamiento induce la muerte celular necrótica en células de cáncer renal, pero no en las células normales del riñón. Además, muestran que la autofagia y proteínas pyroptotic no se ven afectadas por el compuesto y que la señalización necrótico en estas células coincidió con la producción de especies reactivas de oxígeno y la entrada de calcio en el citoplasma. Como el primer estudio para analizar los efectos biológicos de englerin A, nuestro trabajo proporciona una base importante para la evaluación y validación del uso del compuesto como un fármaco anti-tumoral. También proporciona un contexto en el que la identificación del objetivo u objetivos de englerin Una específico en las células de cáncer renal
Visto:. Sulzmaier FJ, Li Z, Nakashige ML, Fash DM, Cadena WJ, Ramos JW (2012) Englerin a induce selectivamente necrosis en células de cáncer renal humano. PLoS ONE 7 (10): e48032. doi: 10.1371 /journal.pone.0048032
Editor: Kalpana Ghoshal, La Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2012; Aceptado: September 26, 2012; Publicado: 22 Octubre 2012
Copyright: © Sulzmaier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional de Medicina general (R01GM088266 a JWR) y el Victoria S. y Bradley Fundación L. Geist (47030 al CJM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer renal es una de las enfermedades más comunes en los EE.UU. con un estimado de 60,920 nuevos casos y 13.120 muertes en 2011. Alrededor del 85% de todos los cánceres renales se clasifican como carcinomas de células renales, un tumor maligno derivado de la epitelio renal [1], [2]. El tratamiento primario para los pacientes con carcinoma de células renales es la escisión quirúrgica. Sin embargo, aproximadamente el 25% de los pacientes muestran signos de invasión o metástasis locales que hacen una escisión completa difícil [2]. Una vez que la enfermedad está en una etapa avanzada, la cirugía sola no es suficiente y la supervivencia de los pacientes de 5 años se reduce de 70% a menos del 20% [1], [3]. Históricamente, el estado de la técnica de tratamiento para los pacientes con carcinoma de células renales ha sido la terapia inmunomoduladora con interferón-α o interleucina-2 [4]. Sin embargo, los últimos años han visto un aumento en el uso de enfoques más específicos para tratar el cáncer renal en etapa avanzada. El descubrimiento de la von Hippel-Lindau (VHL) tumor supresor gen conducen al desarrollo de terapias basadas en la tirosina quinasa del receptor de orientación de la vía VEGF o TGF-α señalización [5], [6]. VHL regula la angiogénesis y una pérdida de este gen en células de cáncer resultados en aumento de la producción de factores de crecimiento como VEGF [7]. Como alternativa, los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor como Sorafenib que bloquear la señalización a través de vías afectadas están aprobados o en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer renal avanzado [8]. Sin embargo, estos fármacos no son aplicables para todos los pacientes con cáncer renal avanzado y efectos secundarios graves han sido reportados en algunos casos [2], [9].
Englerin A es un sesquiterpeno Guaiane que mostró especificidad intrigante como inhibidor de crecimiento de células de cáncer renal [10]. El producto natural fue aislado de la corteza del
Phyllanthus engleri
, una planta originaria de Tanzania y Zimbabwe. Un Englerin se proyectó para la actividad citotóxica específica contra un panel de líneas celulares de cáncer (NCI panel de 60 celdas). En esta pantalla, el compuesto mostró GI específica cáncer renal
50 valores que eran hasta 1000fold menor que en otras líneas celulares de cáncer. GI
50 valores determinados eran tan bajos como 11 nM para ciertas líneas celulares de cáncer renal [10], [11]. Un Englerin no sólo mostró especificidad extraordinaria para las células de cáncer renal, en algunos casos, su potencia era incluso más alto que el estado de los tratamientos de la técnica como sorafenib [10], [12]. Después de su descripción inicial en 2009, los laboratorios de todo el mundo han descrito estrategias sintéticas para hacer que el producto natural [13], [14], [15], [16], [17], así como cantidades crecientes de estructura-actividad los datos [11], [18], [19], [20], [21], [22]. A pesar de su alto impacto, la literatura sobre englerin Una es todavía limitada y los artículos publicados se refieren principalmente a la síntesis del compuesto. Ahora informe por primera vez un mecanismo por el cual englerin A actúa sobre las células de cáncer renal para inhibir el crecimiento celular. Nuestros resultados muestran que englerin A induce específicamente la muerte celular necrótica en líneas celulares de cáncer renal, pero no afecta a la viabilidad de una línea celular de cáncer glioblastoma o células de riñón normales. Nuestro estudio aporta información adicional sobre la actividad biológica de englerin A.
Materiales y Métodos
Reactivos
Englerin A se sintetiza en el laboratorio del Dr. William J. Cadena de acuerdo con el protocolo publicado previamente [12]. Estaurosporina se adquirió de Merck Chemicals (Merck, Darmstadt, Alemania), ionomicina y cloroquina difosfato se adquirió de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).
Líneas celulares y cultivo celular
líneas de carcinoma de células renales Humanos A-498 y UO-31, así como la línea de células de glioblastoma humano SF-295 se obtuvieron del tumor Repositorio DCTD del Instituto Nacional del cáncer, Frederick, Maryland. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Mediatech Inc., Manassas, VA) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY), 1% de ácidos MEM no esencial amino (NEAA, Mediatech) y 1% penicilina estreptomicina (PenStrep, Mediatech). células HEK293 se adquirieron de ATCC (Rockville, MD) y se mantuvieron en DMEM (Mediatech) suplementado con 10% FBS, 1% NEAA y 1% PenStrep. células de los túbulos proximales renales (POCT) fueron adquiridos de Supervivencia Celular Tecnología (Frederick, MD). Las células fueron cultivadas en medio completo RenaLife (Cell Technology línea de vida). Todas las células se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un incubador humidificado.
viabilidad celular Ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos en 90 l de RPMI sin rojo fenol y sin antibióticos, suplementado con 10% FBS y 2 mM de L-glutamina. Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células por pocillo. Las células se dejaron para anclar abajo durante 60 min a 37 ° C y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Después de 60 min, se añadieron 10 l de englerin una solución de trabajo o un volumen equivalente de DMSO diluida en medio RPMI. Un englerin una solución madre se preparó disolviendo el compuesto en DMSO a una concentración de 10 mM. Todo englerin además un soluciones de trabajo se prepararon por dilución de esta solución madre con medio RPMI a la concentración final deseada como se indica. El volumen de englerin Un control de solución madre de DMSO o vehículo, por tanto, nunca excedió de 0,1% del volumen final. Después de la adición del compuesto, las células se incubaron durante 48 h. La viabilidad celular se determinó usando un Ensayo de proliferación celular (XTT) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en 90 l de cultivo medios sin rojo fenol y antibióticos. Las células se dejaron para anclar abajo durante 60 minutos bajo condiciones de cultivo normales. Después de que el período de incubación de 10 l englerin A diluciones o el disolvente DMSO como control se añadieron a los pocillos. Las células se incubaron durante 48 h con el compuesto antes de someterlas a un Ensayo de proliferación celular (XTT) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
Microscopía
micrografías campo claro se tomaron utilizando un Zeiss microscopio Axiovert200M con un objetivo de 40x. Las imágenes adquiridas fueron analizados utilizando el software AxioVision. Las barras de escala representan 20 micras.
Anexina V /PI ensayo
Las células fueron tratadas con 1 mM englerin A, portador de DMSO o 5 M estaurosporina por la cantidad indicada de tiempo (1h o 3h) . Después de la incubación, las células se tripsinizaron y se tiñeron para la expresión fosfatidilserina extracelular usando etiquetado FITC-anexina V y yoduro de propidio (PI) como co-mancha para probar la integridad de la membrana celular (BD Biosciences, San Jose, CA). Los colorantes se utilizan de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se analizaron las células teñidas utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences) y CellQuest Pro software de análisis.
lisis celular e inmunotransferencia
Los lisados celulares se prepararon utilizando un tampón de lisis MLB (1% NP-40, 25 mM de HEPES-KOH (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,25% de desoxicolato de sodio, 10% de glicerol, 10 mM MgCl
2, EDTA 1 mM e inhibidores de proteasa /fosfatasa). Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE, seguido por inmunotransferencia. La expresión de proteínas se detectó con anticuerpos específicos primarios contra PARP, la caspasa 3 y GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), así como la caspasa 1 (EMD Millipore, Billerica, MA), Beclin-1 (Epitomics, Burlingame, CA) y LC-3 (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO). La unión de los anticuerpos primarios se detectó usando IRDye 680 cabra anti-ratón y IRDye 800 cabra anti-conejo secundaria de anticuerpos. Las bandas se visualizaron utilizando un sistema de infrarrojos Odyssey Imaging (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE).
Ensayo de actividad de caspasa 3
Actividad de la caspasa 3 en células tratadas con englerin A, estaurosporina o DMSO portadora el control se analizó utilizando un Kit de caspasa 3 Ensayo de actividad (Roche Diagnostics). Después de la incubación con las células compuestos se lisaron y se analizaron los lisados celulares de acuerdo con el protocolo del fabricante.
ROS ensayo de detección
Las células tratadas con englerin A, estaurosporina o control de los transportistas DMSO se ensayaron para su producción de especies de oxígeno y de nitrógeno reactivos utilizando el Kit total ROS detección (Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY). Las células se trataron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cambio relativo en oxígeno reactivo o especies reactivas de nitrógeno se midió utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences) y CellQuest Pro software de análisis.
concentración intracelular de calcio intracelular de Ca
2 + ensayo de
se midió después de células se trataron con englerin A, portador de DMSO o ionomicina control positivo. Después de la incubación de 30 minutos con el compuesto 2 M Fluo-3 a.m. se añadió (Life Technologies) para la posterior incubación de 30 minutos. Después de la incubación, las células se tripsinizaron y se lavaron con 1x PBS. Fluo-3 de unión a Ca
2 + iones se midió a través de un aumento de la emisión de fluorescencia del tinte a 520 nm tras la excitación a 485 nm. Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences) y CellQuest Pro software de análisis.
Resultados
sintetizados químicamente englerin A reduce la viabilidad de las líneas celulares de cáncer renal
A Englerin se ha descrito que tienen potente actividad en la inhibición de crecimiento de células de cáncer renal [10]. Publicaciones recientes describen métodos para una producción sintética de englerin A sin la necesidad de aislar el producto natural [13], [14], [16], [17]. Todo englerin A en nuestro estudio (estructura química ver Fig. 1
Un
) ha sido sintetizado siguiendo el protocolo descrito en nuestro reciente artículo de Li y sus colegas [12]. Con el fin de evaluar la potencia de la englerin A sintética que exhibió sus efectos citotóxicos en las dos líneas celulares de cáncer renal humano (UO-31 y A-498) que se han descrito antes que ser sensible al producto natural. Como línea celular de control se utilizó una línea de células de glioblastoma humano (SF-295), se informó anteriormente a no responder a englerin A [10]. Además se analizaron los efectos de englerin Un tratamiento sobre la viabilidad de una línea celular de riñón inmortalizada derivada de células normales de riñón embrionario humano (HEK293) y células humanas normales renales epiteliales (células del túbulo proximal renal, POCT). La viabilidad se determinó mediante la medición de la actividad metabólica de las células
.
(A) Estructura química de englerin A. (B) Glioblastoma (SF-295), células de riñón de inmortalizadas normales (HEK-293), túbulo proximal renal células (POCT) y las células de cáncer renal (UO-31, a-498) se incubaron con la concentración indicada de englerin a para 48 h. La viabilidad celular se analizó utilizando una célula de ensayo de proliferación XTT. Los resultados se muestran en% de viabilidad en comparación con una muestra de células tratadas con el vehículo DMSO. Los valores mostrados representan la media ± SEM de todos los experimentos (n≥6). Los valores de CI50 se calcularon con Prism 5 usando un ajuste de regresión no lineal (log (inhibidor) vs. normalizado respuesta - pendiente variable).
Hemos encontrado que englerin A redujo la viabilidad de las células de cáncer renal mientras que no tuvo efectos citotóxicos sobre la línea celular de glioblastoma de control (Fig. 1
B Opiniones). Curiosamente, el compuesto no afectó la viabilidad de las células HEK293 bien y sólo la viabilidad celular cambiado en RPTCs a concentraciones muy altas (Fig. 1
B Opiniones,
la izquierda). IC
50 valores se determinaron como 140,3 nM para UO-31 células y 53.25 nM para células A-498. El IC
50 para RPTCs fue de aproximadamente siete magnitudes superior y se calculó como 2,53 M.
Englerin A causa cambios morfológicos diferentes de estaurosporina la apoptosis inducida por
Para excluir englerin A efectos sobre las células proliferación que habría representado la disminución observada en la actividad metabólica que analizó la morfología celular después del tratamiento con englerin a usando un microscopio de campo claro. Los cambios morfológicos también han permitido diferenciar entre la muerte celular apoptótica y necrótica. Para este análisis se Además comparó la morfología de las células en respuesta a la incubación con estaurosporina, un conocido inductor de apoptosis [23].
Hemos encontrado que englerin Un tratamiento de las células de cáncer renal dio como resultado un cambio obvio en la morfología celular que señala a la muerte celular (Fig. 2). No hay diferencias en la forma de la célula o la estructura podrían ser observados en células de glioblastoma SF-295 tratadas con el compuesto. las células de cáncer renal tratados con englerin A perdieron extensiones de filopodios, llegando finalmente a una estructura redonda, simétrica, antes de separar completamente de la matriz. apoptosis inducida por estaurosporina tanto en las células de cáncer renal y glioblastoma. La muerte celular apoptótica se caracteriza por encogimiento de las células y la formación de cuerpos apoptóticos en los alrededores de la célula moribunda. Aunque el tratamiento con englerin A causó una disminución relativa en el volumen celular, no pudimos observar la formación de cuerpos apoptóticos claras. Tanto estaurosporina y englerin Un causaron las células de cáncer renal que mueren, pero en formas morfológicamente distintas.
Las micrografías muestran la morfología de las células tratadas con englerin A o estaurosporina, un conocido inductor de la apoptosis. Las células se trataron con 1 M englerin A o vehículo DMSO durante 60 min, o 1 estaurosporina mu M durante 5 h. Fotos fueron tomadas usando un microscopio Zeiss Axiovert200 M con un objetivo de 40 × fase. Para cada tratamiento, se adquirieron 5-10 campos aleatorios de visión. El experimento se repitió tres veces, las micrografías muestran son representativos de la morfología celular media tras el tratamiento. Las barras de escala representan 20 micras.
Englerin un tratamiento da como resultado una pérdida de la integridad de la membrana, pero no en la regulación de la fosfatidilserina externa indicativo de apoptosis etapas tempranas
El morfológicamente diferentes resultados en las células tratadas con la estaurosporina apoptosis-inductor nos llevó a analizar si las células de cáncer renal mueren a través de procesos de señalización necróticas en lugar de la apoptosis cuando se incubaron con englerin A. Sin embargo, las medidas directas de necrosis son escasos y la forma más común de confirmar celular necrótica la muerte es mediante la exclusión de que una célula muere por apoptosis [24]. Primeras etapas apoptóticas se caracterizan por un aumento de la fosfatidilserina (PS) en el lado extracelular de la membrana de la célula seguido de la pérdida de integridad de la membrana en las últimas etapas de apoptosis [25]. Utilizamos marcado con FITC Anexina V y yoduro de propidio para analizar estos dos parámetros por citometría de flujo, que es un enfoque común para determinar si la muerte celular es de apoptosis o necrosis [26], [27]. Se cuantificaron las subpoblaciones de células correspondientes a las etapas temprana apoptóticas y apoptóticas /necróticas finales de los años midiendo el porcentaje de células que expresan PS extracelular con o sin la pérdida de la integridad de la membrana (Fig. 3).
Las células fueron tratadas con 1 M englerin a o vehículo DMSO durante 60 min, o 5 estaurosporina mu M durante 3 h. Después de la incubación, las células se tripsinizaron y se tiñeron para la expresión fosfatidilserina extracelular usando etiquetado FITC-anexina V y yoduro de propidio (PI) como co-mancha para probar la integridad de la membrana celular. Se muestra un representante resultado de tres repeticiones experimentales independientes. Cuantificaciones y estadísticas de todos los datos se representan como gráficos de barras y muestran la distribución de células positivas a la anexina V (estadios temprano de apoptosis) de unión o de unión a anexina V y la captación de yoduro de propidio (últimas etapas apoptóticas /muerte necrótica). Los valores mostrados son la media ± SEM (n = 3), las diferencias estadísticamente significativas están marcados con asteriscos (*** p & lt; 0,001), N. S. = No significativo.
Como era de esperar, la línea celular de control SF-295 no mostraron un aumento significativo en las poblaciones de células apoptóticas cuando son tratados con englerin A o el control de los transportistas DMSO. tratamiento estaurosporina causó la muerte celular apoptótica en todas las líneas celulares acompañados por un aumento tanto en las poblaciones de células apoptóticas tempranas y tardías. las células de cáncer renal A-498 fueron las más sensibles, que muestra el porcentaje más alto (27%) de finales de células apoptóticas /muertas. líneas de células SF-295 y UO-31 mostraron poblaciones elevados en las primeras etapas de apoptosis de alrededor de 12 a 20%. Un claro aumento de células apoptóticas tempranas también fue visible después de 1 h de tratamiento con estaurosporina (Fig. S1).
Curiosamente, englerin Un tratamiento no afectó a las poblaciones de células de la misma manera. No se encontraron cambios significativos de poblaciones de células apoptóticas tempranas (Anexina V sola positivo), ya sea en UO-31 o células A-498 después del tratamiento con englerin A. El tratamiento hizo que las células pierdan integridad de la membrana temprano, que conduce a una tinción positiva doble de las celdas. Mientras que el porcentaje de células apoptóticas en el sector temprana no aumentó, se observó un aumento estadísticamente significativo de aproximadamente el 10-15% de células muertas en las muestras de células UO-31 y una población positiva doble de hasta el 27% en las células A-498 después de 1 h de tratamiento (Fig. 3, gráficos de barras). Incluso a una más tarde punto de tiempo el número de células individuales positivas, temprano de apoptosis no aumentó en los tratamientos englerin A (Fig. S1). DMSO tratamiento de ambas líneas celulares de cáncer renal (UO-31 y A-498) no indujo una significativa regulación de cualquiera único positivo (Anexina V) o doble positivo (anexina V y PI) poblaciones.
Englerin a la muerte celular inducida es independiente de la escisión de PARP y caspasa 3 actividad
La muerte celular apoptótica está en parte mediada por caspasas efectoras como la caspasa 3 que escinden y activar objetivos de abajo como poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) . PARP se cree que ayuda en la señalización apoptótica por el agotamiento de los recursos energéticos células [28]. por lo tanto, la hendidura y la activación de estas proteínas es un marcador de una cascada de señalización apoptótica activada. Para confirmar aún más que las células de cáncer renal tratados con englerin A no mueren por apoptosis se evaluó la división de PARP (Fig. 4
Un
) y la escisión y la actividad de la caspasa 3 (Fig. 4
y B Opiniones). Como control, el tratamiento de células SF-295 con estaurosporina para 4 o 5 h dado lugar a bandas de proteína escindidos en 17 y 19 kDa indicativos de los fragmentos de proteína activos. Del mismo modo, el tratamiento estaurosporina de las células SF-295 causó la escisión de PARP, como se indica por el 89kDa escinde fragmento. Se encontró que englerin A no afectó a la escisión de estas dos proteínas en las células de cáncer renal SF-295 o (UO-31 y A-498). No hemos podido detectar bandas para la caspasa 3 escindida o PARP en el tratamiento de las líneas celulares con englerin A para 1 o 4 horas (Fig. 4
Un
). tratamientos de control de todas las líneas celulares con el soporte de DMSO para la misma cantidad de tiempo no dio lugar a la escisión detectables de caspasa 3 o PARP (Fig. 4
A,
panel derecho).
Las células se trataron con 1 M englerin a, portador de DMSO o estaurosporina 5 M para la cantidad indicada de tiempo. (A) Después de la incubación, las células se lisaron y los lisados se analizaron mediante inmunotransferencia para la escisión de PARP o de larga duración y se escindió de la caspasa 3 (Casp3-fi, Casp3-CL). La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por el sondeo de GAPDH. De cuerpo entero y bandas escindidas se indican. El experimento se repitió tres veces. (B) Como alternativa, después de la incubación las células se lisaron y la actividad de caspasa 3 se ensayó usando un kit de ensayo de la actividad de caspasa 3. Los valores mostrados son medias ± SEM (n = 6), las diferencias estadísticamente significativas están marcados con asteriscos (*** p & lt; 0,001). (C) Las células se trataron con 1 M englerin A, portador de DMSO durante 60 min o 50 difosfato M cloroquina (cloro) durante 18 h. Después de la incubación, las células se lisaron y los lisados se analizaron por inmunotransferencia para Beclin-1, LC3-I /II y la caspasa 1 de escisión (p45 proenzima y se escindió p20 subunidad activa). La igualdad de carga de proteínas fue confirmada por el sondeo de GAPDH. Todas las membranas se analizaron mediante IRDye anticuerpos secundarios y un sistema de Odyssey Licor. Las membranas se muestran corresponden a experimentos representativos.
Para confirmar este resultado se analizó la actividad de la caspasa 3 con un ensayo basado en ELISA que mide la actividad enzimática directamente a través de la escisión de un sustrato de caspasa 3. Como era de esperar, el tratamiento estaurosporina resultó en un aumento de la actividad de caspasa 3, tanto en la línea celular de control glioblastoma y la línea celular de cáncer renal A-498. Englerin Un tratamiento no dio lugar a un aumento significativo en la actividad enzimática indicativas de la activación de la caspasa 3 (Fig. 4
B Opiniones).
Englerin A no induce la caspasa 1 de escisión
Pyroptosis es un modo de muerte celular causada por las vías de inflamación. La señalización es independiente de las caspasas efectoras relacionados con la apoptosis 3 y 7, pero implica la liberación de interleuquina-1β activa mediada por la caspasa 1 [29], [30]. Aquí se midió la caspasa 1 de escisión como un indicador de la muerte celular pyroptotic. Hemos seguido la dinámica de la activación de la caspasa 1 mediante la detección de los niveles de la pro-enzima de 45 kDa y 20 kDa reducido la caspasa 1 isoforma después del tratamiento con englerin A (Fig. 4
C
). Curiosamente, encontramos que la caspasa 1 se activa a un nivel bajo en los dos tipos de líneas celulares probadas, con diferentes niveles de expresión que son más altos en las células SF-295 y más bajos en A-498 células. Se detectaron bandas ligeras para exfoliados caspasa 1 isoformas en muestras de SF-295 células de glioblastoma y UO-31 células de cáncer renal. Sin embargo, el tratamiento con englerin A no aumentó significativamente los niveles de caspasa 1 de escisión indicativo de la señalización de pyroptotic. Las intensidades de banda para el fragmento escindido caspasa 1 son igualmente baja. Los niveles de p45 pro-enzima apenas cambian a englerin Un tratamiento (Fig. 4
C
)
Englerin A no induce la autofagia
La autofagia es un proceso celular en el que citoplasmática el material se degrada con la ayuda de los lisosomas. El mecanismo de por sí es una vía de reciclaje que se asocia generalmente con la supervivencia celular. Sin embargo, hay informes de las células sometidas a un modo de muerte celular en el cual las células hasta de regular la señalización autophagic (a pesar de que la autofagia no es la causa de la muerte celular en este escenario). El resultado se denomina muerte autofagia celular [31], [32]. La activación de la autofagia puede analizarse siguiendo el procesamiento de la LC3 marcador autophagic y su conversión desde la LC3 I isoforma a la forma LC3 II que se acompaña de un cambio en el peso molecular [31]. Otro marcador temprano de la autofagia es Beclin-1, que es regulada hasta después de la inducción de la autofagia y desencadena la formación de autofagosomas [33], [34].
determina si englerin Un tratamiento induce la autofagia en el grupo experimental líneas celulares siguiendo los cambios en LC3 y Beclin-1 (Fig. 4
C
). Como control positivo para la detección de la isoforma LC3 II se trataron todas las líneas celulares con 50 cloroquina mu M (cloro) durante 18 h, una sustancia muestra para detener la autofagia en la etapa autophagosomal que resulta en aumento de los niveles de LC3 II [35], [ ,,,0],36]. El tratamiento con cloroquina resultó en un fuerte incremento de los niveles de LC3 II en todas las células ensayadas. La isoforma LC3 que fue detectable en todas las líneas celulares en todas las condiciones de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con englerin A o el DMSO portador no dio lugar a una regulación significativa de LC3 II. A pesar de que hemos sido capaces de detectar bandas débiles de esta LC3 isoformas en SF-295 y UO-31 células, si el nivel LC3 II no aumentó significativamente en englerin Un tratamiento (Fig. 4
C
).
Beclin-1 se pudo detectar niveles en todas las líneas celulares experimentales. Los niveles más bajos se encuentran en las células SF-295, niveles más altos en las células A-498. El tratamiento con englerin A o cloroquina no dio lugar a diferencias en los niveles Beclin-1 en células de cáncer renal glioblastoma o. Un Englerin no condujo a una regulación significativa de beclin-1 los niveles de expresión (Fig. 4
C
).
Englerin A hace que la producción de especies reactivas de oxígeno
estrés oxidativo inducido por la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) es un factor conocido que causa la muerte celular necrótica [24]. Por lo tanto, hemos tratado de analizar si englerin A causó un aumento de ROS intracelulares. Se han tratado SF-295 y A-498 células con el compuesto y se midió el contenido del total de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (Fig. 5
Un
).
Las células (A) fueron tratados con ya sea 1 M englerin a o vehículo DMSO durante 60 min. El cambio relativo en oxígeno reactivo (ROS) o especies reactivas de nitrógeno (RNS) en comparación con células tratadas con el DMSO portador se midió usando el kit de detección total ROS. Los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia en un experimento representativo (panel izquierdo). cambios relativos cuantificados en ROS /RNS mostrados (panel derecho) son medias ± SEM (n = 5), las diferencias estadísticamente significativas están marcados con asteriscos (* P & lt; 0,05). (B) Las células se trataron con 1 M englerin A o vehículo DMSO durante 60 min, o 10 mM ionomicina durante 50 min. Fluo-3 de unión a Ca
2 + iones se midió a través de un aumento de la emisión de fluorescencia del tinte a 520 nm tras la excitación a 485 nm. Los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia en un experimento representativo (panel izquierdo). cambios relativos cuantificados en iones de calcio intracelular que se muestran (panel derecho) son medias ± SEM (n = 3), las diferencias estadísticamente significativas están marcados con asteriscos (* P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001).
en nuestro estudio, englerin a no afectó a la cantidad relativa de ROS en células SF-295 en comparación con un tratamiento con el control de DMSO portador. Sin embargo, 498-A células reaccionaron fuertemente a englerin A mediante la producción de concentraciones de ROS significativamente mayor que en las células de control. La cantidad total de especies reactivas era aproximadamente 2,5 veces mayor cuando las células A-498 fueron tratados con englerin A.
Englerin A induce un aumento en intracelulares de Ca
2 + concentración
El calcio se ha demostrado que regulan la señalización necrótico. afluencia excesiva de extracelular Ca
2 + en las células puede estimular tanto la producción de especies reactivas del oxígeno y de la muerte celular necrótica [24]. Medimos los efectos de englerin A en intracelular de Ca
2 + concentraciones utilizando el indicador de calcio Fluo-3. Este colorante nos permitió cuantificar la cantidad de iones de calcio intracelular después del tratamiento con englerin A (Fig. 5
B Opiniones). La relación Ca
2 + concentración no cambió cuando se incubaron células SF-295 con englerin A. ionomicina, un conocido inductor de Ca
2 + afluencia en la célula, se duplicaron los iones medidos [37]. El tratamiento de la A-498 células de cáncer renal con englerin un aumento significativo del calcio intracelular en un grado aún más alto que ionomicina. Mientras ionomicina se duplicó la cantidad de calcio intracelular, englerin A dio como resultado 4 veces mayores concentraciones.
Discusión
El aumento de la incidencia de tumores renales en todo el mundo presenta un grave problema [1], [ ,,,0],38]. Para los pacientes con tumores renales en etapas avanzadas, agentes quimioterapéuticos eficaces son escasos y de uso común drogas como sunitinib se han asociado con efectos secundarios graves [9]. La búsqueda de nuevos agentes terapéuticos, por tanto, tiene que estar centrado en tratamientos que no sólo son eficaces en la lucha contra los tumores, pero también lo suficientemente específico para no dañar las células no tumorales y para evitar efectos secundarios adversos. El producto natural englerin A es un compuesto que potencialmente se ajusta a estos criterios. Su alta selectividad y potencia contra las células de cáncer renal pusieron en el centro de muchos grupos de investigación. Sin embargo, poco se sabe acerca de su modo de acción, además de la orientación de estas células con una alta especificidad [10]. Con el fin de evaluar completamente el uso de englerin A como un agente terapéutico y de prever posibles efectos secundarios, es necesario comprender el mecanismo por el cual el compuesto afecta a las células de cáncer renal.
A continuación se muestra por primera vez cómo englerin Un mata a las células de cáncer renal. Es importante destacar que, también informan de que englerin A es de hecho específico para células renales cancerosas y no afecta a las células normales del riñón. En cuanto al modo de acción, se encontró que englerin A induce una forma necrótico de la muerte celular en las células sensibles. marcadores de apoptosis como la externalización de fosfatidilserina, la activación de la caspasa efectora o PARP división no son regulados hasta después del tratamiento con englerin A. permeabilización de la membrana de plasma se produce rápidamente y las células no forman cuerpos apoptóticos. Al mismo tiempo los niveles de autofagia no se ven afectados por el tratamiento y no parece compuesto para inducir procesos pyroptosis similar. Sin embargo, el modo de muerte celular incluye un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno y el aumento de los niveles de iones de calcio intracelulares ya sea como parte de la señalización necrótico o resultado de la misma.
La potencia de un compuesto es una medida importante de su calificación como una droga. La mitad de las concentraciones inhibitorias máximas (CI
50) en el rango nanomolar o inferior son deseables.